Summary
Hypopharyngeal körtel acinus storlek är en robust mått på sjuksköterska honey bee näring. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för dissekera, färgning, imaging och mäta sjuksköterska bee hypopharyngeal körtel acini.
Abstract
Sjuksköterska hypopharyngeal körtlar producerar den protein fraktionen av arbetaren och bidrottninggelé som matas till utveckla larver och drottningar. Dessa ihopkopplade körtlar som är belägna i huvudet av biet är mycket känsliga för kvantiteten och kvalitet av pollen och pollen ersätter att sjuksköterska biet förbrukar. Körtlarna blir mindre när sjuksköterskor utfodras bristfällig kost och är stora när de utfodras komplett kost. Eftersom sjuksköterskan hypopharyngeal körtel storlek är en robust indikator av sjuksköterska näring, är det viktigt att de som studerar honey bee nutrition vet hur man mäter dessa körtlar. Här, tillhandahåller vi detaljerade metoder för dissekera, färgning, imaging och mäta sjuksköterska bee hypopharyngeal körtlar. Vi presenterar jämförelser av ofärgade och färgade vävnad och data som användes för att studera effekterna av pollen på körtel storlek. Denna metod har använts för att testa hur kosten påverkar hypopharyngeal körtel storlek men har ytterligare användning för att förstå rollen som dessa körtlar i kupan hälsa.
Introduction
Honungsbin är nödvändiga för jordbruket eftersom de pollinerar en mängd grödor som konsumeras av människor och djur. Mycket uppmärksamhet har betalats till nedgången av honung bisamhällena som kolonin förluster hover runt 30-40% varje år i USA1 och 10 – 15% i Europa2,3. Flera faktorer, inklusive minskad tillgång till högkvalitativa födosöker, sannolikt agerar tillsammans för att honey bee hälsa påverkas negativt. Monokultur, torka, ohållbara biodling metoder och andra faktorer minska mångfalden och mängden naturliga pollen tillgängliga till kolonierna4,5. Eftersom honungsbin härleda nästan alla deras kosten proteiner och lipider från pollen, kan minskad tillgång till pollen allvarligt begränsa individ och kolonin hälsa.
Hypopharyngeal körtlar är sekretoriska strukturer ligger i biets huvudet mellan ögonen och hjärnan6. Under normala omständigheter, utvecklingsmässiga och funktionella banan för körtlar spegel av biet de ligger i. På cirka 5 – 10 dagars ålder utför biet omvårdnad beteenden i kupan. Under samma tid nå hypopharyngeal körtlar sin topp storlek och sekretoriska kapacitet, producerar den stora protein fraktionen av barnaskara livsmedlet eller gelé som matas till utveckla larver och andra vuxna, såsom drottningen. På denna topp storlek körtlar likna en massa druvor där varje druva är en diskret LOB-struktur som kallas acinus (plural: acini). Som arbetsbi åldrar och tar på olika uppgifter i registreringsdatafilen, hypopharyngeal körtlar krympa och ta på olika funktioner, som att bryta ner socker i nektar7,8. Hypopharyngeal körtlar är därför korrelerade med ålder biet och deras ålder-associerade aktiviteten.
Sjuksköterska hypopharyngeal körtel storlek är känslig för kvantitet och kvalitet av protein i sin kost9,10,11. När sjuksköterska bin är välnärda, är deras körtlar stor. Körtlar är små när biet berövas pollen, särskilt under den första veckan av vuxen utveckling. För att bestämma en sjuksköterska bee näringsmässiga status, forskarna brukar mäta hypopharyngeal körtlar, antingen genom direkt mätning av körteln acinus storlek11,12,13,14 eller protein innehåll15,16 eller genom att mäta proteinet innehåll11 eller vikt färsk17 i hela huvudet där de är belägna. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar. Vi föredrar den resolution som erhållits från mäta de körtel acini, även om denna metod kan vara utmanande på två viktiga sätt. Den första utmaningen är att korrekt identifiera och dissekera körteln. Andra är att få ett korrekt mått på varje acinus. Under en dissekera ljusmikroskop, körtlar visas tydligt eller mjölkaktig vit och gränsar av acini kan vara svårt att definiera. Att ha verktygen för att bättre definiera kanten av acini och öka sannolikheten för korrekt körtel mätningar är fördelaktigt för någon studera honey bee näring.
Här visar vi intresserade forskare hur att dissekera, fläcken, bild, och mäta hypopharyngeal körtlar så att noggranna mätningar av acinus storlek kan uppnås. Metoden beskriver vi erbjuder forskare en lätt, exakt och replikerbar metod för att uppnå flera körtel mätningar i en relativt kort tidsperiod när experimenter praktiseras tillräckligt. Man kan tryggt mäta körtlar i nästan 10 individer i drygt en timme. Vi erbjuder information både om metod och material som krävs för att erhålla dessa mätningar. De viktigaste aspekterna av de metoder som beskrivs nedan är korrekt dissektion och färgning av körtlar. Även om vi fånga de förstorade bilderna och mäta acini med kommersiell programvara, kan de metoder som vi presenterar enkelt anpassas till andra plattformar18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dissekera och färgning Hypopharyngeal körtlar från sjuksköterska arbetstagare
- Göra en vax dissektion tallrik av smältande cool inställningen vaxet i en liten (60 x 15 mm) eller stora (100 x 15 mm) glas petriskål. Cool vax helt innan du använder plattan för dissektioner.
- För varje bee som ska bearbetas, förbereda 20 µL av en 1:20 arbetar Giemsa lösning (1:20 v/v i beredd Giemsa fläcken i fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4)).
FÖRSIKTIGHET: Giemsa fläcken innehåller metanol och är brandfarliga. Det är giftigt vid förtäring, inandning, eller om det kommer i kontakt med huden. Det ska bortskaffas enligt lokala institutets krav.
Notera: Se alltid en fräsch fungerande lösning bara för den aktuella batchen av prover eftersom Giemsa fläcken försämras snabbt när det späds ut. Ignorera utspätt fläcken om en fällning utvecklar. - Pipettera 20 µL Giemsa fläcken i brunnar på objektglas och 50 – 100 µL saline in i bilden intill brunnen.
- Ta loss huvudet från ett bi, med 10 mm micro-våren sax, och bädda in huvudet framsidan upp i vax dissektion plattan med hjälp av tång och en vax-carving penna. Fästa huvudet till vax plattan för ytterligare stabilitet genom att infoga pins i ögonen och en i munnen.
- Med en skarp ömtåliga rakblad fast i en pin vise, göra en liten (~ 2 – 3 mm) snitt mellan ögon och Underkäkar på varje sida av frontplatta. Försiktigt köra micro saxen under frontplatta och skär den antennal nerv som går mellan antennerna och hjärnan.
- Med fin pincett, greppa frontplatta genom munnen, vänd det upp och fästa den på vax plattan med fin punkt pincett och en PIN-kod. Om det behövs, ta bort frontplatta helt.
- Pipettera 20 µL PBS på snittet öppna delen av huvudet.
Obs: Körtlar kan flyta upp vid denna punkt eller man måste söka efter dem. Körtlar ser som ett pärlband och ligger ovanpå hjärnan om intakt. - Använd super fin punkt pincett att varsamt ta bort en av de hypopharyngeal körtlar (körteln kan bryta, som kräver att avlägsnas i segment) och omedelbart överföra körteln till Giemsa fläcken i mikroskopi bilden.
- Tillåta körteln att ruva i Giemsa lösningen för 5 min och sedan använda pincett för att överföra körteln till poolen med koksaltlösning med samma bild. Om det behövs, skär körteln i mindre bitar med micro saxen.
Obs: Detta hjälper till att göra körtlar ligga i ett plattare plan, vilket gör det lättare att få tydliga bilder av de körtel acini.
2. mäta hypopharyngeal körteln Acini
- Slå på mikroskopet och öppna mätprogrammet. Slå på ljuskällan för mikroskopet om den inte redan är på. Ställ in mikroskopet förstoring på 10 X.
- Hitta körtlar och fokusera den förstorade bilden i okularet, utan datorn. Öka förstoringen till 60 – 80 X och fokusera bilden i okularet.
- Under fliken 'Acquire', justera och fokusera körtlar på live-avbilden på datorn.
- Skriv bild namn/prov beskrivning i rutan ' bild ' och klicka 'Förvärva bild' för att ta en bild av körtlar för ytterligare mätningar.
- Välj fliken 'Analys' Välj 'verktyget område' (markerat med kompletterande figur 1A) och avmarkera 'värde' under 'Visa etiketter', som också kommer att avmarkera 'enhet'. Ställa in alla andra inställningar som standard (kompletterande figur 1A).
Obs: Programvaran kalibrerar automatiskt område mätningarna enligt nivån av förstoring så att området erhålls från en lägre förstoring är densamma som den som erhållits från en högre förstoring. - Mät varje acinus genom att kontinuerligt eller kontinuerligt hålla ned vänster musknapp medan spårning acinus omkretsen så noggrant som möjligt. Mäta minst 10 acini per bi.
Obs: Mer kan behövas beroende på experimentet (se diskussion). Det kan kräva flera bilder/avsnitt av körteln att hitta tillräckligt tydlig, korrekt orienterade acini för mätning. - När alla acini från en enda bild har mätts, Välj 'Skapa rapport'. Se till att alternativen är valda som visas i kompletterande figur 1B och klicka på 'Export'.
- Spara rapporten som önskas. Om en fil redan har skapats för uppsättningen av prover och ytterligare mätningar läggs, säkerställa att rapportfilen inte är öppen så att nya data läggs till den befintliga filen.
- När klar, Stäng av mikroskopet kamera och ljuskälla. Torka av vätskan och körtlar av mikroskopi bilderna och kassera alla använda materialet. Skölj glasen med destillerat vatten och torka rent med etanol (70% v/v i vatten) för återanvändning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hypopharyngeal körtlar var dissekeras från sjuksköterska arbetstagare och visualiseras med och utan fläck på 60 – 80 X förstoring (figur 1). I ofärgade vävnad är det svårt att hitta rätt kontrast till fullt fokus och definiera kanterna på acini. I betsad vävnaden är kanterna av acini skarp på grund av förbättrad kontrasten mellan färgade vävnaden och den vita bakgrunden.
Figur 1: ofärgade (A, B) eller bets (C, D) hypopharyngeal körtlar från sjuksköterska-åldern arbetstagare. Observera att medan körtlar är synliga i båda fallen, färgade körtlar är mer väldefinierad och därför lättare att mäta. Observera att den något böjda och ringlade morfologi av hela körteln resulterar också i olika focal plan. Körteln kan vara sektioneras för att förhindra detta. Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Honey bee arbetstagare samlades på ≤18 h efter uppkomst och tilldelades till två olika diet regimer: en diet av våren pollen förekommer naturligt i Tucson, Arizona, USA blandat med honung eller bara honung med inga pollen. För att begränsa bina till dessa dieter medan i registreringsdatafilen, snabbanslutning tråd burar användes — som beskrivits i tidigare studier13,14 — begränsa bina på en täthet av ca en bee per kvadratcentimeter. Varje kosten behandling upprepades i tre kupor (N = 3). Bin utsätts för antingen Dietföreskrifter samlades på 5 d och 8 d ålder för analys av deras hypopharyngeal körtlar. Med hjälp av dissektion, färgning och mätmetoder som beskrivs ovan, de hypopharyngeal körteln acini av dessa bin mättes och jämfört (figur 2). I varje av de tre bikuporna mättes tre bin för varje ålder x kost behandling kombination. Tio acini mättes för varje bee. Acini mätningarna var i genomsnitt för varje bee att få en genomsnittlig acinus storlek per bi. Dessa värden var då i genomsnitt för att erhålla ett värde för åldern x behandling kombination för att kupan. ANOVA analys på acinus mätningar visade att kosten (F1,8= 2,65, p = 0,001), ålder (F1,8 = 10,03, p = 0,013), och samspelet mellan kost x ålder (F1,8= 0,02, p = 0,020) hade signifikanta effekter. Vi observerade att de hypopharyngeal körtlarna växte med tiden i bina som matades pollen, som bestäms av en Tukey HSD. Detta mönster har visat tidigare9,11,19. Storleken på de körtel acini skilde sig inte mellan 5 d och 8 dagar gamla bina när bina berövades pollen.
Figur 2: Hypopharyngeal körtel storlekar välnärda sjuksköterskor och de berövas pollen. Arbetstagare matades en diet av pollen och honung (grå staplar) eller en diet av honung ensam (vita staplar) för 5 eller 8 d. Under denna tid bina var inne i kupan och bur över honung eller honung och pollen. Deras hypopharyngeal körtel acini mättes som beskrivs ovan. Felstaplar representera standardfelet för den genomsnittliga acinus storleken över de tre kolonierna (N = 3) testade. Tre bin mättes från varje koloni för varje behandling ålder x kost behandling kombination. Barer som förbinds med en asterisk är signifikant från varandra enligt en Tukey är HSD (α = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bin kan också hållas i burar separat från kupan och matas definierad kostvanor. Honey bee arbetstagare samlades vid ≤ 18 h efter uppkomst och tilldelades till akrylglas burar (100 bin per bur) med en av fyra kosten regimer: en kost som innehåller inga pollen eller en kost som innehåller en av tre bee-insamlade pollen: ”mandel” pollen från en mandel Orchard monokultur, ”öken” pollen från Sonoraöknen som innehåller en blandning av växter öken eller ”SE” pollen från kolonier ligger i sydöstra USA, som beskrivs i Corby-Harris et al. 12. sackaros (50% w/v), vatten, och pollen (om tillämpligt) tillhandahölls ad libitum. Fem burar konstruerades för var och en av de fyra kosten behandlingar, vilket resulterar i totalt 20 burar. På 8 d ålder, hypopharyngeal körtlar i tio bin samlades in och mätas. Tio acini mättes för varje individ. Den genomsnittliga acinus storleken beräknades för varje bee och dessa värden användes för att få en genomsnittlig acinus storlek för varje bur. Vi observerade att hypopharyngeal körtel storlek är känslig för både förekomsten av pollen i kosten (pollen kontra ingen pollen: t1 = 5,64, p < 0,0001) och typ av pollen som tillhandahålls (mandel vs. öken vs. SE pollen: F2 148 = 8,06, p = 0,0005; (Se figur 3). Bina matas öknen eller mandel pollen hade motsvarande körtel storlekar. Bina matas SE pollen hade körtlar som var mindre än bina matas mandel eller öken pollen.
Figur 3: Hypopharyngeal körtel storlekar av sjuksköterska-åldern arbetstagare matas tre olika typer av pollen eller berövas sin pollen. Sjuksköterska bin placerades i burar efter uppkomst och matades en kost bestående av sackaros ensam (inga pollen) eller sackaros och en av tre pollen (mandel, öknen eller SE pollen) tills 8 d ålder. Felstaplar representera standardfelet för den genomsnittliga acinus storleken i bin som ingick i urvalet från fem burar (N = 5). Tio bin var provtas och mätas i varje bur att få en genomsnittlig acinus storlek för buren och beräkna variationen mellan burar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: skärmdumpar av mättning mjukvaran samtidigt mäta de körtel acini (A) och skapa rapporten (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypopharyngeal körtel storlek är känsliga för mängden protein och pollen i kosten och är en viktig markör för näring i unga vuxna bin. Här visar vi ett billigt och reproducerbart sätt att dissekera och mäta denna vävnad. Dessa vävnader kan vara svårt att dissekera, men med lite övning kan man få allt renare dissektioner med vävnaden relativt intakt. Den största fördelen med den metoden som presenteras här är att vävnaden är målat, som gör det möjligt för forskaren att tydligt visualisera varje körtel acinus gränser. Utan en fläck är gränsar av dessa acini svåra att visualisera och fokusera under mikroskopet vilket minskar forskarens förmåga att erhålla en korrekt acinus mätning. Trots lätthet av färgning och få en tydlig bild för acini, bör flera kritiska punkter övervägas för att erhålla noggranna mätningar; dessa diskuteras nedan.
Stora körtlar kommer från välnärda sjuksköterska bin som är cirka 7 – 10 dagars ålder9,20. Det är alltid lättare, särskilt när lära sig att dissekera dessa vävnader, att första praktiken dissekera stora körtlar innan du flyttar in på mindre körtlar som de kan vara små, ömtåliga och svåra att dissekera. Färsk vävnad ger också de bästa dissektionerna. Om man måste frysa biet för en tidsperiod före dissektion, vet att ju längre att ett bi är fryst, desto mer ömtåliga vävnaden blir. Detta kan göra dissektioner problematiska. Med praxis och vassa pincetten, kommer forskaren så småningom övervinna dessa problem. Vi har inte märkt en skillnad i färgning mellan frysta och färska vävnad.
Färsk fläck är nödvändigt för att erhålla korrekt färgning av körtlar. Äldre fläckar kan klumpa, lämnar fläcken ordentligt genomsyra vävnader. Det är viktigt att färsk fläck förberedas i små partier, ungefär varje timme. Detta kommer att säkerställa ordentlig kontrast mellan vävnaden och bakgrunden under mikroskopet, vilket leder till skarpa bilder med definierade acinus kanter. Det är också bra att arbeta med en rad fläcken utspädningar om fläcken inte genomsyra vävnaden ordentligt. Vi fann att en 1:20 färska arbetar beståndet av fläcken fungerar bäst, men andra spädningar kan också fungera om man önskar en mörkare eller ljusare fläck.
Vi använde en kamera fäst till dissekera mikroskopet och inköpt programvara att mäta och registrera acini data. Kamera och programvara är något kostsam och kan därför inte vara tillgängliga för alla laboratorier. Även om det är nödvändigt att ha en kamera fäst att dissekera mikroskopet för att få bilden och mäta de acini finns flera lägre kostnadsalternativ, inklusive fri programvara18, som kan användas.
Här visar vi grundläggande stegen för färgning och mäta de hypopharyngeal körteln acini, men betonar att det upp till forskaren att välja hur många acini till åtgärd, om att mäta acini på ena eller båda körtlar, och om att mäta flera områden av varje körtel. Till exempel för att upptäcka mer subtila skillnader mellan experimentella behandlingar, kan man behöva mäta mer än 10 acini per körtel och mer än 10 bin per behandling. Vi har inte märkt någon acini storlek skillnader baserade på sina platser på körteln. Vi har också inte märkt några skillnader i storlekar av acini som finns på vänster eller höger körtlar. Om forskaren misstänker någon storlek skillnader, bör flera områden i hypopharyngeal körtel och kanske båda körtlar mätas.
Forskare bör kunna framgångsrikt få noggranna mätningar av hypopharyngeal körtel storlek med hjälp av protokollet som beskrivs här för dissekera och färgning körtel vävnad och mäta acini. Med praxis kan dessa mätningar erhållas ganska snabbt, så att forskaren att bearbeta flera prover i ett sammanträde. Vi förväntar oss att fler forskare kommer att använda de metoder som beskrivs här som de syftar till att ytterligare förstå de faktorer som påverkar hypopharyngeal körtel storlek, och hur dessa körtlar relaterar till kolonin hälsa och individuella beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av interna medel från USDA-ARS (projektnummer: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA är en lika möjligheter arbetsgivare och leverantör.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. vd, et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. Anatomy of the Honey Bee. , Comstock Pub. Associates. (1984).
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
