Vi præsenterer en metode til påvisning af 3-nitrotyrosine kemiske modifikationer af atmosfærisk proteiner med 6 mm-diameter runder skåret fra luften prøveudtager prefilters ved hjælp af en højtydende liquid chromatography-elektrokemiske detektor (HPLC-ECD).
3-nitrotyrosine (3-NT) er genereret fra tyrosin rester i atmosfærisk bio-aerosol proteiner via en reaktion med ozon (O3) og nitrogendioxid (NO2). Stabil 3-NT er en specifik markør for oxidative skader og er rapporteret at have en sundhedsfremmende effekt at fremkalde allergi. I den foreliggende undersøgelse rapport vi udviklingen af en yderst følsom analyse at kvantificere 3-NT i luften prøveudtager filtre til at indsamle < 2,5 µm af partikler (PM2,5) fra urban miljømæssigt air, herunder bio-aerosol. I denne metode, et 6 mm-diameter runde hul blev skåret fra filtre af luft prøvetagere og blandet med en uspecifik protease cocktail for at hydrolysere proteiner. Protein prøver fordøjet til aminosyre niveau blev testet for 3-NT bruger en højtydende liquid chromatography-elektrokemiske detektor (HPLC-ECD). Maksimalt 3-NT indhold blev fundet i et forfilter til PM i størrelser fra 4,5 til 7,3 μm, med en detektionsgrænse på 1,13 pg/m3.
Aerosol eller luftbårne PM indeholder proteiner fra forskellige biologiske oprindelse, herunder vira, prokaryoter, svampe, planter (pollen) og dyr (insekter, menneskelige)1. Forholdet mellem proteinindhold i PM er anslået til at være næsten 5%, som har været impliceret for at spille en større rolle som en luftbårne allergener2. De seneste rapporter tyder på, at urban omgivende aerosol af forskellige størrelser indeholder aminosyrer med nøgletal mellem 0,5% og 2%3. Derudover er kemiske modifikationer af PM proteiner blevet foreslået til at blive genereret af reaktioner af proteiner med forskellige forurenende stoffer, såsom O3, nitrogendioxid (NO2), svovldioxid (SO2)4.
3-NT — et protein ændring — genereres ved nitrering af tyrosin restkoncentrationer. En højere koncentration af O3 og2 har vist sig at fremme nitrering af proteinmolekyler i pseudo atmosfæriske plads5,6. Nitrering af tyrosin restkoncentrationer i polypeptid kæde forbedrer pollen proteiner7allergifremkaldende potentiale. Kvantificering og vurdering af luftbårne 3-NT er således et vigtigt aspekt i varetagelse af miljø og sundhed.
3-NT er også kendt som en biomarkør af oxidative og nitrosative stress8. En nye række indicier har vist en betydelig sammenslutning af 3-NT indhold med flere menneskelige sygdomme9,10. På grund af dens skadelige virkninger holde påvisning og kvantitativ vurdering af 3-NT i en biologisk prøve stor relevans i fastsættelsen af en persons sundhedsmæssige tilstand. I de seneste år har forskellige metoder er blevet indført for at vurdere 3-NT indhold, herunder enzymmaerket assays, HPLC, og LC/MS11. I tidligere undersøgelser, har vi rapporteret en metode til påvisning ved hjælp af HPLC-ECD teknik skænket med flere fordele i forhold til tidligere metoder. HPLC-ECD kræver for eksempel, ikke en udvinding eller forædling procedure, hvilket gør det til en relativt simpel analyse system12. Vi har bekræftet, at denne metode kan anvendes til at opdage 3-NT fra biologiske prøver (plasma fra mennesker og rat).
Selv om mange undersøgelser har understreget påvisning af 3-NT i biologiske prøver, dens afsløring i nonbiological prøver er fortsat undvigende, og dermed den foreliggende undersøgelse er blevet ført. I virkeligheden, for at vurdere de skadelige virkninger af luftbårne 3-NT, en kvantitativ metode, der er nyttige til at opdage 3-NT direkte fra luftbårne partikler er påkrævet; Derfor, vi anvendte den eksisterende HPLC-ECD metode til at registrere 3-NT fra PM2.5 indsamlet på en glas-fiber filter. Ved hjælp af den teknik, 3-NT kunne påvises direkte fra små stykker (6 mm-diameter runde huller) i eksemplet fra en PM samling filter. Vi yderligere vurderet indholdet af 3-NT for forskellige PM størrelser og målt detektionsgraensen for 3 NT. Denne artikel foreslår en høj-følsomme og høj overførselshastighed metode til påvisning af 3-NT direkte fra både nonbiological og biologiske prøver.
I denne artikel beskrives en kvantificering metode til at vurdere 3-NT i luftbårne PM indsamlet på quartz-filtre ved hjælp af meget følsomme HPLC-ECD teknikker.
Generelt er 3-NT målemetoder blevet udviklet som biomarkører for oxidativt stress i menneskelige sygdomme. Antistof-baserede metoder (fx, enzym-forbundet immunosorbent assay) betragtes som semi-kvantitative, fordi der er ingen strenge assay validering og det er vanskeligt at vurdere testens pålidelighed. HPLC med elektrokemisk detektion (ECD) og massespektrometri-baseret assays har tilstrækkelig følsomhed til kvantificering af 3-NT13. Selv om de er følsomme, massespektrometri-baseret metoder som GC-MS eller GC-MS/MS kræver forædling af aminosyrer, og processen med forædling ofte resulterer i dannelsen af artefakter14.
I forhold til både GC og LC teknikker, HPLC-ECD er relativt billigere og har en tilstrækkelig følsomhed til foranstaltning 3-NT. Derudover trinnet forædling i GC-MS og LC-MS ofte kræver ekstra tid. Selvom metoden præsenteres her kræver 16 timer for protein fordøjelse skridt, det kan, alligevel udføres natten over (som beskrevet ovenfor, ca. 30 minutters hands-on tid er påkrævet per prøve). Automatisk gentage måling ved hjælp af en autosampler kan give en høj overførselshastighed målesystem. Tidligere undersøgelser har rapporteret immunologiske metoder til at måle 3-NT i PM2,7; men sådanne metoder kunne ikke registrere 3-NT i vinterhalvåret på grund af det lave niveau af 3-NT i PM15.
Metoden HPLC-ECD har yderligere fordele i forhold til andre standard metoder; for eksempel, a en udpakningen er ikke påkrævet i denne metode, (ii) det er helt vaskemiddel-fri, (iii) det har minimal prøve krav og, vigtigere, (iv) det har høj følsomhed. Partikler, der er indsamlet på filtre er ofte adskilt ved hjælp af sonikering for yderligere undersøgelser, herunder kvantificering af forskellige komponenter. Vaske-og rengøringsmidler er også brugt til at isolere PM-bundet proteiner fra filtre. Men disse yderligere trin øge risikoen for kontaminering, prøve tab og undervurdering skyldes ekstraktionseffektivitet, og derudover de fleste rengøringsmidler er inkompatible med LC/MS. I den nuværende HPLC-ECD metode, kan HPLC prøver let adskilles fra filteret, ved hjælp af en simpel hul punch og uden behov for en ekstra prøve forberedelsesprocessen. Området i den runde-formet prøve er 28,3 mm2, som er meget lille sammenlignet med størrelsen af den oprindelige quartz-filter (8 x 10 tommer = 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2).
HPLC-ECD betingelse er blevet gennemgået omhyggeligt for at undgå interferens med 3-NT signal, som tidligere beskrevet12. En stærk sure pH-værdi af mobil fase og en tilstrækkelig koncentration af acetonitril er vigtigt for registrering. Ved hjælp af disse betingelser, kan andre forbindelser, herunder nitro base, adskilles fra nitrotyrosine. Den nuværende tilstand er egnet til påvisning af 3-NT fra prøver med en anden fysisk egenskab (fx, partikler og plasma).
For at vurdere 3-NT i luften, måling af filter vægt og fjernelse af baggrunden er kritiske trin. Generelt er over ca. 100 mg PM7 indsamlet over en periode på fire til syv dage; imidlertid påvirker flere faktorer filter vægten før og efter samlingen PM7 , herunder fugtighed og statisk elektrisk ladning. For at undgå disse virkninger, er stabilisering af filter vægten i lange perioder nødvendige under subequal temperatur og fugtighed. Den placering, hvor den elektroniske balance er installeret bør opretholdes i et stabilt miljø. For prøveforberedelse er det vigtigt at rette baggrundseffekter fra de uspecifikke protease cocktail og ultrafiltrering membran, som ofte viser en lignende top 3-NT.
Denne metode kan anvendes på andre partikler, herunder i indendørs miljøer. Nitrering af proteiner kan øge deres allergifremkaldende potentiale2. Derfor, denne metode kan bidrage til at evaluere miljøet renlighed og forebygge nitrosative stress.
I denne undersøgelse rapport vi en yderst følsom målemetode for atmosfærisk 3-NT af sampler luftfiltre med let at håndtere og billige apparater. Generation af 3-NT i atmosfæren er forbundet med miljøforurening som O3, ingen2, PM proteiner og meteorologiske elementer, der påvirker menneskelige allergenicitet. Afslutningsvis kan metoden udviklet i denne undersøgelse bidrage til at vurdere den atmosfæriske reaktion O3, forskellige forurenende stoffer og PM proteiner under forskellige vejrforhold. Med disse bestræbelser for at udvikle HPLC-ECD for en vurdering af 3-nitrotyrosine i atmosfæren, forventer vi bedre miljømæssige renlighed, forbedring af menneskers sundhed.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Masayuki Kubo af den US Environmental Protection Agency for hans hjælp med TSP/PM2.5 prøveudtagning. Dette arbejde blev delvist understøttet af JSP’ER KAKENHI tilskud antal JP16K15373 og JP18H03039.
Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
Data processor | Eicom | EPC-300 | |
Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |