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Behavior

アルツハイマー病、IntelliCage を使用しての複数の遺伝モデルにおける認知機能の長期的な行動のアッセイの自動化

doi: 10.3791/58009 Published: August 4, 2018

Summary

本稿では、オペラント条件づけと自動化されたハイスループットの行動監視システム IntelliCage システムを使用して、アルツハイマー病の遺伝的モデルの認知評価のためのプロトコルについて説明します。

Abstract

複数の要因-加齢や遺伝子など、認知機能の低下に頻繁に関連付けられています。アルツハイマー病 (AD) などの認知機能低下の遺伝子組み換えマウス モデル根本的なメカニズムの解明し、治療の進歩を促進するために有望なツールとなっています。広告は、認知機能の低下の場合、モデルで予想される行動異常の解析検証に重要なステップです。研究者から需要の実質的な努力を高齢化の影響を検討する実験動物の長期行動調査。IntelliCage システムは、毎日の人間の処理の必要性を排除するマウス用高スループットとコスト効果の高いテスト電池です。ここで述べる遺伝的アルツハイマー病モデルの長期的な表現でのシステムの利用方法具体的な認知機能に焦点を当てします。実験では、空間的な学習機能と執行機能を評価するテストの繰り返しバッテリを採用しています。この費用対効果の年齢依存した表現型解析はさまざまな認知的側面に関する遺伝子の一時的/恒久的な影響を確認することができます。

Introduction

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過去 10 年間以上神経疾患モデル動物の開発は、その根拠と治療の進歩1,2,3を促進するために機構についての理解を提供しています。遺伝的動物モデルで高スループットの行動テスト バッテリーのアプリケーションは、人間の病気のメカニズムと薬物療法の識別を検討する研究ツールです。研究テスト バッテリー適合高齢者の長期観察のためおよび/または認知症モデルに専門人材と時間の偉大な量を消費する所あります伝統的。ホーム ケージ監視システムは、人間が行動観察のコストを減らすだろうとコスト効果の高い戦略になります。いくつかの研究チームは、ホーム ケージ4,5,6の単一の個々 の行動表現型解析を支援するビジョン ベースの自動化ツールを開発しました。ただし、このようなメソッドは、社会的相互作用、テスト環境のサイズおよびさまざまな認知機能を含む行動対策を制限します。IntelliCage は、ソーシャル ホーム ケージで様々 な認知タスクを実行するように設計第二世代ホーム ケージ監視システムです。重要なは、このメソッドは、毎日できる認知機能の評価と長期行動監視を実行する私たちの処理をなくすことができ、それ専門の実用的な処理のための要件を排除でき、再現性の高いを有効にします。データ集録7。ここでは、長期的に述べる表現型解析と検証されているアルツハイマー病 (AD) の遺伝的マウスモデルで最近自動ホーム ケージの監視機能を使用して8,9,10に生成されます。システム。空間的な学習機能と執行機能の評価を含んだテスト バッテリーを複数の年齢ポイント (9-12、14-17 ヶ月) で繰り返し行った。この年齢依存した表現では、さまざまな認知的側面に関する遺伝子の一時的/恒久的なエフェクトを識別することができました。いくつかの広告のモデルが自動ホーム ケージ システム監視10を使用して長期的な分析でテストいくつかの認知的側面の非定常かつ恒久的な表現型を示したことが分かった。したがって、ホーム ケージ監視システムを使用して自動化された研究は有益であり、長期的な行動表現型解析と高次脳機能障害の様々 なモデルでの検証のため費用対効果。

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Protocol

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手順は、動物によって承認されたすべては、ケア、委員会を使用して彼らは動物実験のため、理化学研究所脳科学総合研究センターのガイドラインに従って行われました。

1. 設定装置

注: 自動化されたホーム ケージ監視システムの概要については、図 1に示すです。各システム (39 cm × 58 cm × 21 cm) 1 つのマイクロプロセッサとそれぞれが 2 つの水のボトルと動物 (図 1 a) に移植したトランスポンダーの電波干渉を検出するためのリング アンテナ 4 つのコーナーの部屋が含まれています。マイクロプロセッサの id 番号は、ロータリーセレクター (ハードウェア アドレス) によって定義される (図 1 b)。マイクロプロセッサの id 番号が重複しないようにします。各コーナーの 2 つのドアは、オペラント条件づけ (図 1) に使用される、コンピューターによって制御されます。通常、各ケージは、最大 12 のマウス (集合住宅の例として、図 2を参照) を評価できます。マウスの大きい数を使用可能です。しかし、1 つはマウスの戦いは過度に、彼らは、強く競争力のあるタスクを実行するときにない過密が確認してください。

  1. ケージを連続することができますケーブル経由でコンピューターに接続します。
  2. (電源オン) マイクロプロセッサでプラグにバッテリー ケーブルを接続します。すべての Led を切り替えて数秒間、すべてのドアに移動する必要があります。外し電源を replug Led オフにしないでくださいまたはドアが移動しない場合は、(悪い電気的接続は、不適切な機能につながる可能性があります)。
  3. スライドドアを開く正常に終了ことを確認します。ドアが正しく動かない場合は、黒のアームに接続されている小さな磁石を確認してください。この問題が頻繁に発生する場合は、腕に磁石を接着することを検討してください。
  4. (一日一回、少なくとも) 実験中ドアの条件をチェックし続けます。
  5. PC をオンにします。

2. ソフトウェア

注: 自動化されたホーム ケージ監視システムのためのソフトウェア (「デザイナー」、「コント ローラー」と「アナライザー」) のすべての 3 つのコンポーネントは、グラフィカル ユーザー インターフェイス (図 3) として設計されています。ユーザーは簡単に制御または実験中に様々 な機能を追加できます。

  1. 「デザイナー」を使用して作る実験ファイル
    注:「デザイナー」は、実験ファイル (システム プログラム) 様々 な実験的プロトコルを実行するためのテスト システム (図 3 a) のステータスを生成および編集されます。動物の一覧、ハードウェアの設定、および複数の実験的プロトコル 1 つ実験ファイルを埋め込みます。ユーザーは、著者に連絡してもジャーナルのプロトコルを取得できます。
    1. 動物のリストを作成します。
      1. 条件を定義します。次のパラメーターが含まれています実験のグランド デザインを構築: 1) マウス、2) の遺伝子のライン (または治療グループ) の数の数 3) 性別 (オス、メスまたはその両方)、および 4) ケージの数使用されます。
      2. 中心的なツール バーで適切なトランスポンダー型 (DataMars または Trovan) を選択します。
      3. 「グループ」を設定します。「グループ」パネルで追加または削除実験グループ (すなわち。、遺伝子型や治療)「緑のプラス (+)」または「グループ」ウィンドウで「赤十字 (x)」ボタンをそれぞれ押すことによって。
      4. 「クラスター」を設定します。正しい、正しくない、中立的なコーナーと側面を定義することによって均等にサブグループを動作するように「クラスター」機能を使用します。
        注: 訪問、nosepoke、およびリック イベント、行動タスク、メイン データすべて定義に関連付けられています。この設定は、空間学習タスクに必要です。各動物のために定義されたクラスターは、実験では同じままです。たとえば、場所選好 (PP) タスクまたは場所選好逆転 (PPR) の 1 つのクラスターで 1 つのコーナーは、(水アクセス) 正しいとして定義し、3 つのコーナーは (水-アクセス不可) が正しく定義されています。また、クラスターは、「リンク」機能を使用して別の 1 つにリンクできます。
      5. 「名前」、「タグ」(トランスポンダーの ID)、「セックス」、「グループ」、および「クラスター」を含む変数を割り当てます。
      6. 保存し、別の実験の動物のリストを複製する「ファイル」メニュー バーで..."エクスポート"... と"輸入動物動物"を選択して動物のリストを貼り付けます。
    2. 「セットアップ」タブ対応アドレスの実際の数に"デザイナー"セクション内のアドレスの数に対応する ID 番号 (ハードウェア アドレス) を使用して、すべてのシステムを「セットアップ」タブ設定でハードウェアを設定します。
    3. 「IntelliCage」タブで実験的プロトコルをを構築します。
      1. 次頭と下のタブ (「モジュール」と「オプション」タブ) を使用して、"IntelliCage"タブで実験的プロトコルを構築します。
      2. 「モジュール」タブ (図 3 a) をクリックしてして「モジュールの容量」で実験的構造をデザインします。新しいモジュールを追加するには、"Add"(グリーン プラス「モジュール」タブのボタン) を押します。
        注意: コンポーネント、すなわち「タスク」、「ユーティリティ」、「記者」と「イベント」の 4 種類があります。通常、実験は、トリガー イベント、すなわち「訪問」、「Nosepoke」または「飲酒」で始まります。トリガー イベントを選択、開始記号を定義するイベント セクションから対応するユニットをドラッグします。その後、(ドア枠) など特定のアクチュエータの出力を設定するのには単位を「タスク」セクションからドラッグ (e.g。「ドア」、「LED」、「航空」)。
      3. モジュール「空間」に「ユニット」部分に示すユニットをドラッグします。
        注: 再度、ユーザーは、著者から (実験ファイル) として公開されているプロトコルを取得し、新しい動物リストをインポートして、ファイルを再利用できます。ユーザーは、すべてのモジュールを作る必要はありません。
      4. Nosepoke 適応 (NPA) モジュール (図 6 a) をするためには、「モジュールの容量」に「タスク」セクション、「ユーティリティ」セクションから「ゲート」と「タイマー」単位、「イベント」セクションから「訪問」と「Nosepke」のユニットから"ドア"ユニットをドラッグします。
      5. ゲート単位で「の」Nosepoke ユニットの"ON"の行に"Any"をリンクします。「ゲート」単位"Out"「閉じる」にリンクします。「タイマー」単位"Out"「アクティブ」に「ゲート」リンクします。"Out"「ドア」単位で開くゲート内のリンクします。「ドア」単位「閉じる」に「タイマー」単位"Out"リンクします。タイマーで 5,000 (ms) として「期間」を設定します。
        注:「ゲート」ユニットは、入出力のシーケンスの出力を制御する使用されます。「オープン」の状態 (既定の状態)、「出力」に接続されているシーケンスが運営されます。これに対し、「閉じる」の状態で出力に接続されているシーケンスを停止します。オープニング レートの確率をすることができます (図 6 a図 8 a図 9 a) を指定します。「モジュール セレクター」を使用して、同じ実験期間中にランダムにまたは特定の順序でモジュールを変更します。シリアル反応時間 (SRT) タスクではたとえば、(可変遅延の長さ) のモジュールがランダムに切り替え「訪問」ユニット (図 8 aの"END"行にリンクされているモジュール セレクター ("RandomExcludeDefault"モードを設定する) を使用して訪問の各端に).「スプリッター」ユニットは、コーナーの指定された側に入力信号を直接に使用されます。これは、特定の側の操作を必要とする SRT または遅延割引 (DD) のタスクで使用されるようなより複雑なモジュールに必要です。たとえば、DD タスクで 1 つだけ (甘く側) が遅延 (図 9 a) で開かれます。
      6. PP または PPR のタスクの典型的な初期状態と非飲酒セッションで終了するすべてのドアを「オプション」タブの指定でケージの中でドアの初期ステータスを定義します。
      7. 「オプション」タブでタイム スケジュールを設定します。特定の時点での変更は、モジュールと「日パターン」ウィンドウで定義されているアクションを実施。
        注:「日パターン」の部分は、実験タイム ウィンドウを設定するのには使用できます。通常、夜の時間、マウスの活動期は、認知課題における行動を評価するために使用されます。これは、タスクの期間に影響を与える水の摂取量に注目する必要があります。比較的簡単なタスクで長い期間の場合は、タイム ウィンドウの終了のパフォーマンス満足度により減少します。したがって、時間帯は注意して設定する必要があります。
  2. 「コント ローラー」を使用してテストを実行
    1. 「実験」を押すことによって実験ファイルを読み込む「コント ローラー」の「設定」セクションのボタン。
    2. 実験を実行するには、「コント ローラー」(中央右部) の「スタート」ボタンを押します。
    3. 監視し、システムと、マウスの現在の状態を可視化します。
      注: 行動のイベントは次のように説明した: (熱センサーによって検出される); コーナーへの訪問(赤外線ビームによって検出および左と右の nosepoke に分けることができます) のコーナーの中の穴に鼻を入れて nosepokeなめる、なめる lickometer (接触時間と周波数としてカウントされます) によって検出されました。
    4. 注意事項に特に注意を払って、システムの状態を入念にチェックします。
      警告: 不適切な動物タグ (トランスポンダー番号) によるエラーがログに報告される、実際のタグの番号が正しい場合でも (すなわち。、「未登録のタグ * * *"、"アンテナ登録なし存在信号"など。)。切れることを約あるトランスポンダーを使用可能性があります。ただし、このエラーは深刻な問題ではありません。この場合は、1 つ必要がありますメッセージで特定された動物を検出できることを再確認してください。たとえば、訪問やドリンクなしの長い期間のためエラーが表示されます"* * * (動物 ID) 最後の 720 分間の訪問をしていない」(図 3 b)。このようなエラーにつながる可能性がありますいくつかの可能性を慎重に確認します。最も深刻な場合、動物は既に死んでいます。第二に、最も深刻な可能性は、(トランスポンダーが動作していない、または抜けている) 動物の検出システムに問題があることです。3 番目の可能性は、動物がアクティブなだけではないということです。動物に全体の 24 時間の期間のための訪問していない場合、実験者はその健康状態によりケージから動物を削除する検討してください。エラー表示されていない深刻な問題は (ほとんど常にドアに磁石の問題) のためにドアの障害です。これは、結果、不適切な飲酒コーナーの作成。この問題をチェック、非飲酒セッション日に少なくとも 1 回の間にすべてのドアの条件をチェックしなければなりません。この問題があるときに取得したデータは、PP、PPR、SRT または DD のタスク分析のため使用できません。
    5. 「コント ローラー」(図 3 b) の「停止」ボタンを押すことによって時間と動物情報タグを持つすべての行動イベントを出力します。
  3. 「アナライザー」を使用したデータの処理
    1. 「アナライザー」を使用して分析し、データを可視化します。
    2. Excel ファイル (図 3) として時間ビン分割データをエクスポートします。「グラフ」タブに表示されるグラフィカルな結果データを理解するいただくことができます。「データ」タブのデータは複数の列に配置されますと並べ替えることができます、任意のパラメーターを使用してフィルターされます。

3. 動物の準備

  1. 動物 15 g 以上 (2 ヶ月齢以上) を使用します。
    注: 動物は 15 g より小さい場合、複数のマウスをご覧くださいコーナー同時にデータ収集の障害に 。高齢の動物を慎重に監視してコーナーに飛び込むし、フィーダーを登ることができることを確認ください。水や食べ物にアクセスすることはできませんので、いくつかの古いマウスや運動障害を示す遺伝的変異を持つマウスが死ぬかもしれない。
  2. 攻撃の潜在的なリスクを減らします。
    注: 雌マウスを使用する場合でも、実験を開始する前に (すなわち、1 ヶ月の年齢で) 若い年齢でケージに一緒にすべてのマウスを住宅を始めた方が。ケージで雄マウスを使用する場合特に攻撃性に関して、マウス ラインのプロファイルを取得必要があります。
  3. イソフルレン吸入麻酔 (図 4) 背頸部でマウスに皮下インプラントの高周波識別トランスポンダー (滅菌、針が含まれて).
    1. 麻酔導入のために部屋にマウスを配置します。
    2. 2.5% に 2.0 1.5 L/min とイソフルラン気化器、0.8 に酸素流量を調整します。
    3. 呼吸数が低下したら誘導室からマウス ボタンを離します (約 5% ドロップ)。
    4. フェイス マスクで麻酔を維持します。
    5. 目の乾燥を防ぐために目に眼軟膏を適用します。
    6. ピンチ、ポケットを作成する肩甲骨の後部の周りの皮膚を持ち上げます。
    7. 髪の皮下組織への導入を最小限に抑えるための 70% エタノールを注射部位を消します。その後、背骨に平行の皮膚から注射針を挿入します。
    8. 皮下にマイクロ チップを取り出します。
    9. それに肩甲骨間のスペースを維持する皮膚を通してマイクロ チップをつまみます。
    10. ゆっくりと針を撤回します。止血を提供するために、数秒のための領域をピンチに進みます。
    11. 針が正しく挿入されていない場合は、事後管理の痛みの軽減を使用します。
    12. 麻酔からマウスボタンを放します。
    13. 回復ケージの中にマウスを置くし、彼らは目を覚ます、周りに移動するまで、それを監視します。マウスを放置しないでください。
    14. それは完全に歩行になるとマウスを家のケージに戻ります。
    15. 少なくとも 1 週をトランスポンダー リーダーと注入されたトランスポンダーをチェックします。
      警告: 注入のトランスポンダーの位置は識別のため不可欠 (図 2参照)。差し込まないでトランスポンダー垂直首;動物は動物の脊髄の深刻な傷害を受け取る、これがあります。トランスポンダーは時々 いくつかの数時間または数日後に落ちる。トランスポンダーがトランスポンダーのリーダーを使用して動作しているを確認します。オプション、それが抜ける; 場合、トランスポンダーを再びインプラントただし、繰り返しの再インプラント人工の行動の変化を引き起こす可能性があります。有効期限の日付を確認します。期限切れのトランスポンダーはよくそのデータの行方不明の結果不適切な信号を送信します。
  4. ケージに動物を紹介し、トランスポンダーの読者を使用してマウスに注入したトランスポンダーを確認します。トランスポンダーが検出されない場合は、マウスを削除します。

4. 走行実験します。

注: マウスは標準的なマウスの食事と自由を供給され、タスクのスケジュールに応じて 1 または 2 週間ごとに変更、合成の寝具と維持します。特に最初の 1-2 日空間学習タスク中に寝具を変更しないでください。ライトは、8:00 と 20:00 の間であります。実験的なモジュールは、科学的な質問によると順番に実行されます。実験のスケジュールを図 5に示します。

  1. 一般的な活動
    注: マウス、順番に 3 つの実験条件を使用して檻の中で環境に適応: 動物アクセスできる場所常にコーナーで水のボトル自由に無料の適応 (慣れの 1 週間に 1 日は通常と見なされます十分な);警察庁、マウスが 5 の水のボトルをアクセスすることができますコーナー (慣れは十分な通常ある 1 週間に 3 日) でドアの前に穴にすべての nosepoke の後の s飲んでセッション適応、マウスが一日の特定の時間に水のボトルをアクセスできます。
    1. FA、警察庁および DSA タスクの実験ファイルを準備します。
    2. 「コント ローラー」の FA タスクを実行します。
    3. 訪問、nosepokes および/または一般的な活動の指標として定期的に舐めているエピソード毎日または概日活動の数を測定します。
    4. 「コント ローラー」で警察庁タスクを実行します。
    5. 「コント ローラー」の DSA タスクを実行します。
      注: 多くの学習のパラダイム飲み会の適応が必要です。DSA のタイム スケジュールを設定するには、2 つの実験モジュールを使用: (水剥奪) の既定のセッションとおよび飲み会。何も起こりません後既定のモジュールの nosepoke マウスは、水のボトルにアクセスできません。飲み会は、警察庁のモジュールと同じです。「デザイナー」で「オプション」タブで定義されているタイム スケジュールを別のモジュールで定義されている非飲酒セッションにシフトできます。
  2. 空間的な学習および記憶課題
    メモ: PP 作業空間 (通常 5-7 日間) の学習を評価するために使用されます。PP タスク、マウスは 3 のうち 4 コーナー (1 つの正しい角と 3 つの誤ったコーナー) で水へのアクセスを限られています。したがって、動物は、飲み会中に水を飲むことのある特定のコーナーを訪問するでしょう。PPR タスクを使用して、柔軟性や compulsivity と流暢に (通常 5-7 日) の動作を変更する能力を評価します。PPR の作業でマウスは PP タスクの正しいコーナーとして使用される反対のコーナーで水をのみアクセスできます。
    1. PP と PPR のタスクに実験ファイルを準備します。「デザイナー」の「動物」タブで「クラスター」(通常 1-4 のコーナーはそれぞれ) を設定することにより、マウスの正しいコーナーを定義 (図 6A参照、下)。1 つのコーナーで渋滞を避けるためには、すべてのマウスに一様に 4 つのコーナーを割り当てます。
    2. コント ローラーで PP タスクを実行します。
    3. 時間コース、数字、および正しい nosepokes の割合で空間の学習パフォーマンスを評価します。
      注: PP タスクの現在のバージョンに焦点を当てより空間ではなく、空間記憶学習タスクは別の試験間の時間ギャップを必要としません。空間記憶に重点を置く、場所の回避 (PA) タスクまたは試験の間の特定の時間ギャップを利用して空間的タスクの未定義の新しいバージョンを使用することを検討してください。
    4. 「コント ローラー」の PPR タスクを実行します。
    5. 柔軟性、compulsivity 時間コース、番号、および正しい nosepokes の割合に基づいて評価します。
      注: PPR データの解釈には、いくつかの慎重な判断が必要です。PPR タスクの初期性能は PP タスクの性能に強く依存します。これは、PPR タスクが干渉または動作を変更する必要性に依存するためです。したがって、PP タスクのパフォーマンスが 100% に近い場合、PPR のパフォーマンスを特に貧しい人々 にすることができます。柔軟性は、業務執行機能11,12,13の 1 つ考えることが。
    6. PA の空間恐怖記憶を評価します。
      注: PA のタスクで構成されます 4 連続セッション: 慣れ (1 日目);エアコン (定義済みコーナー [不適切な nosepoke] の任意の辺に nospoke 後空気のパフを導入 2 日目);(マウスは、通常の家のケージ、3 日目に戻って配置) テスト ケージ; 外 24 h 休憩空気のパフ (日 4-10) することがなくテストのケージにマウスを配置します。
      1. ペンシルバニア州の実験ファイルを準備します。
      2. 慣れ (1 日目) を実行します。
      3. エアコン (2 日目) を実行します。
      4. 通常ホーム ケージにマウスを取るし、24 h (3 日目) の維持します。
      5. テストのケージに戻ってマウスを取るし、テスト プロトコル (日 4-10) を実行します。
      6. 嫌悪の空間学習ご利用いただけます日 (2 日目) に不正な nosepokes の比率に基づいて、テストのケージ (3 日目) への復帰の日に基づいて嫌悪の空間記憶を評価し、絶滅の学習に基づいて日 4-10。
  3. エグゼクティブ関数 (衝動性、注意、および Compulsivity) の評価
    1. SRT タスク
      注: この手順以前詳細詳細10,14説明だった。この一連のタスクでは、すべての 4 つのコーナーは 1 日 24 時間、同じ方法で運営しています。SRT は、2 つのトレーニング セッションで構成されています (SRT 訓練 1 および 2) および 2 つのテスト セッション (SRT テスト 1 と 2)。最初のトレーニング セッション (SRT 訓練 1)、動物を訓練して、黄色の LED ライトに nosepoke のスタート信号であることを学ぶ。LED ライトは常に、初期の nosepoke の直後にフラッシュ (遅延は 0 に設定 s)。
      2 番目のトレーニング セッション (SRT 訓練 2) で遅延を 0.5、1.0、2.0、4.0 の間でランダムに変化する設定は s。この期間中に早期応答結果 (事前研修) があります。遅延期間中に任意の nosepoke がドアを開いたときの最初の nosepoke 中の早期応答と見なされます (5 s) 正しい応答であります。最初のテスト セッション (SRT テスト 1、衝動性を評価するために使用) では、最初の nosepoke が正しい側を定義し、遅延期間を開始する (0.5 – 4.0 タスク フェーズに応じて、s) 後に、特定の期間に対して黄色の Led をオンにする (刺激時間を延長 =2.0 s タスク フェーズに応じて)。その扉を開きます。遅延期間は、ドアを開いた後、最初の nosepoke (5 s) され、遅延期間中に任意の nosepoke は時期尚早 nosepoke と見なされます正しい nosepoke としてカウントされます。2 番目のテスト セッション (SRT テスト 2、注意を評価するために使用) にいくつかの変更があります。刺激を開始した後 (0.2 – 1.0 s、最初のテストよりわずかに短い)、マウスは、nosepokes を許可する期間を提供して (限られた保持、通常 2 s)。ドアが開いて (5 s) 限られた保留中最初の nosepoke 正しい nosepoke した後にのみです。Nosepokes として限られた保持を考慮した nosepoke を省略すると、結果の変化につながらない。エラーは 3 つのタイプに分けられる: 省略、省略 nosepoke 時期尚早 nosepoke (最初 nosepoke のみ)。注目のテストには、LED フラッシュ (刺激時間を延長の期間によって定義された) として適度クイック応答 (限られた保持の期間によって定義されます) をお知らせする機能が必要です。裁判の経過を図 7に示します。
      1. SRT タスクの実験ファイルを準備します。
      2. 3 日間の SRT 訓練 1 を実行します。
      3. 7 日間の SRT 訓練 2 を実行します。
      4. 7 日間の SRT テスト 1 (衝動) を実行します。次の数式に基づく衝動性を計算します。
        Equation 1
        P は時期尚早 nosepoke 試験の数 (または不正な nosepoke の数)、T は合計試験 (最初 nosepoke の数) の数。
      5. 7 日間の SRT テスト 2 (注意) を実行します。(注意のための業績評価指標とされる) 精度を計算する次の数式を使用して。
        Equation 2
        C は、正しい nosepoke 試験 (正しい第 2 nosepokes の数) の数、T は合計試験 (最初 nosepokes の数) の数、O は漏れ試験 (試験 2 番目 nosepoke を行方不明の数) の数、P は時期尚早の数nosepoke 試験 (または限られた保持する前に 2 番目の不正な nosepoke の数)。
    2. DD タスク
      注: これは動物が遅延で待つ (SW、0.5% サッカリンまたは 10% ショ糖) 甘くされた水を飲むこと、または遅延なしの普通の水を飲むことを選択簡単な選択タスクです。反対側のドアが閉じたまま選ばれた側のドアが開きます。SW と通常の水は、同じすべてのコーナーの左右両側に割り当てられます。DD のタスクのスケジュールには、トレーニング データセットとテスト セッションが含まれています。トレーニング セッションでマウスは、SW と水待機時間なしにアクセスできます。このように、マウスは南西側に自分の好みを開発します。毎日テスト セッションで増加する待機時間 (すなわち。 0、1、2、...、8 s)。遅延順次増毎日異なる遅延時間を示す複数のモジュール (0, 1, 2,..., 8 s)「モジュール」および「オプション」領域 (日パターン) の"リンク"の設定と。このタスクは、すべての 4 つのコーナーは同じように、1 日あたり 24 時間で動作します。
      1. DD タスクの実験ファイルを準備します。
      2. SW (すべてのコーナーで右または左サイド) の側面を定義します。
      3. 定義の側面で水のボトルを置き換えますを含むボトル南西
      4. 5-7 日間の遅延なしで定義された側面でドリンク SW に動物を訓練するトレーニング セッションを実行します。
      5. 舐めやリックや nosepokes の合計数に SW の側で nosepoking の比として定義される優先インデックスを計算します。として計算従って含んでいる SW 側の選好インデックス:
        Equation 3
        または
        Equation 4
        以前のインデックスは、後者に焦点を当てより選択行動中のアクションの結果の詳細を当てください。
        注: ほとんどのマウスが優先的に SW の側面を選択ことを確認 (> 舐めている数ベースのインデックスの 90% > 最初の nosepoke ベースのインデックスの 80%)、トレーニングの終わりに。
      6. その後、9 日間 (遅延 0 に 8 s) DD タスクのテスト セッションを実行します。
      7. Compulsivity の評価に SW が付いている側面に向かって好みの変化の経過を評価します。
  4. データ分析
    1. 「アナライザー」を使用してアーカイブを開きすべてデータを Excel ファイルにエクスポートします。データ量の量が非常に大きい場合、データをフィルターするましだ (すなわち。 空間タスクの飲み会を抽出し、SRT タスクの最初と 2 番目の nosepokes を抽出) です。

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Representative Results

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以前の研究では、広告モデルの年齢依存性の認知障害は自動化されたホーム ケージ システム監視10を用いた実験により検出されました。PP の広告モデルの彼らのパフォーマンスは若年成人と高齢者; の両方でそのままだったただし、PPR のパフォーマンスだった大幅と徐々 に障害 (図 6)。また、そのような特徴は15認知に影響を与えるので適応段階で全般的な動作や不安を観察することが重要です。広告モデルは総異常を FA、NP と DSA のセッションで訪問、nosepoke、舐めている数字で表示されませんでした。したがって、広告モデルは、柔軟性が低いかもしれません。

遂行機能を評価するには、SRT と DD で行動のパフォーマンスを記録しました。古い広告モデル (NL-G-F) は、SRT (SRT テスト 2) (図 8) の最後の段階で精度を欠いていた。簡易 compulsivity 若い大人および NL G F マウスの旧科目で観察された (図 9 bトップ)。興味深いことに、古い時代の若い大人をした NL F マウスの compulsivity の増加があった、それなった野生型マウス (図 9 b下) に匹敵します。これは NL F 突然変異の一時的な表現型の例です。

Figure 1
図 1: ホーム ケージ モニタリング システムのコンポーネント。(A) システムの概要。(B) コネクタの位置。(C) コーナーはオペラント ドアの商工会議所します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 研究のための集合住宅の例です。通常、ケージごと 12 マウスが使用されます。4 つのグループ (1 つの野生型と 3 つ遺伝モデル) を使用して、場合 IntelliCage ごとグループごとの 3 つのマウスが適切と見なされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: システムのためのソフトウェア。(A)「デザイナー」を実験ファイルのビルドに使用します。左: 動物のリスト部分には、動物およびグループの定義の情報が含まれています。右: モジュール領域は、実験的操作を定義する使用されます。(B)「コント ローラー」は、実行、モニター、およびレコードの実験に使用できます。左: nosepoke、動物の訪問を表示する 4 つのコーナーで舐めているとケージの 1 つの状態です。右: いくつかのトラブルが発生した場合、アラーム ウィンドウが表示されます。(C) アナライザーは、処理およびコント ローラーによって取得したデータをエクスポートする使用できます。左: すべてのデータは、動物、環境、ケージと時間の情報がタグ付けされます。フィルターさらに Excel または他の分析ソフトウェアで分析に役立つでしょう。右: のタイムライン (また nosepoke かなめ) の訪問が個別に表示することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: トランスポンダー注入。トランスポンダー (DataMars) の (A) マイクロ チップ。(B) 側は、トランスポンダー注入 (transpondering) の表示します。脊髄に原因の損傷を避けるため。(C) トランスポンダーの平面図です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 自動化されたホーム ケージ監視システム認知評価のための実験の時間線。認知的評価のためのテスト バッテリーを 2 回施行した (第 1 セット、9-12 ヶ月; 第 2 セット、14-17 ヶ月) 最後の活動を評価するための実験が続く (3 セット [18 ヶ])。このバッテリーは複数の認知ドメインを評価するために指定された (色によって示される-レッド: 一般的な活動;青: 空間的な学習および記憶;緑: エグゼクティブ関数)、検証と予想される認知障害の特性解析の利点を持っています。FA: 無料適応;警察庁: Nosepoke 適応;DSA: 飲んでセッション適応;PP: 場所選好;PPR: 場所選好逆転;SRT: 系列反応時間 (衝動性、注意の);PA: 場所の回避;DD: 遅延割引。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 実験的なデザインと PP と PPR のタスクの代表の結果。(A) 上部、PP または PPR の例モジュール設計。下、正しいコーナーの設定 PPR の反対側に変更します。年齢で誘発される広告モデル (NL-G-F) の学習空間の反転 (B) 赤字。データは、平均値 (SEM) の平均 ± 標準誤差として表されます。∗p < 0.05;∗∗p < 0.01。色を示す比較のグループ: 青: NL 対重量;赤: NL F 対重量;緑: NL G F 対 WT。この図は、参照10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: SRT タスクの試験フローします。左: SRT (imp) のトライアルの流れ。最初の nosepoke が正しい側を定義し、遅延期間を開始する (0.5 – 4.0 s)、黄色の Led がオンにした後。その扉を開きます。右: SRT (att) のトライアルの流れ。最初の nosepoke が正しい側を定義し、遅延期間を開始 (2.0 s) 後に、短い時間で黄色の Led がオンになっている (0.2 – 1.0 s)。マウスは、nosepokes を許可する期間を提供して (限られた保持、2 s)。ドアが開いて (5 s) 限られた保留中最初の nosepoke 正しい nosepoke した後にのみです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: 実験的なデザインと SRT タスクの代表の結果。(A) SRT の例モジュール設計。(B) 注意の年齢でに固有の広告モデルで減少します。データは、平均 ± SEM. ∗pとして表現される < 0.05;∗∗p < 0.01。色を示す比較のグループ: 青: NL 対重量;赤: NL F 対重量;緑: NL G F 対 WT。この図は、参照10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9: 実験的なデザインと DD タスクの代表の結果。(A) DD タスク モジュールの例。(B) 若年・高年齢で広告モデル (NL-G-F) の compulsivity の促進します。これは、表現型の例です。その一方で、compulsivity は、別の広告モデル (NL-F) 一過性増資。データは、平均 ± SEM. ∗pとして表現される < 0.05;∗∗p < 0.01。色を示す比較のグループ: 青: NL 対重量;赤: NL F 対重量;緑: NL G F 対 WT。この図は、前の仕事の10から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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本稿では、遺伝子組み換えの広告モデルで長期的な認知・行動のアッセイの自動化されたホーム ケージ監視システムを使用してメソッドについて説明します。最も重要なステップは、適切な位置にトランスポンダーの注入です。移植を実行する前に、トランスポンダーの有効期限の日付が渡されないことを確認します。2 番目の重要な点は、マイナーな問題は、調査の間により深刻な 1 つをなることができるその後、特に毎日、システムの機能を確認する (すなわちドア、落ちてアウト トランスポンダー、悪い電気接続などを積み上げ。.).第三に、実験スケジュールの中で多くの問題がありますので、トラブル シュートすることができることが不可欠です。

本稿は、認知評価タスクの基本的なパッケージを導入しました。これらのタスクは、従来の行動テストを参照して作り出されたが、彼らは完全に従来の検査を模倣できません。たとえば、SRT のタスクは、選択モードを設定しません。5 選択シリアル選択課題 (5CSRTT)、SRT タスクのモデル通常 9、5 または 3 穴精度16,17を測定する nosepoke の商工会議所で行われています。私たちのチームは以前、SRT の選択バージョンを実装しようが、マウスに比較的長い時間 (2 週間以上) 内の規則の習得に失敗しました。このシステムのユーザーの違いは、留意し、データを慎重に話し合います。

別の問題は、繰り返し測定の限界についてです。以前の研究18で述べたように、最初の 1 つは、繰り返し実験が年齢の影響を単純に比較できないです。PA テストの 2 番目のデータが広告モデル10で記憶障害をレプリケートに失敗したことがわかった。すべての遺伝子型のパフォーマンスは、最初の PA テストよりもはるかに悪化だった。この違いは、嫌悪刺激 (前の PA 作業の体験) 年齢差、慣れから来るかもしれない。実験者は、繰り返しの効果を気に、タスクの順序を検討してください。2 番目の PA テストの aversive 刺激の慣れを克服するために強力な空気パフ刺激を使用するまたは異なるタイプの寝具などいくつかの新奇環境刺激を追加するより良いであろう19の音ですか。

様々 な研究を進めている新しい方法およびプロトコル自動ホーム ケージ監視研究20,21,22,23,24,25 26, とオープン ソース ライブラリ27を使用してサポートするソフトウェア。したがって、システムの可能性を広げています。最後に、システムは、自動化されたハイスループット行動表現型解析と疾患モデルの検証に有益な認知機能の広い範囲の研究に使用する長期的な試金検診を提供します。

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Disclosures

利害の対立が宣言されていません。

Acknowledgments

撮影材料の彼女のヘルプありがとう玲子安藤。この研究は、挑戦的萌芽研究費補助金によって支えられた (日本学術振興会科研費助成番号 16 K 15196)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IntelliCage TSE Systems - Parchased in 2011 or later
PC Dell Inspiron 580s -
Display Dell SI75T-WL -
ALPHA-dri Shepherd Specialty Papers - Standard bedding
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g Toagosei (Krasy Glue) #04612 Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm
Handheld Transponder Reader BTS-ID R-560 Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars
Transponder DataMars T-VA, T-VAS, or another series Basic package of transponders and implanters
Diamond Grip Plus Ansel Microflex DGP-INT-M Experimental glove
Isoflurane Pfizer 1119701G1092 -
Vaporizer for small animals DS Pharma Biomedical SF-B01 Facemask included
Neo-Medrol Pfizer 006472-001 Eye ointment
Ethanol (70%) - - -
Excel Microsoft 00202-51382-15524-AA928 For data analysis

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References

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アルツハイマー病、IntelliCage を使用しての複数の遺伝モデルにおける認知機能の長期的な行動のアッセイの自動化
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Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).More

Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).

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