Vi præsenterer en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, og dens gennemførelse at sonde celle mekanik uden perler i Drosophila embryo.
Morfogenese kræver koordinering mellem genetiske mønstre og mekaniske kræfter håndfast forme celler og væv. Derfor er en udfordring at forstå morfogenetiske processer direkte måle cellulære styrker og mekaniske egenskaber i vivo under embryogenese. Vi præsenterer her, en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, som tillader direkte anvende styrker på celle-celle kontakter af den tidlige Drosophila embryo, mens imaging med en hastighed på flere billeder per sekund. Denne teknik har den fordel, at det ikke kræver indsprøjtning af perler i embryo, normalt bruges som mellemliggende sonder som optisk styrker er udøvet. Vi detaljeret trin for trin gennemførelsen af opsætningen, og foreslå værktøjer til at udtrække mekaniske oplysninger fra forsøgene. Ved at overvåge fordrivelse af celle-celle kontakter i realtid, kan man udføre spænding målinger og undersøge celle kontaktpersoners reologi.
Fosterudviklingen er en yderst reproducerbar proces hvor celler og væv deformere for at forme det fremtidige dyr. Disse deformationer har vist sig at kræve den aktive generation af styrker på celle niveau1,2. For at forstå morfogenetiske processer, hvorunder celler og væv ændre deres form, er det derfor nøglen til at vurdere de mekaniske egenskaber af celler involveret og måle kræfter i vævet under processen3,4 . Epitel lag, især i Drosophila, er blevet meget studeret deres kvasi-2D-geometri og deres let manipulation.
En række teknikker har således udviklet af os og andre til at vurdere epitelial mekanik i vivo under udvikling. Vi vil give et hurtigt overblik over de tre vigtigste teknikker, der anvendes i epitel væv. Laser ablation, en meget udbredt metode, giver mulighed for at afsløre den lokale mekanisk stress på celle vejkryds5,6,7,8 eller større skala9,10,11 ved at udføre lokale nedskæringer, der forstyrrer den mekaniske integritet af målet. Dynamikken i åbningen efter snittet giver oplysninger både om stress forudgående ablation og på reologi væv12,13. En ulempe ved laser ablation er, at det er invasive, da det kræver de lokale forstyrrelser af celle cortex. Derfor kan man kun udføre et begrænset antal ablations hvis man ønsker at bevare vævet intakt. En anden ulempe er, at ablations kun give relative skøn af spænding i celle kontakter, idet den indledende hastighed er afhængig af tyktflydende friktion, som ikke er kendt. Magnetiske manipulation er også blevet udviklet og anvendt i Drosophila, der involverer enten brugen af ferrofluids14 eller ultramagnetic Liposomer15. De kan give absolutte målinger16,17, men er også invasive i den forstand, at de kræver indsprøjtning af sonder på den ønskede placering. Dette kan være meget vanskelig afhængigt af systemet, som ikke altid er indstillet til præcise injektioner. En tredje teknik, fuldstændig ikke-invasiv, er kraft inferens18,19,20. Kraft inferens bygger på en antagelse om mekanisk ligevægt på triple point (tricellular vejkryds eller vertices), og gør det muligt for at udlede spændinger på alle celle-celle kontakter (og eventuelt pres i alle celler) ved at løse en invers problem. For spændinger giver hver vertex to ligninger (X og Y). Dette giver et stort system af lineære ligninger, som kan vendes på visse betingelser at vurdere spænding på alle celle kontakter. Mens denne metode er meget attraktiv, da det kun kræver en segmenteret billede og ingen ekstra eksperiment eller setup, dets nøjagtighed er endnu til at bestemme, og igen det kun indeholder relative værdier, medmindre en absolut kalibrering måling udføres.
For at overvinde nogle af disse begrænsninger, vi indfører i denne artikel en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop til at anvende kontrollerede styrker på celle skala i Drosophila melanogasterembryonale epitel. Optisk pincet har været brugt til mange biologiske applikationer herunder målinger på enkelt proteiner og manipulation af organeller og celler21. Her rapporterer vi anvendte kræfter i rækken af et par dusin pN, som er små endnu tilstrækkelig til at fremkalde lokale deformationer af celle kontakter og udføre mekaniske målinger i vivo. Vi bruger typisk vinkelrette afbøjning af celle kontakter, overvåget gennem en analyse af kymographs, skal vedrøre deformation kraft. Vigtigere, kræver vores setup ikke indsprøjtning af perler på den ønskede placering i væv, som Optisk pincet er i stand til direkte lægge kræfter på celle-celle kontakter. Kobling af den optiske pincet til en lys ark mikroskop gør det muligt at udføre hurtige imaging (flere billeder pr. sekund), som er meget mærkbar for en mekanisk analyse på kort tidsskalaer, og med reducerede fototoksicitet, siden belysningen af den prøven er begrænset til flyet i imaging22.
Samlede, Optisk pincet er en non-invasiv måde at anvende kontrollerede styrker på celle kontakter in vivo i Drosophila embryo og udtrække mekaniske oplysninger såsom stivhed og spænding i celle kontakter23, rheologiske egenskaber 24, og gradueringsfyld eller anisotropy spænding23.
Optisk pincet gør det muligt for at udføre absolutte mekaniske målinger direkte i det udviklende embryonale epitel i en ikke-invasiv måde. I henseende præsenterer det fordele frem for andre metoder såsom laser ablation, som er invasive og giver relativ målinger, magnetiske kræfter, som kræver injektioner, eller tvinge inferens, som bygger på stærke antagelser og også give relative målinger.
Protokollen indeholder et par kritiske trin. Først, da formålet objektivet kan vise kroma…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (til P.-F.L.). Vi erkender Frankrig-BioImaging infrastruktur støttet af det franske nationale forskning agentur (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringer for fremtiden»). Vi takker Brice Detailleur og Claude Moretti fra PICSL-FBI infrastruktur for teknisk bistand.
Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |