Summary
Dimensione di acinus ghiandole ipofaringee è una misura robusta di nutrizione di ape miele infermiera. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per dissezione, colorazione, imaging e misurazione dei acini infermiera ape hypopharyngeal ghiandola.
Abstract
Le ghiandole ipofaringee infermiera producono la frazione proteica del lavoratore e pappa reale che viene alimentata per lo sviluppo di larve e regine. Queste ghiandole accoppiate che si trovano nella testa dell'ape sono altamente sensibili alla quantità e qualità del polline e polline sostituisce che consuma l'ape infermiera. Le ghiandole diventano più piccole quando gli infermieri sono alimentati le diete carenti e sono grandi quando sono alimentati le diete complete. Perché infermiere hypopharyngeal ghiandola dimensione è un indicatore robusto di nutrizione di infermiera, è essenziale che coloro che studiano miele ape nutrizione sanno come misurare queste ghiandole. Qui, forniamo metodi dettagliati per dissezione, colorazione, imaging e ghiandole ipofaringee delle API di infermiere di misura. Vi presentiamo i confronti del tessuto macchiato e non macchia e dati che sono stati usati per studiare l'impatto di polline sulle dimensioni della ghiandola. Questo metodo è stato utilizzato per testare come dieta impatti dimensioni ghiandole ipofaringee ma ha ulteriore uso per comprendere il ruolo di queste ghiandole nella salute di alveare.
Introduction
API del miele sono essenziali per l'agricoltura perché impollinano una varietà di colture che sono consumati dagli esseri umani e animali. Molta attenzione è stato pagato al declino delle popolazioni di API del miele come Colonia perdite al passaggio del mouse intorno 30-40% ogni anno negli Stati Uniti d'America1 e 10 – 15% in Europa2,3. Molteplici fattori, tra cui accesso limitato all'alta qualità del foraggio, probabile atto insieme a compromettere la salute delle API di miele. Monocoltura, siccità, pratiche di apicoltura insostenibile e altri fattori diminuiscono la diversità e la quantità di Pollini naturale disponibile a colonie4,5. Poiché le API il miele quasi tutte le loro proteine alimentari e lipidi derivano da polline, accesso ridotto al polline può limitare severamente la salute individuale e Colonia.
Le ghiandole ipofaringee sono secretive strutture situate nella testa dell'ape tra gli occhi e il cervello6. In circostanze normali, la traiettoria evolutiva e funzionale delle ghiandole specchio che l'ape si trovano in. A circa 5 – 10 giorni di età, l'ape esegue comportamenti di professione d'infermiera nell'alveare. In questo stesso momento, le ghiandole ipofaringee raggiungono loro dimensioni massime e la capacità secretiva, producendo la frazione di proteina principale dell'alimento di covata o gelatina alimentati per lo sviluppo di larve e altri adulti, come la regina. In questa dimensione di picco le ghiandole assomigliare ad un grappolo d'uva dove ogni acino è una struttura di lobo discreti conosciuta come il acinus (plurale: acini). Come l'ape operaia età e assume diversi compiti nell'alveare, le ghiandole ipofaringee strizzacervelli e assumono funzioni diverse, come abbattere gli zuccheri in nettare7,8. Le ghiandole ipofaringee pertanto sono correlate con l'età l'ape e il loro compito di età-collegato.
Dimensione della ghiandola infermiera hypopharyngeal è sensibile alla quantità e qualità delle proteine nella loro dieta9,10,11. Quando le API infermiere sono ben nutrite, le loro ghiandole sono grandi. Considerando che, le ghiandole sono piccole quando l'ape è privata di polline, specialmente nella prima settimana di sviluppo adulto. Al fine di determinare lo stato nutrizionale di un ape di infermiere, i ricercatori in genere misurano le ghiandole ipofaringee, sia misurando direttamente la ghiandola acinus dimensione11,12,13,14 o proteina contenuto15,16 o misurando la proteina contenuto11 o peso fresco17 dell'intera testa in cui si trovano. Ogni metodo ha i suoi pro e contro. Noi preferiamo la risoluzione ottenuta dalla misurazione dei acini della ghiandola, anche se questo metodo può essere impegnativo in due modi principali. La prima sfida è correttamente identificare e sezionare la ghiandola. Il secondo è l'ottenimento di una misura accurata di ogni acinus. Microscopio ottico per dissezione, le ghiandole appaiono chiaro o lattiginoso bianco e i bordi degli acini possono essere difficili da definire. Avere strumenti per meglio definire il bordo degli acini e per aumentare la probabilità di ottenere misurazioni accurate della ghiandola è vantaggioso per chi studia miele ape nutrizione.
Qui, indichiamo i ricercatori interessati come sezionare, macchia, immagine e misurare le ghiandole ipofaringee affinché misure accurate delle dimensioni di acinus possono essere raggiunto. Il metodo che descriviamo offre ai ricercatori un metodo semplice, accurato e replicabile per realizzare misurazioni multiple di ghiandola in un relativamente breve periodo di tempo una volta che lo sperimentatore è sufficientemente praticato. Uno potrebbe misurare con fiducia le ghiandole di quasi 10 individui in poco più di un'ora. Offriamo dettagli sul metodo e materiali necessari per ottenere queste misurazioni. La corretta dissezione e colorazione delle ghiandole sono gli aspetti più importanti dei metodi descritti di seguito. Anche se abbiamo catturare le immagini ingrandite e misurare gli acini con software commerciale, i metodi che vi presentiamo possono essere facilmente adattati per altre piattaforme18.
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Protocol
1. di dissezione e la macchiatura le ghiandole ipofaringee da infermiera lavoratori
- Fare un piatto di dissezione di cera per fusione cera ambiente fresco in un piccolo (60 mm x 15 mm) o un bicchiere di grandi dimensioni (100 mm x 15 mm) piastra di Petri. Raffreddare la cera completamente prima di utilizzare la piastra per le dissezioni.
- Per ogni ape da elaborare, preparare 20 µ l di un 01:20 Giemsa soluzione di lavoro (01:20 v/v di preparati di Giemsa in tampone fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4)).
Attenzione: La colorazione di Giemsa contiene metanolo ed è infiammabile. È tossico se ingerito, inalato, o se viene a contatto con la pelle. Deve essere smaltito secondo le esigenze dell'ente locale.
Nota: Assicurarsi sempre una soluzione fresca di lavoro solo per il batch corrente di campioni, perché la macchia di Giemsa degrada rapidamente una volta che esso viene diluito. Eliminare la macchia diluita se si sviluppa un precipitato. - Pipettare 20 µ l di Giemsa nei pozzetti dei vetrini da microscopio e soluzione salina di 50 – 100 µ l nella diapositiva adiacente al pozzo.
- Staccare la testa da un'ape, usando le forbici di micro-primavera di 10 mm e incorporare la piastra di dissezione di cera utilizzando pinze e una penna di cera-intaglio lato anteriore testa fino. Fissare la testa nella piastra della cera per maggiore stabilità con l'inserimento di perni in uno in bocca e gli occhi.
- Con una lama di rasoio frangibile affilata fissata in una morsa di pin, fare un piccolo (~ 2 – 3 mm) incisione tra gli occhi e mandibole su ciascun lato della mascherina frontale. Delicatamente eseguire le micro forbici sotto la piastra anteriore e tagliare il nervo antennale che corre tra le antenne e il cervello.
- Utilizzando una pinzetta, afferrare la piastra di faccia per bocca, flip up e aggiungilo alla piastra di cera con pinze a punta fine e un pin. Se necessario, rimuovere il frontalino completamente.
- Pipettare 20 µ l PBS sul taglio aprire la sezione della testa.
Nota: Le ghiandole possono galleggiare fino a questo punto o uno deve cercare per loro. Le ghiandole apparire come un filo di perle e si trovano in cima al cervello se intatto. - Usare il forcipe punto super multa per rimuovere delicatamente una delle ghiandole ipofaringee (la ghiandola può rompere, che richiedono di essere rimosso in segmenti) e trasferire immediatamente la ghiandola per la colorazione di Giemsa della diapositiva di microscopia.
- Consentire la ghiandola Incubare nella soluzione Giemsa per 5 min e quindi utilizzare pinze per trasferire la ghiandola al pool di soluzione fisiologica nella stessa diapositiva. Se necessario, tagliare la ghiandola in piccoli pezzi con le forbici micro.
Nota: Ciò contribuisce a rendere le ghiandole si trovano su un piano più piatto, rendendo così più facile per ottenere immagini chiare dei acini della ghiandola.
2. misurazione hypopharyngeal Acini della ghiandola
- Accendere il microscopio e aprire il programma di misurazione. Accendere la sorgente di luce per il microscopio se non è già su. Impostare l'ingrandimento del microscopio a 10x.
- Trovare le ghiandole e concentrarsi l'immagine ingrandita nell'oculare, senza il computer. Aumentare l'ingrandimento a 60 – 80 X e mettere a fuoco l'immagine nell'oculare.
- Sotto la scheda "Acquire", regolare e le ghiandole di concentrarsi sull'immagine dal vivo sul computer.
- Digitare immagine esempio di nome descrizione nella casella 'Nome immagine' e clicca 'Acquisire immagine' per prendere un'immagine delle ghiandole per ulteriori misure.
- Selezionare la scheda 'Analisi' selezionare la 'zona tool' (evidenziato in Figura supplementare 1A) e deseleziona 'valore' sotto 'Visualizza etichette', che sarà anche deselezionare 'unità'. Impostare tutte le altre impostazioni predefinite (Supplemental Figura 1A).
Nota: Il software calibra automaticamente le misure di zona secondo il livello di ingrandimento affinché l'area ottenuta da un ingrandimento minore è lo stesso di quello ottenuto da un ingrandimento superiore. - Misurare ogni acinus continuamente facendo clic o continuamente tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse mentre si traccia il perimetro di acinus attentamente possibile. Misurare almeno 10 acini per ape.
Nota: Più può essere necessaria a seconda dell'esperimento (veda la discussione). Si possono richiedere più immagini/sezioni della ghiandola per trovare abbastanza chiari, orientati correttamente i acini per misura. - Una volta che tutti gli acini da una singola immagine sono stati misurati, selezionare "Crea Report". Accertarsi che le opzioni sono selezionate come mostrato in Figura supplementare 1B e fare clic su 'Export'.
- Salvare il report come desiderato. Se un file è già stato creato per il set di campioni e vengono aggiunti ulteriori misurazioni, assicurarsi che il file di report non è aperto in modo che i nuovi dati vengono aggiunti al file esistente.
- Una volta terminato, accendere il microscopio fotocamera e la sorgente di luce. Strofinare il liquido e ghiandole fuori le diapositive di microscopia e smaltire in modo sicuro qualsiasi materiale utilizzato. Sciacquare i vetrini con acqua distillata e pulire con etanolo (70% v/v in acqua) per il riutilizzo.
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Representative Results
Ghiandole ipofaringee sono stati sezionati da infermiera lavoratori e visualizzati con e senza macchia a 60 – 80 ingrandimenti (Figura 1). Nel tessuto senza macchia, è difficile trovare adeguato contrasto completamente a fuoco e definire i bordi degli acini. Nel tessuto macchiato, i bordi degli acini sono nitide a causa del contrasto migliorato tra il tessuto macchiato e lo sfondo bianco.
Figura 1: senza macchia (A, B) o tinto (C, D) ghiandole ipofaringee da infermiera-vecchi lavoratori. Si noti che, mentre le ghiandole sono visibili in entrambi i casi, le ghiandole macchiate sono più ben definiti e quindi più facile da misurare. Nota che un po' arricciata e morfologia della ghiandola intera a spirale comporta anche diversi piani focali. La ghiandola può essere sezionata per impedire che ciò accada. Scala bar = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Operai dell'ape del miele sono stati raccolti presso ≤ 18 h dopo l'emersione e sono stati assegnati a due diversi regimi dietetici: una dieta di polline primavera naturalmente presente in Tucson, Arizona, Stati Uniti d'America mescolato con miele o solo miele con nessun polline. Al fine di limitare le API a queste diete mentre nell'alveare, sono state utilizzate push-in filo gabbie — come descritto in precedenti studi13,14 — confinare le API ad una densità di circa uno ape per centimetro quadrato. Ogni trattamento dietetico è stato ripetuto in tre alveari (N = 3). API esposte a qualsiasi regime dietetico sono stati raccolti a 5D e 8 d dell'età per l'analisi delle loro ghiandole ipofaringee. Utilizzando la dissezione, colorazione e misurando i metodi descritti sopra, i acini di ghiandole ipofaringee di queste API sono stati misurati e confrontato (Figura 2). In ciascuna delle tre alveari, tre API sono state misurate per ogni età x combinazione di trattamento di dieta. Dieci dei acini sono stati misurati per ogni ape. Le misurazioni dei acini erano in media per ogni ape ottenere una dimensione di acinus medio per ape. Questi valori sono state fatte la media poi per ottenere un valore per l'età x combinazione di trattamento per quell'alveare. L'analisi ANOVA sulle misurazioni di acinus ha mostrato che la dieta (F1,8= 2,65, p = 0,001), età (F1,8 = 10.03, p = 0,013) e l'interazione tra dieta x età (F1,8= 0,02, p = 0,020) ha avuto effetti significativi. Abbiamo osservato che le ghiandole ipofaringee crebbero nel tempo nelle API che sono stati alimentati il polline, come determinato da un Tukey HSD. Questo modello è stato dimostrato in precedenza9,11,19. La dimensione dei acini della ghiandola non ha differito fra la d 5 e 8 giorni vecchio API quando le API sono state private di polline.
Figura 2: dimensioni della ghiandola Hypopharyngeal infermieri ben nutriti e quelli privi di polline. I lavoratori sono stati alimentati una dieta di polline e miele (barre grigie) o una dieta di miele da solo (barre bianche) per 5 o 8 d. Durante questo tempo, le API erano dentro l'alveare e in gabbia sopra miele o miele e polline. Loro acini di ghiandole ipofaringee sono stati misurati come descritto sopra. Barre di errore rappresentano l'errore standard per le dimensioni di acinus media in tutte le tre colonie (N = 3) testato. Tre API sono state misurate da ogni Colonia per ogni età trattamento x combinazione di trattamento di dieta. Bar collegato da un asterisco sono significativamente diverso tra loro secondo un Tukey di HSD (α = 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le API possono essere mantenute in gabbie separate dall'alveare e alimentate le diete definite. Operai dell'ape del miele sono stati raccolti a ≤ 18 h dopo l'emersione e sono stati assegnati a gabbie di vetro acrilico (100 API per gabbia) con uno dei quattro regimi dietetici: una dieta che contiene nessun polline o una dieta che contiene uno dei tre raccolti ape Pollini: polline "mandorla" da una mandorla monocoltura di frutteto, "deserto" polline del deserto di Sonoran contenente un mix di piante del deserto o il "SE" polline da colonie situate negli Stati Uniti sud-orientale, come descritto in Corby-Harris et al. 12. saccarosio (50% p/v), acqua e polline (se del caso) sono stati forniti ad libitum. Per ciascuno dei quattro trattamenti dietetici, risultante in un totale di 20 gabbie sono state costruite cinque gabbie. A 8 d dell'età, le ghiandole ipofaringee delle dieci API rilevate e misurate. Dieci dei acini sono stati misurati per ogni individuo. La dimensione di acinus media è stata calcolata per ogni ape e questi valori sono stati utilizzati per ottenere una dimensione di acinus medio per ogni gabbia. Abbiamo osservato che hypopharyngeal ghiandola dimensione è sensibile sia alla presenza di polline nella dieta (polline contro nessun polline: t1 = 5,64, p < 0,0001) e il tipo di polline fornito (mandorla vs deserto vs polline SE: F2.148 = 8,06, p = 0,0005; Figura 3). Le API hanno alimentato deserto o mandorla polline aveva dimensioni equivalenti della ghiandola. Le API alimentati polline SE erano ghiandole che erano più piccole di API alimentati polline mandorla o deserto.
Figura 3: dimensioni della ghiandola Hypopharyngeal dei lavoratori di età infermiere alimentati tre diversi tipi di polline o privi di polline. Le API dell'infermiera sono state collocate in gabbie dopo l'emersione e sono state alimentate una dieta composta di saccarosio da solo (nessun polline) o saccarosio e uno dei tre Pollini (mandorla, deserto o SE polline) fino a 8 d dell'età. Barre di errore rappresentano la deviazione standard per le dimensioni di acinus media nelle API campionati da cinque gabbie (N = 5). Dieci le API sono state campionate e misurate in ogni gabbia per ottenere una dimensione di acinus medio per la gabbia e per calcolare la variazione tra le gabbie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare File 1: le schermate del software di misura mentre misuri gli acini della ghiandola (A) e la creazione del report (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Hypopharyngeal ghiandola dimensione è sensibile alla quantità di proteina e polline nella dieta ed è un indicatore critico di nutrimento in giovani api adulte. Qui, dimostriamo di sezionare e misurare questo tessuto in modo riproducibile e poco costoso. Questi tessuti possono essere difficili da sezionare, ma con la pratica, si possono ottenere sempre più pulitore dissezioni con il tessuto relativamente intatto. Il vantaggio principale del metodo presentato qui è che il tessuto è macchiato, che consente al ricercatore di visualizzare chiaramente i confini di acinus ogni ghiandola. Senza macchia, i bordi di questi acini sono difficili da visualizzare e mettere a fuoco il microscopio che diminuisce la capacità del ricercatore di ottenere una misurazione accurata di acinus. Nonostante la facilità di colorazione e ottenere un'immagine chiara per gli acini, parecchi punti critici da considerare al fine di ottenere misurazioni accurate; Questi sono discussi di seguito.
Grandi ghiandole provengono da API ben nutriti infermiera che sono circa 7 – 10 giorni di età9,20. È sempre più facile, soprattutto quando si impara a sezionare questi tessuti, alla prima pratica grandi ghiandole di dissezione prima di spostarsi più piccole ghiandole come possono essere piccole, fragili e difficili da sezionare. Tessuto fresco produce anche le dissezioni migliori. Se uno deve congelare l'ape per un periodo di tempo prima della dissezione, sapere che il più a lungo che un'ape è congelata, più fragile il tessuto diventa. Questo può rendere problematico dissezioni. Con pratica e pinze taglienti, il ricercatore sarà eventualmente superare questi problemi. Non abbiamo notato una differenza di colorazione fra il tessuto congelato e fresco.
Macchia fresca è necessario al fine di ottenere adeguata colorazione delle ghiandole. Macchia più anziane possono aggregarsi, lasciando la macchia in grado di permeare correttamente i tessuti. È importante che macchia fresca preparata in piccoli lotti, circa ogni ora. In tal modo adeguato contrasto tra il tessuto e lo sfondo sotto il microscopio, che conduce a immagini nitide con bordi di acinus definiti. È anche utile per lavorare con una serie di diluizioni di macchia se la macchia non correttamente permeare il tessuto. Abbiamo trovato che un 01:20 fresco lavoro stock di macchia funziona meglio, ma altre diluizioni può funzionare anche se si vuole una macchia più scura o più chiara.
Abbiamo usato una telecamera collegata al microscopio da dissezione e software disponibile in commercio per misurare e registrare i dati di acini. La fotocamera e il software sono un po' costosi e pertanto potrebbero non essere disponibili per tutti i laboratori. Anche se è necessario avere una macchina fotografica collegata al microscopio per dissezione al fine di ottenere l'immagine e misurare gli acini sono disponibili diverse opzioni di costo inferiore, tra i quali software libero18, che può essere utilizzato.
Qui, indichiamo il basic procedura di macchiatura e misura i hypopharyngeal dei acini della ghiandola, ma sottolineare che esso fino al ricercatore di decidere quanti acini a misura, se misurare i acini su una o entrambe le ghiandole e se misurare le zone multiple di ogni ghiandola. Ad esempio, al fine di rilevare altre sottili differenze tra trattamenti sperimentali, uno potrebbe essere necessario misurare più di 10 acini per ghiandola e più di 10 API per ogni trattamento. Non abbiamo notato le differenze di dimensione dei acini basano su loro posizioni sulla ghiandola. Non abbiamo anche notato eventuali differenze nelle dimensioni dei acini che si trovano sulle ghiandole destra o sinistra. Se il ricercatore sospetti eventuali differenze di dimensioni, più aree della ghiandola hypopharyngeal e forse entrambe le ghiandole dovrebbero essere misurate.
I ricercatori dovrebbero essere in grado di ottenere con successo misure accurate delle dimensioni di ghiandola hypopharyngeal utilizzando il protocollo descritto qui per dissezione e colorazione del tessuto della ghiandola e dei acini di misura. Con pratica, queste misurazioni possono essere ottenute piuttosto rapidamente, che permette al ricercatore di processare i campioni multipli in una sola seduta. Ci aspettiamo che i ricercatori più impiegherà i metodi descritti qui mentre cercano di capire meglio i fattori che influenzano la dimensione della ghiandola hypopharyngeal e come queste ghiandole si riferiscono alla salute della Colonia e comportamento individuale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da fondi interni dal USDA-ARS (numero di progetto: 2022-21000-017-00-D). L'ARS/USDA è un datore di lavoro pari opportunità e il provider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
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