Vi beskriver her i vitro generering av HBV DNA via en hepatitt B virus infeksjon system og svært følsom påvisning av (1-2 eksemplarer) integrasjon med inverse nestede PCR.
Hepatitt B-viruset (HBV) er en vanlig blodbårne patogen som forårsaker leverkreft og levercirrhose skyldes kronisk infeksjon. Viruset vanligvis replikerer gjennom en episomal DNA mellomliggende; Imidlertid er integrering av HBV DNA i vert genomet observert, selv om skjemaet ikke er nødvendig for viral replikasjon. Den eksakte formålet, tidsberegning og mechanism(s) av hvilken HBV DNA skjer er ennå ikke klart, men nyere data viser at det skjer veldig tidlig etter infeksjon. Her, er i vitro generasjon og påvisning av HBV DNA integrasjoner beskrevet i detalj. Våre protokollen spesielt forsterker enkelt kopier av virus-celle DNA integrasjoner og tillater både absolutt kvantifisering og enkelt-base par oppløsning av krysset sekvensen. Denne teknikken er brukt til ulike HBV-følsomme celletyper (inkludert primære menneskelige hepatocytter), ulike HBV mutanter, og i forbindelse med ulike narkotika eksponeringer. Vi forutse denne teknikken blir en nøkkel analysen å avgjøre de underliggende molekylære mekanismene av fenomenet klinisk relevant.
HBV er en double-strandet DNA virus som kan forårsake livslang kronisk infeksjon, fører til skrumplever og hepatocellulært karsinom (HCC)1,2,3. Mens det er flere molekylære mekanismer HBV utholdenhet4 (f.eks høy stabilitet av epigenetic viral transcriptional malen), unndragelse av immun overvåking og lav omsetning av hepatocytter i leveren og assosierte risiko HCC innvielsen5,6 (f.eks kronisk betennelse og aktivering av mobilnettet stress veier), HBV DNA integrering i verten celle genomet (en rapportert mekanisme for begge disse fenomenene) har blitt dårlig undersøkt . En hovedgrunn er mangelen på passende i vitro infeksjon systemer for HBV at pålitelig påvisning av integrering hendelser. Her beskriver vi en nylig utviklet protokoll for både i vitro generasjon og påvisning av HBV DNA integrasjoner som kan brukes til å belyse den underliggende molekylære mekanismer og følgene av dette.
HBV replikering og dannelsen av HBV DNA integrering er anmeldt tidligere i detalj7. Kort, HBV inn hepatocytter med natrium Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) som den viktigste cellulære reseptoren for infeksjon8,9. HBV-nucleocapsids som inneholder HBV-avslappet sirkulær DNA (rcDNA) inn genomet kjernen, hvor rcDNA konverteres til episomal covalently lukket sirkulær DNA (cccDNA). Den kjernefysiske cccDNA fungerer som transcriptional mal for viral mRNAs og pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV utvalg og pgRNA er så pakket inn nye nucleocapsids (bestående av HBV kjernen protein dimers). HBV pgRNA er omvendt-transkribert i nucleocapsid, noe som resulterer i en rcDNA genomet eller en double-strandet lineær DNA (dslDNA) genomet11,12. Disse eldre nucleocapsids som inneholder HBV DNA genomer er endelig innhyllet og eksporteres som virions.
Infeksjon av hepatocytter av innhyllet partikler som inneholder dslDNA molekyler kan føre viral integrering i verten celle genomet13, fører til replikering-inkompetente former for HBV DNA7,14,15. HBV DNA skjer på stedet av chromosomal double-strandet DNA bryter15. Samler bevis antyder at integrering hendelsene oppstår i hovedsak tilfeldig stilling innen verten celle genomet16,17. I tillegg HBV DNA skjer noe sjelden, med en hastighet på 1 per 104 celler13,18,19,20. Viktige spørsmål om HBV DNA integrering forblir ubesvart, spesielt om nøyaktig molekylær trasé involvert, avhengigheten av viral og vert faktorer, viral antigener uttrykt fra integrert skjemaer og deres mulige bidrag viral utholdenhet7. Vi har satt opp en i vitro modell å kaste lys over noen av disse spørsmålene.
Sjeldenhet av HBV DNA integrering hendelser (både med hensyn til integrering rate per celle og kopien antall hver integrasjon) i i vitro HBV-infeksjon modeller gjør dem vanskelig for å oppdage. Cellen mitose er begrenset i våre in vitro -system som dele celler ikke støtter effektiv infeksjon. Dermed smittet i motsetning til pasienten leveren vev hvor betydelig klonal ekspansjon av hepatocytter oppstår18,19,20, svært få (1 til 2) eksemplarer av hver integrering finnes i en gitt celleområde i vitro . Vi har også funnet at hovedsakelig skjer under første infeksjonen hepatocytes (og ikke kontinuerlig i kronisk infisert hepatocytter)13. Følgelig kan ikke HBV DNA integrering økes ved bare dyrking celler for en lengre periode.
Generelt, blot tidligere brukes til å oppdage integrert HBV-DNA, inkludert sørlige hybridisering21,22,23,24,25, Alu PCR26,27 , kassett-mediert ligation PCR28, og hele genomet sekvensering29,30,31,32,33, har ikke følsomheten å oppdage Single-kopier av integrasjoner. Vi og andre forskere har brukt inverse nestede PCR (invPCR) for å oppdage hepadnaviral DNA integrering i duck og hakkespett menneskelige infiserte lever13,14,18,19, 34,35,36. Andre har innført prosessuelle endringer invPCR teknikken som kan endre generering av falske positive signaler og begrense muligheten for kvantifisering37. Hvis analysen utføres som beskrevet i denne protokollen, representerer invPCR en bestemt og følsom analysen som identifiserer og kvantifiserer (i absolutt kopi tall) flere HBV DNA integrasjoner. HBV-cell DNA krysset er sekvensielt på en enkelt-base par oppløsning, slik at bioinformatical studier av viral og vert DNA sekvenser ved integrering13.
Vi har tidligere beskrevet38 resultater fra invPCR på DNA av HBV-infiserte vev Hentet fra en rekke kilder, inkludert snapin-frosne leveren vev, parafin-embedded leveren inndelinger og ekstremt liten vevsprøver isolert av laser-microdissection19. Denne protokollen skisserer en oppdatert versjon av invPCR analysen ved hjelp av DNA utvunnet fra celle kultur-avledet vev etter i vitro infeksjon, der lav kopi antall integrasjoner (1-2 eksemplarer per integrering) er generert. Den HBV DNA integrasjoner dannet i vitro ligner de som finnes i pasienten vev med hensyn til deres distribusjon over mobilnettet genomet og krysset i viral sekvensen som er integrert13,16, antyder en sammenlignbare vei til innenfor en infisert leveren.
Før du utfører protokollen, er det viktig å merke seg at denne invPCR analysen er en høylig følsom teknikk, kan forsterke enkelt kopier av DNA mal. Derfor er begrense forurensning fra PCR produkter av største betydning. De generelle strategier for å begrense PCR kontaminering av produktet omfatter følgende: (i) opprette fysisk separate områder for fremgangsmåten av metoden. Hvert område må separat labfrakker, og hansker bør endres når du flytter mellom disse områdene. Vi har listet opp disse områdene nedenfor i rekkefølge fra mest til minst sannsynlig å være forurenset: PCR utvinning og sekvensering reaksjon oppsett produktområdet (post-PCR); PCR mal tillegg og flammet-pin overføre området (vi har brukt PCR hetter med en decontaminating UV-lampe med gode resultater). DNA utvinning og inversjon området (pre-PCR); og “DNA mal-fri” utelukkende for tilberedning lager og PCR løsninger. (ii) være klar over luftstrømmen i laboratoriet som potensialet sjåfør av kryss-kontaminering. Kryssforurensning PCR reaksjoner under flammet pin overføring trinnet er spesielt passende og føre til unøyaktig kvantifisering av integrasjon frekvens. PCR hetter kan brukes til å begrense disse cross-strøm. Negativ kontroll brønner (f.eks Myrcludex B-behandlet prøver eller ingen mal-kontroller) i PCR kan også brukes til å teste kryssforurensning. (iii) begrense potensielle PCR forurensninger på Pipetter og arbeid overflater av regelmessig tørke dem med en DNA fornedrelse løsning.
Protokollen som er angitt her arrangeres å oppdage integrering av en kjent smittsomme HBV klone generert fra HepAD38 celle linje42. Hvis inoculum brukes av en annen HBV DNA sekvens (f.eks fra pasienten serum), deretter HBV genomet bør være først i rekkefølge for å bekrefte kompatibilitet PCR primere og inversjon design. I tidligere publiserte undersøkelser19, har vi brukt 3 sett med primer som binder bevarte HBV DNA-sekvenser flankert forventet stedet for HBV DNA integrering veikryss. Andre primer sekvenser og protokoller har blitt beskrevet for å fastslå genomisk sekvensen av HBV44,45,46,47,48 , og kan fungere.
Videre kan ulike HBV-følsomme celler (f.eks primære menneskelige hepatocytter, differensiert HepaRG, HepG2-NTCP celler) brukes; Vi har imidlertid funnet at Huh7-NTCP celler gir det største signal-til-støy-forholdet, når de vurderer hvor mange virus-celle DNA veikryss som er forsterket i forhold til det mellomliggende DNA som er forsterket13. Spesielt gjennomgår terminalt differensierte celler som primære menneskelige hepatocytter eller differensiert HepaRG ikke effektivt mitose, noe som resulterer i høy amplifiable HBV DNA replicative mellomprodukter gjenværende i cellene. Vi har funnet at ~ 90% av forsterket sekvenser representerer HBV DNA rearrangements (og ikke integrering hendelser) i terminalt-differensiert celler, sammenlignet med 70-50% i hepatoma cellen linjer13. Disse produktene er vanligvis HBV DNA genomer inneholder store slettinger i overflaten og kjernen åpne lesing rammer, eller de kan representere HBV kvasi arter med en ekstra Ncojeg området før Sphjeg området. Forsterkning av disse HBV arter (inkludert en skjematisk diagram) har blitt beskrevet i detalj tidligere13.
Det er flere ulemper til denne metoden. På grunn av arbeidskrevende og flerdags natur denne protokollen, er invPCR ikke egnet for høy gjennomstrømming analyser av mange eksempler. Videre, som det begrense fortynning titrering, vår metode er ikke veldig presis i kvantifisering; Selv om det bør lett måler loggnivå endringer i integrering frekvens.
Dessuten er våre inversjon protokollen bare egnet til å oppdage integrasjoner oppstår mellom DR2 og DR1 regionen HBV genomet, som fleste av HBV integrasjoner forekommer i denne regionen49. NGS analyse av HBV pasienten vev har vist at et stort mindretall (opp til ~ 50%) kan også oppstå utenfor denne regionen49. Nye invPCR design er teoretisk kunne oppdage disse andre integrering nettsteder, men de har ikke (til vår kunnskap) vært utført ennå. Relatedly, på grunn av de nødvendige begrensning enzym nettstedene kreves nedstrøms fra virus-celle krysset sekvensen for inversjon reaksjonen, invPCR oppdager ikke alle integrasjoner innenfor regionene DR2 og DR1 av HBV genomet (dvs. vi har anslått at ~ 10% av alle integrasjoner er synlig bruker i sili simuleringer13). Men når den brukes til en fokusert gruppe av prøver med lite antall forskjellige behandlinger, er invPCR en av de eneste praktiske metodene for å oppdage integrert HBV DNA på én base par oppløsning.
Vi ser derfor anvendelser av denne metoden serverer en nøkkelrolle i å finne viral (via mutasjoner av HBV-inoculum), mobil (gjennom knockout eller overuttrykte bestemt cellulære gener, eller gjennom bruk av ulike stoffer) og miljømessige ( f.eks eksponering for oksidativt stress) faktorer som induserer HBV DNA integrering. Med denne metoden og nyutviklet HBV-infeksjon systemer aktivere vi uovertruffen kontroll av disse faktorene slik at de kan være godt isolert og bedre preget. Vi forventer at dette vil føre til en nøkkel forståelse av mobilnettet konsekvensene av HBV DNA integrasjon, inkludert hvilken grad viral antigener (f.eks HBx eller HBsAg50) uttrykkes fra integrert skjemaet hva styrer denne uttrykket og om HBV integrering endrer mobilnettet fenotypen mot en mer pro-kreftfremkallende tilstand. Resultatene av disse fremtidige studier vil ha en betydelig innflytelse på strategiene brukes til behandling av kronisk hepatitt B og grunnleggende forståelse av selve viruset.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet mottatt finansiering fra tysk sentrum for infeksjon forskning (DZIF), TTU hepatitt prosjekter 5.807 og 5.704, den tyske Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15), og australske sentrum for HIV og hepatitt virologi forskning.
Vi er gjeld til Professor William Mason for sin del i å utvikle den opprinnelige invPCR metoden og demonstrere det til oss. Vi vil gjerne takke Dr. Yi Ni og Florian A. Lempp for reagenser (linjer og HBV inoculum). Vi erkjenner Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt og Dr. Katrin Schöneweis for teknisk assistanse. Vi er takknemlige til Miriam Kleinig for korrekturlesing og professorer Nicholas Shackel og Ralf Bartenschlager for kontinuerlig støtte.
Dulbecco’s PBS | PAA | H15-002 | |
DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 41965 | |
Fetal bovine serum | PAA | A15-151 | Heat-inactivate before use |
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100× | PAA | P11-010 | |
L-glutamine, 200mM | PAA | M11-004 | |
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1× | PAA | L11-004 | |
PEG, MW 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use |
DMSO for spectroscopy | Merck | 102950 | |
Tenofovir disoproxil | Sigma-Aldrich | CDS021622 | Dissolve in DMSO |
Lamivudine | Sigma-Aldrich | L1295 | Dissolve in DMSO |
NucleoSpin Tissue kit | Macherey Nagel | 740952.250 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
NcoI-HF | NEB | R3193L | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202T | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 433209 | |
Dextran (35 -45 kDa) | Sigma-Aldrich | D1662-10G | |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-1L-D | |
BsiHKAI | NEB | R0570L | |
SphI-HF | NEB | R3182L | |
Amplitaq Gold Taq kit | Thermo Fisher Scientific | 4331816 | Use for first nest PCR |
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates | Biorad | 2239442 | |
DNAZap PCR DNA Degradation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9890 | |
96-well PCR plates | Sigma Aldrich | CLS6509 SIGMA | |
96-pin replicator | Thermo Fisher Scientific | 250520 | |
GoTaq Flexi PCR kit | Promega | M8295 | Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
QIAEX II Gel extraction kit | QIAGEN | 20051 |