Mäta Hypopharyngeal körtel Acinus storlek i honungsbiet (Apis mellifera) arbetstagare
Summary
Hypopharyngeal körtel acinus storlek är en robust mått på sjuksköterska honey bee näring. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för dissekera, färgning, imaging och mäta sjuksköterska bee hypopharyngeal körtel acini.
Abstract
Sjuksköterska hypopharyngeal körtlar producerar den protein fraktionen av arbetaren och bidrottninggelé som matas till utveckla larver och drottningar. Dessa ihopkopplade körtlar som är belägna i huvudet av biet är mycket känsliga för kvantiteten och kvalitet av pollen och pollen ersätter att sjuksköterska biet förbrukar. Körtlarna blir mindre när sjuksköterskor utfodras bristfällig kost och är stora när de utfodras komplett kost. Eftersom sjuksköterskan hypopharyngeal körtel storlek är en robust indikator av sjuksköterska näring, är det viktigt att de som studerar honey bee nutrition vet hur man mäter dessa körtlar. Här, tillhandahåller vi detaljerade metoder för dissekera, färgning, imaging och mäta sjuksköterska bee hypopharyngeal körtlar. Vi presenterar jämförelser av ofärgade och färgade vävnad och data som användes för att studera effekterna av pollen på körtel storlek. Denna metod har använts för att testa hur kosten påverkar hypopharyngeal körtel storlek men har ytterligare användning för att förstå rollen som dessa körtlar i kupan hälsa.
Introduction
Honungsbin är nödvändiga för jordbruket eftersom de pollinerar en mängd grödor som konsumeras av människor och djur. Mycket uppmärksamhet har betalats till nedgången av honung bisamhällena som kolonin förluster hover runt 30-40% varje år i USA1 och 10 – 15% i Europa2,3. Flera faktorer, inklusive minskad tillgång till högkvalitativa födosöker, sannolikt agerar tillsammans för att honey bee hälsa påverkas negativt. Monokultur, torka, ohållbara biodling metoder och andra faktorer minska mångfalden och mängden naturliga pollen tillgängliga till kolonierna4,5. Eftersom honungsbin härleda nästan alla deras kosten proteiner och lipider från pollen, kan minskad tillgång till pollen allvarligt begränsa individ och kolonin hälsa.
Hypopharyngeal körtlar är sekretoriska strukturer ligger i biets huvudet mellan ögonen och hjärnan6. Under normala omständigheter, utvecklingsmässiga och funktionella banan för körtlar spegel av biet de ligger i. På cirka 5 – 10 dagars ålder utför biet omvårdnad beteenden i kupan. Under samma tid nå hypopharyngeal körtlar sin topp storlek och sekretoriska kapacitet, producerar den stora protein fraktionen av barnaskara livsmedlet eller gelé som matas till utveckla larver och andra vuxna, såsom drottningen. På denna topp storlek körtlar likna en massa druvor där varje druva är en diskret LOB-struktur som kallas acinus (plural: acini). Som arbetsbi åldrar och tar på olika uppgifter i registreringsdatafilen, hypopharyngeal körtlar krympa och ta på olika funktioner, som att bryta ner socker i nektar7,8. Hypopharyngeal körtlar är därför korrelerade med ålder biet och deras ålder-associerade aktiviteten.
Sjuksköterska hypopharyngeal körtel storlek är känslig för kvantitet och kvalitet av protein i sin kost9,10,11. När sjuksköterska bin är välnärda, är deras körtlar stor. Körtlar är små när biet berövas pollen, särskilt under den första veckan av vuxen utveckling. För att bestämma en sjuksköterska bee näringsmässiga status, forskarna brukar mäta hypopharyngeal körtlar, antingen genom direkt mätning av körteln acinus storlek11,12,13,14 eller protein innehåll15,16 eller genom att mäta proteinet innehåll11 eller vikt färsk17 i hela huvudet där de är belägna. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar. Vi föredrar den resolution som erhållits från mäta de körtel acini, även om denna metod kan vara utmanande på två viktiga sätt. Den första utmaningen är att korrekt identifiera och dissekera körteln. Andra är att få ett korrekt mått på varje acinus. Under en dissekera ljusmikroskop, körtlar visas tydligt eller mjölkaktig vit och gränsar av acini kan vara svårt att definiera. Att ha verktygen för att bättre definiera kanten av acini och öka sannolikheten för korrekt körtel mätningar är fördelaktigt för någon studera honey bee näring.
Här visar vi intresserade forskare hur att dissekera, fläcken, bild, och mäta hypopharyngeal körtlar så att noggranna mätningar av acinus storlek kan uppnås. Metoden beskriver vi erbjuder forskare en lätt, exakt och replikerbar metod för att uppnå flera körtel mätningar i en relativt kort tidsperiod när experimenter praktiseras tillräckligt. Man kan tryggt mäta körtlar i nästan 10 individer i drygt en timme. Vi erbjuder information både om metod och material som krävs för att erhålla dessa mätningar. De viktigaste aspekterna av de metoder som beskrivs nedan är korrekt dissektion och färgning av körtlar. Även om vi fånga de förstorade bilderna och mäta acini med kommersiell programvara, kan de metoder som vi presenterar enkelt anpassas till andra plattformar18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hypopharyngeal körtel storlek är känsliga för mängden protein och pollen i kosten och är en viktig markör för näring i unga vuxna bin. Här visar vi ett billigt och reproducerbart sätt att dissekera och mäta denna vävnad. Dessa vävnader kan vara svårt att dissekera, men med lite övning kan man få allt renare dissektioner med vävnaden relativt intakt. Den största fördelen med den metoden som presenteras här är att vävnaden är målat, som gör det möjligt för forskaren att tydligt visualisera varje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av interna medel från USDA-ARS (projektnummer: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA är en lika möjligheter arbetsgivare och leverantör.
Materials
| Cool setting wax | Grobet USA | 21.450 | |
| Glass petri dish, small | VWR | 89000-310 | |
| Glass petri dish, large | VWR | 89000-314 | |
| Super Max Wax Pen | Eurotool | PEN-520.00 | |
| Breakable razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| pin vise | BioQuip | 4845 | |
| 2A-SA flat/rounded tip forceps | Rubis/BioQuip | 4522 | |
| Fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4523 | |
| 5A-SA super fine point forceps | Rubis/BioQuip | 4525 | |
| 10 mm micro spring scissors | BioQuip | 4715 | |
| 3 mm micro spring Vannas scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Glass Depression Slides, Single Cavity | GSC International | 4-13057-DZ-12 | |
| PBS tablets | VWR | 97062-730 | |
| Giemsa stain, modified solution | Sigma Aldrich | 32884 | |
| Insect pins | ENTO SPHINX S.R.O. | 02.02 | |
| Leica Applications Suite measurement software | Leica Microsystems | any measurement software, including free software, can be used |
References
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
- Zee, R. v. d., et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
- Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
- Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
- Snodgrass, R. E. . Anatomy of the Honey Bee. , (1984).
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1987).
- Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
- DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
- Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
- Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
- Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
- Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
- Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
- Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
- Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).
