Summary
下咽頭腺 acinus サイズは看護師蜂蜜蜂栄養の堅牢なメジャーです。ここでは、解離性、染色、イメージング、および看護師ミツバチの下咽頭腺房を測定詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
看護師の下咽頭腺は、労働者と幼虫とクイーンズの開発にフィードバックされるローヤル ゼリーのタンパク質画分を生成します。蜂の頭の中にあるこれらの一対の腺が量に非常に敏感、花粉、花粉の品質看護婦蜂が消費します。腺は、看護師が欠乏飼料飼料度が完全なときが多いと小さくなります。看護師下咽頭腺サイズは、看護栄養の強力な指標は、これらの蜂蜜蜂栄養の勉強はこれらの腺を測定する方法を知っていることが不可欠です。ここでは、解離性、染色、イメージング、および看護師ミツバチの下咽頭腺を測定手法の詳細を提供します。無染色・ ステンド グラス組織と腺のサイズに花粉の影響を研究に使用されたデータとの比較を紹介します。このメソッドは、どのようにダイエット下咽頭腺のサイズに影響を与えますが、ハイブ健康でこれらの腺の役割を理解するためのそれ以上の使用は、テストに使用されています。
Introduction
彼らは様々 な人間や動物によって消費される作物を受粉するので、ミツバチは農業に不可欠です。注目されて蜂蜜のミツバチの人口の減少にコロニー損失ホバー約 30-40% として毎年アメリカ合衆国1ヨーロッパ2,3で 10-15%。高品質への減らされたアクセスを含む複数の要因、飼料、可能性が高い行動を共に、ミツバチの健康に悪影響を及ぼします。モノカルチャー、干ばつ、持続不可能な養蜂の実践、および他の要因は、多様性と植民地4,5に利用可能な自然の花粉の量を減らします。蜂蜜の蜂は、花粉から彼らの食餌療法蛋白質および脂質のほとんどすべてを派生しているので花粉への減らされたアクセスは厳しく個人と植民地の健康を制限できます。
下咽頭腺は、目と脳の6の間に蜂の頭にある分泌型の構造です。通常の状況下で腺の発達と機能の軌道にある蜂のそれを映します。時代の約 5-10 日で蜂は、ハイブの看護動作を実行します。この同じ時に、それぞれのピーク サイズとひな食品やゼリーが幼虫や女王など他の大人を開発する供給の主要なタンパク質画分を生産、分泌能下咽頭腺に達する。このピークのサイズで腺それぞれのブドウが、acinus と呼ばれる離散葉構造をブドウの房のように (複数: 腺)。働き蜂が年齢、ハイブの別のタスクにかかる下咽頭腺が縮小し、蜜7,8糖を打ち破るようなさまざまな機能を取る。下咽頭腺したがってミツバチとその加齢に伴うタスクの年齢と関連しています。
看護師の下咽頭腺のサイズは、そのダイエット9,10,11タンパク質の質と量に敏感です。看護婦に蜂が栄養状態が良く、その腺が多い。腺が小さいに対し、とき大人の開発の最初の週で特にミツバチは、花粉の奪われました。看護婦の蜂の栄養の状態を決定するために研究者は通常下咽頭腺腺 acinus サイズ11,12,13,14を直接測定することによっていずれかを測定またはタンパク質15,16コンテンツ タンパク質を測定することによってコンテンツ11または新鮮な重量17頭全体どこにあるの。各メソッドには、独自の長所と短所があります。我々 は、このメソッドは 2 つの主要な方法で挑戦することができますが、腺房の測定から得られる解像度を好みます。最初の課題は、適切に識別し腺の解剖です。2 番目が各 acinus の正確な測定を取得します。解剖顕微鏡の下で腺はクリアまたは乳白色の白を表示され、腺の境界を定義すること困難にすることができます。ツールより、房の端を定義し、腺の正確な測定値を得る可能性を高めることは、蜂蜜蜂栄養を勉強して誰にも有益です。
ここで、興味のある研究者を解剖、染色、イメージ、および acinus サイズの正確な測定を達成することができますので、下咽頭腺を測定する方法を紹介します。について述べる方法では、研究者、実験者は十分に練習したら、比較的短い期間で複数の腺の測定を達成するための簡単、正確、かつ複製可能なメソッドを提供しています。1 つは、わずか 1 時間でほぼ 10 人の腺を自信を持って測定でした。これらの測定値を得るために必要な素材と方法の両方についての詳細を提供しています。下記の方法の最も重要な側面は、適切な郭清と腺の染色です。拡大された画像をキャプチャし、商用ソフトウェアに房を測定、提案方法簡単に18他のプラットフォームに適応できます。
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Protocol
1. 解離性と看護師の労働者から下咽頭腺の染色
- 小 (60 mm × 15 mm) または大 (100 mm × 15 mm) ガラス シャーレにクールな設定ワックスを溶かすことによってワックス剥離プレートを作る。解剖のプレートを使用する前に、ワックスを完全にクールします。
- 各蜂を処理するには、準備、1:20 作業ギムザ ソリューションの 20 μ L (1:20 v/v の準備ギムザ染色リン酸緩衝生理食塩水 (PBS: 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM ナ2HPO4、1.8 mM KH2PO4))。
注意: ギムザ染色は含みメタノール可燃性です。皮膚に触れた場合、吸入飲み込んだ場合または有毒です。それは、地方機関の要件に従って処分すべき。
注: は常にギムザ染色は急速に低下したらそれが希釈されるのでサンプルの現在のバッチのためにだけ新鮮な作業ソリューションをください。沈殿物が生じた場合は、希薄化後の染色を破棄します。 - ピペット 20 μ L ギムザ染色顕微鏡スライドとも隣接するスライドに 50-100 μ L の生理食塩水の井戸に。
- 蜂、10 mm のマイクロ スプリングはさみを使ってから頭を外し、鉗子とワックス彫刻ペンを使用してワックス剥離プレートをヘッドのフロント側に埋め込みます。目と口の中に 1 つのピンを挿入することによって追加の安定性のワックス板に頭をピンします。
- ピン万力に固定、鋭い壊れやすいかみそりの刃を使用すると、小さな (~ 2-3 mm) 目とフェイス プレートのそれぞれの側の下顎骨の切開。優しくフェイス プレートの下でマイクロはさみを実行し、アンテナと脳との間を実行する触角神経をカットします。
- 微細鉗子を使用して、口でフェイス プレートをつかむ、それをフリップ アップとピンと細かい点鉗子ワックス プレートにピン留め。必要な場合は、完全にフェイス プレートを取り外します。
- カットにピペット 20 μ L の PBS は、頭のセクションを開きます。
注: 腺がこの時点でフロートをまたは 1 つは、それらを検索する必要があります。腺の真珠の文字列のように見える場合はそのまま脳の上にある. - 優しく下咽頭腺 (腺しなくなり、セグメント内で削除するそれを必要とする) の 1 つを削除する超微細ポイント鉗子を使用し、すぐに顕微鏡のスライドにギムザ染色する腺を転送します。
- 5 分、エオジンでインキュベートする腺を許可し、同じスライド上腺を生理食塩水のプールに転送する鉗子を使用します。必要な場合は、小さな断片に腺をマイクロのハサミで切断します。
注: これはできるようになり、簡単に腺房の鮮明な画像を得るため、平坦な平面内腺をさせるのに役立ちます。
2. 下咽頭腺房の測定
- 顕微鏡、測定プログラムを開きます。いない場合に、顕微鏡用光源の電源入れます。顕微鏡の倍率を 10 倍に設定します。
- 腺を見つけるし、コンピューターなしの接眼レンズで拡大に焦点を当てます。60-80 X を拡大し、接眼レンズのイメージに焦点を当てます。
- '取得' タブの下を調整し、腺コンピューター上のライブ イメージに焦点を当てます。
- 'イメージ名ボックスにイメージ名/サンプルの説明、さらに測定の腺のイメージを取得する' イメージの取得 ' をクリックします。
- '分析' タブ選択 '面積ツール' (補足図 1 aの強調表示) を選択し、'値''表示ラベル'も'ユニット' に選択を解除しまの下の選択を解除します。その他のすべての設定を既定 (補足図 1 a) に設定します。
注: ソフトウェアの中には、低倍率から得られた領域は高倍率から得られる同じ自動的に倍率のレベルに応じて面積を調整します。 - 継続的にクリックするか、できるだけ慎重に acinus 境界をトレースしながらマウスの左ボタンを押し続けて各 acinus を測定します。蜂あたり少なくとも 10 房を測定します。
注: 詳細必要があります実験によって (ディスカッションを参照してください)。それは測定のため十分な明確な適切な方向の房を見つけるに腺の複数の画像/セクションを必要があります。 - すべての単一のイメージから房を測定した、'レポートの作成」を選択します。オプション補足図 1 bに示すように、選択をエクスポート] をクリックするを確認します。
- 必要に応じて、レポートを保存します。サンプルのセットのファイルが既に作成されていて、追加の計測が追加されているので、新しいデータは既存のファイルに追加されます、レポート ファイルが開いていないことを確認します。
- 完了したら、顕微鏡カメラと光源をオフします。液体を拭いてくださいと腺顕微鏡スライドをオフし使用される材料を安全に破棄します。蒸留水とスライドを洗い、再利用のためエタノール (水 70 %v/v) で拭いてください。
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Representative Results
下咽頭腺はナース ワーカーから解剖され、60-80 X 倍率 (図 1) で染色と可視化します。無染色の組織に完全に焦点を当てるし、房のエッジを定義する適切なコントラストを見つけることは困難です。ステンド グラスの組織染色組織と白い背景の改良されたコントラストのため、腺管構造のエッジが鋭角で。
図 1: 無染色 (A, B) か (C, D) の染色師高齢労働者から下咽頭腺。腺が両方のケースで表示されている間にステンド グラスの腺がより明確かつ測定が容易になることに注意してください。多少はカール、コイル全体の腺の形態と異なる焦点面になります。腺は、これが発生するを防ぐために切断することができます。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
蜂蜜蜂労働者出現後 ≤18 h で収集された、2 つの異なる食事体制に割り当てられた: 蜂蜜や花粉のないただの蜂蜜を混ぜ春花粉自然ツーソン、アリゾナ州、アメリカ合衆国に存在のダイエット。蜂を巣の中にこれらの食事に制限するためにプッシュで金網の檻に使用された-以前研究13,14で説明するよう、平方センチメートル当たり約 1 つのハチの密度で蜂を拘束します。各食事療法の 3 つのハイブに繰り返された (N = 3)。いずれかの食事の政権にさらされる蜂は、5 d と、働き蜂の解析のための年齢の 8 d で収集されました。郭清、染色と測定法、上記を使用してこれらのミツバチの下咽頭腺房を測定し、比較 (図 2)。3 つのハイブのそれぞれについて、3 つのミツバチはダイエット治療組み合わせ x 年齢ごとに測定しました。10 房測定した各みつばち。房の測定の平均と各蜂蜂あたり平均 acinus サイズを取得するため。これらの値は、そのハイブ治療組み合わせ x 年齢の値を取得する平均だった。Acinus 測定値に分散分析を示したそのダイエット (1, 8F= 2.65、 p = 0.001)、年齢 (F1.8 10.03、 p = = 0.013) と食事の相互作用年齢 x (F1, 8=0.02、 p = 0.020) 重大な影響を持っていた。下咽頭腺がテューキーのによって決定される花粉を飼育したミツバチで時間をかけて育ったことがわかった HSD。このパターンがされている9,11,19で説明しました。ミツバチは花粉を奪われたとき、腺房のサイズは 5 d と 8 日、古い蜂間差はなかった。
図 2: 花粉の奪われた栄養の十分な看護の下咽頭腺サイズ。労働者には、花粉と蜂蜜 (灰色のバー) の食事療法または蜂蜜 5 または 8 d 用 (白棒) だけでの食事を与えられました。この時間の間に蜂ハイブ内、蜂蜜、蜂蜜と花粉をケージします。下咽頭腺房は、前述のように測定しました。誤差範囲は、3 人のコロニーの間で平均 acinus サイズの標準誤差を表す (N = 3) テストします。3 匹の蜜蜂は、ダイエット治療組み合わせ x 治療年齢ごとに各植民地から測定しました。アスタリスクによって接続されているバー、テューキーに従って互いと大幅に異なるの HSD (α = 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ミツバチのハイブから別々 のケージで管理し、定義された飼料も可能します。蜂蜜蜂労働者出現後 ≤ 18 h で採集し、4 つの食餌療法政体の 1 つのアクリル ガラスのケージ (檻あたり 100 蜂) に割り当てられた: 花粉が含まれていない食事や蜂収集した花粉を 3 つのいずれかを含むダイエット: アーモンドから「アーモンド」花粉果樹園の単作、砂漠の植物の組み合わせを含むソノラ砂漠から「砂漠」花粉やコービー ・ ハリスらに記載されている米国南東部に位置する植民地から"SE"花粉12. ショ糖 (50 %w/v)、水、および花粉 (該当する場合) は、自由を提供されました。5 ケージにそれぞれ 20 ケージの合計で 4 つの栄養治療のため建設されました。年齢の 8 d で 10 ミツバチの下咽頭腺、収集および測定します。10 房ごとに測定しました。各みつばちの平均 acinus サイズを計算し、これらの値は、各ケージの平均 acinus サイズを取得する使用されました。下咽頭腺のサイズが国会で花粉の両方の存在に敏感であることがわかった (ない花粉対花粉: t1 5.64 p = < 0.0001) と提供される花粉の種類 (アーモンド対砂漠対SE 花粉。F2,148 8.06、 p = = 0.0005;図 3)。ミツバチ飼育の砂漠またはアーモンドの花粉と同じ腺のサイズがあった。ミツバチは、ミツバチよりも小さい腺はアーモンドまたは砂漠の花粉を供給していた SE 花粉を供給しました。
図 3: 看護師高齢労働者の下咽頭腺サイズ花粉の異なる 3 種類の供給や花粉を奪われた。看護婦に蜂出現後ケージに置かれた、年齢の 8 d までショ糖だけから成る食事 (花粉無し) やショ糖 3 花粉 (アーモンド、砂漠や SE 花粉) の 1 つを与えられました。誤差範囲を表す 5 ケージからサンプリングされた蜂で平均 acinus サイズの標準誤差 (N = 5)。10 蜂を採取し、測定各ケージ ケージの平均 acinus サイズを取得し、ケージの中で変化を計算します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足ファイル 1: 計測ソフトウェアの画面例測定腺房 (A) と (B) レポートを作成中です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
下咽頭腺サイズはタンパク質と国会で花粉の量に敏感で、若い大人のミツバチの栄養の重要なマーカー。ここでは、分析し、この組織を測定する安価で再現性のある方法を示す.これらの組織は、解剖することは困難することができますが、練習では、相対的に無傷のティッシュでますますクリーナー解剖が取得できます。ここで紹介した方法の主な利点は、組織の染色可能各腺 acinus の境界線を明確に視覚化する研究者です。私は、染色することがなくこれらの腺の境界は acinus の正確な測定を取得する研究者の能力を軽減する顕微鏡の下にフォーカスを視覚化して困難です。正確な計測値を得るために考慮すべきいくつかの重要なポイントの染色と、房の明確な画像を得る容易さ、にもかかわらずこれらを以下に示します。
大きな腺は年齢9,20の約 7-10 日にある栄養の十分な看護婦に蜂に由来します。常に、容易に、特に小さい腺、壊れやすい、小さくてを解剖することは困難にすることができます彼らの上に移動する前に大規模な腺を切り裂く最初の練習に、これらの組織を分析する学習です。新鮮な組織はまた最高の解剖を生成できます。1 つは解剖前に期間の蜂をフリーズする必要が、蜂が凍結している長くより壊れやすい組織になることを知っています。これは問題の解剖を行うことができます。実践と鋭い鉗子、研究者は最終的にこれらの問題を克服するに。我々 は冷凍で新鮮な組織染色の違いを気づいていません。
新鮮な汚れは、腺の適切な染色を得るために必要です。正常組織に浸透することができない汚点を残した古い汚れが群生することができます。新鮮な汚れは毎時約小さなバッチで準備することが重要です。これは、組織と定義された acinus エッジを持つ画像をシャープにつながる顕微鏡下で背景の適切なコントラストになります。また、染色による組織の浸透が正しくない場合、汚れの希釈の範囲で動作することをお勧めします。我々 は、1:20 染色作品ベスト、しかし他の希釈の新鮮な在庫の場合は 1 つの暗いまたは明るい汚れ欲望を操作することも分かった。
測定、房のデータを記録する解剖顕微鏡および市販ソフトウェアに接続されているカメラを使いました。カメラとソフトウェアはやや高価であり、したがってできないすべての演習に。イメージを取得し、フリー ソフトウェア18、使用ことができますを含む、いくつかの低コストのオプションがある房を測定するために解剖顕微鏡に接続されているカメラを持っている必要があるが
ここで、示す基本的な染色と下咽頭腺房を測定するための手順が、応力メジャー、1 つまたは両方の腺房を測定するかどうか、各腺の複数の領域を測定するかどうかをどのように多くの腺を決定する研究者までそれ。たとえば、実験的治療の間でより多くの微妙な違いを検出するために 1 つは以上 10 腺腺あたりと治療あたり 10 以上のミツバチを測定する必要があります。我々 は腺上の場所に基づいて房サイズ違いを気づいていません。私たちも気づいていない左または右の腺にある房の大きさの違い。研究者は、任意のサイズの違いを疑う、おそらく両方の腺と下咽頭腺の複数領域が測定べきであります。
研究者は、正常に下咽頭腺のサイズがここに記載した解離性腺組織を染色と房を測定プロトコルを使用して正確な測定を取得できる必要があります。練習では、これらの測定値が得られますより迅速に、複数のサンプルを 1 つに座って処理する研究者を許可します。多くの研究者がさらに下咽頭腺のサイズに影響を与える要因を理解しようとする彼らとどのようにこれらの腺がコロニーの健康と個人の行動に関係をここで説明する方法を採用しております。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、米国農務省アルスから内部の資金によって支えられた (プロジェクト数: 2022-21000-017-00-D)。アルス/米国農務省は、機会均等雇用者とプロバイダーです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
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