Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

利用高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中的 3-硝基酪氨酸

doi: 10.3791/58371 Published: January 30, 2019

Summary

我们提出了一种方法来检测 3-硝基酪氨酸化学修饰大气蛋白质与6毫米直径的圆形从空气采样器预过滤器切割使用高效液相色谱-电化学检测器 (hplc-ecd)。

Abstract

3-硝基酸 (3-nt) 是通过与臭氧 (o3) 和二氧化氮 (no) 的反应而产生的大气生物气溶胶蛋白中的酪氨酸残留量.稳定的3-nt 是氧化损伤的一个特定标记, 据报道, 有促进过敏的作用。在本研究中, 我们报告了一种高度敏感的检测方法, 用于量化空气采样器中的3-nt 过滤器, 以收集从城市环境空气中 < 2.5μm 的颗粒物 (pm2.5), 包括生物气溶胶。该方法从空气采样器的过滤器中切割出直径为6毫米的圆孔, 并与非特异性蛋白酶鸡尾酒混合, 以水解蛋白质。使用高效液相色谱-电化学检测器 (hplc-ecd) 对3-nt 消化到氨基酸水平的蛋白质样品进行了测试。在4.5 至7.3μm 尺寸 pm 的预过滤器中检测到了最大的3-nt 含量, 检出限为 1.13 pg/m3。

Introduction

气溶胶或空气中的 pm 含有来自各种生物来源的蛋白质, 包括病毒、原核生物、真菌、植物 (花粉) 和动物 (昆虫、人类) 1。在 pm 中的蛋白质含量的比例估计接近 5%, 这被认为是空气中的过敏原2的主要作用.最近的报告表明, 不同大小的城市环境气溶胶中含有氨基酸, 其比率在0.5% 至2% 之间.此外, pm 蛋白的化学修饰被认为是由蛋白质与各种污染物 (如 o3、二氧化氮 (no 2) 和二氧化硫 (so2)4等的反应所产生的

3-nt--蛋白质修饰--是由酪氨酸残基的硝化产生的。在伪大气空间 5 , 6 中, o 3 和 no2的浓度较高,促进了蛋白质分子的硝化。多肽链中酪氨酸残基的硝化增强了花粉蛋白的过敏性潜力7。因此, 对机载3-nt 的量化和评估是解决环境健康问题的一个重要方面。

3-nt 也被称为氧化和非硝化应激的生物标志物8。一个新出现的证据表明, 3-nt 含量与几种人类疾病显著关联.由于其有害影响, 生物样本中3-nt 的检测和定量估计对确定个人健康状况具有重要意义。近年来, 采用了多种方法来估计3-nt 的含量, 包括酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和 lcn/ms11 法。在前面的研究中, 我们报告了一种使用 hplc-ecd 技术的检测方法, 与以前的方法相比, 它具有多种优点。例如, hplc-ecd 不需要提取或衍生化程序, 这使得它成为一个相对简单的检测系统12。我们已经证实, 这种方法适用于检测生物样本 (人和大鼠的血浆) 中的3-nt。

虽然许多调查都强调在生物样本中检测 3-nt, 但在非生物样本中检测到的方法仍然遥遥无期, 因此本研究一直在进行中。事实上, 为了评估空气中的3-nt 的有害影响, 需要一种定量的方法, 有助于直接从空气中的颗粒检测 3-nt;因此, 我们应用现有的 hplc-ecd 方法从在玻璃纤维过滤器上采集的 pm2.5检测3-nt。通过使用该技术, 可以直接从 pm 收集过滤器中检测到样品的小块 (直径为6毫米的圆孔)。进一步评估了不同 pm 尺寸的3-nt 含量, 并测量了3-nt 的检出限。本文提出了一种高灵敏度、高通量的方法, 可以直接从非生物样品和生物样品中检测3-nt。

Protocol

1. 总悬浮粒子、pm2.5或 pm7 的收集, 以及 pm 蛋白的水解方法

  1. 从预筛选器或备份筛选器收集 pm。
    1. 在收集总悬浮颗粒 (tsp)、pm2.5和 pm7之前, 对石英滤清器进行称重。
      注: 鉴于 pm 蛋白和肽的污染不应影响酪氨酸硝化的检测 (因为它们缺乏这样的硝基组), 我们在测量前没有在高温下处理石英过滤器。此外, 石英滤清器中的3-nt 含量低于 hplc-ecd 确定的检测极限。
    2. 将石英滤清器设置在具有粒径选择器的大容量空气采样器上, 以 1, 000 lmmin 的流量连续收集 pm7 , 持续为 7d (图 1 b)。tsp 可以在没有尺寸选择器的石英过滤器上收集 (图 1a)。
    3. 使用小体积空气采样器收集 pm 2.5, 其尺寸分类单元连续为 116 lmin, 流量为 7d. 使用该装置, 颗粒可分为 pm4.5-2.5、pm7.5-4.5、pm 15-7.3 和 tspp-pm15并收集到石英过滤器进行分类。pm2.5可以收集到备份筛选器 (图 1c)。
    4. 记录筛选器收集时的总流量。通过从收集后的权重中减去预紧重量, 测量过滤器上 tsp、pm2.5和 pm7的重量。将过滤器密封在塑料袋中, 并将其存放在-30°c, 直到下一步 (见第2节)。
  2. 蛋白质溶解样品。
    1. 用 0.1 m 醋酸盐缓冲液 (ph 7.4) 溶解非特异性蛋白酶鸡尾酒。将溶液放入透析膜 (分子量截止 = 5, 000 达) 中, 在4°c 下搅拌, 将其浸入1升 0.1 m 醋酸盐缓冲液中。每12小时更换2倍缓冲液, 然后在夜间进行透析, 以去除内源性3-nt 和亚硝酸盐 (no2-)。透析后, 采用双氯酸 (bca) 蛋白法收集溶液, 测定蛋白质浓度。
    2. 从预过滤器或备用滤清器中打出6毫米的圆圆, 并将其放入微管中。分析最多可使用 5个6毫米分数的部分 (图 2)。
    3. 在试管中加入 300μl 0.1 m 醋酸盐缓冲液, 其中含有50微克的蛋白质, 1.2.1 步骤制备), 在50°c 时旋转16小时水解 pm 蛋白。
      注: 要从非特异性蛋白酶鸡尾酒溶液中减去内源性 3-nt, 有必要制备和消化仅有特异性蛋白酶的鸡尾酒样本。
    4. 由于在膜中污染了类似于 3 nt 的化学物质, 通过添加 0.1 m 醋酸盐缓冲液和离心 (10, 000 x g 30秒; 确切速度取决于膜), 将超滤膜及其供应的管冲洗。重复冲洗1x。
    5. 在蛋白质溶解后, 将样品以 2, 500 x 克的速度离心 10分钟, 将上清液装入超滤膜, 并以 10, 000 x 克和4°c 的温度离心进行超滤 (mwco = 10, 000), 直到收集到足够的洗脱量。将凹漆存放在4°c 的黑暗中。
      注意: 由于在自旋柱中检测到与3-nt 相似的峰值, 因此在使用前必须用干净的水或使用高效液相色谱水和 0.1 m 醋酸盐缓冲液等缓冲液将其洗好。

2.通过高效液相色谱和电化学检测 (hplc-ecd) 系统测定 tsp、pm2.5和 pm7中的3-nt 含量

注意: 请参见图 3

  1. 准备移动阶段。
    1. 制备 0.2 m 磷酸盐缓冲液 (ph 值 2.5), 含有 50 mg/l edta。测量98卷缓冲液和两卷乙腈 (hplc 级), 将其倒入干净的玻璃瓶中, 并与瓶盖大力混合。
    2. 在室温下设置流动阶段数小时, 直到溶解的空气变平。
      注意: 如果系统启动较早, 移动相位可以在真空下进行声纳和脱气。然而, 过度脱气会通过蒸发改变水和有机相之间的比例。
  2. hplc-ecd 系统由泵、高效液相色谱柱、脱气器、ecd 和喷油器组成。平衡移动相位, 稳定系统, 减少背景和噪音。
    1. 在高效液相色谱系统中安装流动相和高效液相色谱柱。打开高效液相色谱泵, 在25°c 柱温度下, 从开始的前一天起, 将流动相的柱稳定在500μlmmin 的温度下。
    2. 第二天, 点燃 ecd 并设置参数 (降低电压为-900 mv, 励磁电压为 400 mv)。稳定它至少3小时。
  3. 测量下午7中的3-nt 浓度。
    1. 在 0.1 m 醋酸盐缓冲液中制备各种浓度的3-nt 标准 (5-500 nm) 和空白 (没有3-nt 标准和非特异性蛋白酶鸡尾酒, 以确保小瓶和缓冲液都不被污染)。
    2. 运行高效液相色谱数据处理器。
    3. 将样品瓶放入自动喷射器中, 并将注射体积设置为 25μl. 操作步骤2.2.1 中提到的相同的移动相位和流速条件。
      注: 如果样品制备完成, 应该有样品、标准样品 (5-500 nm)、仅有非特异性蛋白酶鸡尾酒的样品和一个空白小瓶。
    4. 确保色谱图中的基线为平坦, 并开始样品注射。
      注: 一般情况下, 3-nt 在20-21分钟内被检测到;但是, 建议使用大约30分钟作为每个样品注入的运行时间。否则, 污染物峰值将包括在下一次运行中。

3. pm 中3-nt 含量的色谱分析和定量 7

  1. 检查色谱图中的3-nt 峰值并计算内容。
    1. 数据收集完成后, 使用分析软件打开色谱数据文件。
    2. 从平坦基线绘制一条穿过3-nt 峰值的线, 并从绘制的线读取峰值高度。
      注: 定量极限约为 5 nm (25μl 注射中的 125 fmol)。
      注意: ecd 中的电极会慢慢耗尽, 并且由于 sw 比的原因, 电极的极限会很高。
    3. 从3-nt 标准峰值准备一条回归线, 计算斜率, 并拦截。
    4. 将这些常数分配到下面的公式中, 并计算样本中的3-nt 内容, 如下所示。
      样本 3–nt (nm) = [样品峰–截距]/斜率 eq. (1)
      注: 标准曲线应很好地表示为 5 nm 和 500 nm 之间的直线。
  2. 计算空气环境中的3-nt 和样品小瓶中的 pm 7。
    1. 将3-nt 浓度乘以反应体积 (和稀释系数 (如果有的话), 并从圆圈评估 pm 7 中的绝对3-nt 含量。
    2. 测量收集的过滤面积, 并通过以下公式计算总 pm 7 过滤器中的3-nt 含量。
      总 pm7 = [3-nt 含量在 pm7的圆] x [pm7过滤面积与圆面积的比率] x 226.19 (在摩尔转换为克的情况下) eq (2)
    3. 通过将 pm 7 除以总气流量或 pm7重量 (按步骤1.1.3 记录 ) 来评估空气环境中的3-nt 含量或 pm7

Representative Results

hplc-ecd 原理很简单。用高效液相色谱柱和流动相分离含有目标的样品, 在电化学检测器中减少和氧化分离的目标化合物。

在 hplc-ecd 系统中, 大约22分钟内检测到3-nt 峰值。ecd (pec-510 和 htec-500) 在 hplc 生产线上串联在一起。第一 ecd 减少了化合物中的羟基, 下一种方法氧化了还原的化学物质。ecd 具有 10-15 m 的高度敏感检测范围。hplc-ecd 系统的检测极限为 1.13 pg/m, 计算为10部分 x 3 的平均基部信号 (mv)。

图 4显示了代表性色谱图。通过分析纯3-nt 标准, 可以检测到具有稳定基线的确定峰 (图 4 a)。在下午7的3-nt 也测量使用6毫米, 圆形样品 (图 4b)。

在3-nt 检测能力的准确性方面, 在高效液相色谱中注入3-nt 标准时, 在20分钟的保留时间内检测到与3-nt 相对应的峰值。在 pm 样品中, 从其他物质中分离出 3-nt, 并在与标准相同的保留时间检测到独立峰。典型的标准曲线如图 5所示, 其中线性度在5到 40 nm 之间。线性度可达 500 nm (未显示数据)。

表 1显示了大气中的3-nt 含量, 计算为 pgm 3空气。在 #3 (pm7.3-4.5)中, pm2.5预过滤器中3-nt 的最高浓度。

Figure 1
图 1: tsp、pm7和 pm2.5的收集方案.(a) 总悬浮颗粒 (tsp) 直接收集到收集过滤器上 (流量为 1, 000 l/min)。(b) 收集 pm7时, 大颗粒由大小选择器排除 (流速为 1, 000 lmmin)。(c) pm2.5通过四个预过滤器收集 (流量为 116 lp min)。石英滤清器通常用作 pm7和 pm 2.5 的备份滤波器, 或作为 tsp集合滤波器, 如下图所示。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 准备一个6毫米圆的圆圈.收集过滤器是使用直径为6毫米的空心冲床工具切割的。然后, 样品被储存在一个 1.5 ml 的微管中。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: hplc-ecd 系统示意图.在流动相流动的高效液相色谱柱中分离出注射样品中的3-nt。3-nt 被还原为氨基肌酸, 氧化为咪亚氨酸, 并在检测器中检测到电化学。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: hplc-ecd 系统中的典型色谱图.(a) 由 hplc-ecd 系统进行纯3-nt 分析。(b) 用于检测3-nt 的 pm 7过滤器中的6毫米圆样品。一个3-nt 的峰值由一个箭头表示。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 纯3-nt 样品的标准曲线.浓度较低的结果在另一张图中显示。请点击这里查看此图的较大版本.

主题 的天数
收集
3-nt
(3 空气)
pm2。5 预过滤器 #1 27 4个 8.25±0.37
预过滤器 #2 27 4个 29.66±1.94
预过滤器 #3 27 4个 74.37±4.09
预过滤器 #4 27 4个 32.70±0.75
背光 7。 5 4.21±0.91
pm7 背光 7。 1 8916±6.36
Tsp 滤波器 7。 1 10.34±2.09

表 1:3-nt 在大气中的 hplc-ecd 系统测量.利用 hplc-ecd 系统测量了每个滤清器的6毫米圆点。在同一时期收集了预过滤器 #1-#4。请注意, 空气中3-nt 的浓度受各种因素的影响, 如收集的日期、年份或位置。数据 (n = 3-10) 表示为标准误差的均值±。

Discussion

本文介绍了一种利用高灵敏度的 hplc-ecd 技术对石英滤清器上采集的机载 pm 中的3-nt 进行定量评价的方法。

一般情况下, 3-nt 测量方法已发展成为人类疾病氧化应激的生物标志物。基于抗体的方法 (例如, 酶联免疫吸附法) 被认为是半定量的, 因为没有严格的检测验证, 很难评估测试的可靠性。高效液相色谱法采用电化学检测 (ecd) 和质谱分析, 对 3-nt13的定量具有足够的灵敏度。虽然它们是敏感的质谱方法, 如 gc-ms 或 gc-msms 需要氨基酸的衍生, 而衍生化过程往往导致伪影14的形成.

与气相色谱和 lc 技术相比, hplc-ecd 的成本相对较低, 对测量3-nt 有足够的敏感性. 此外, gc-ms 和 lc-ms 的衍生步骤通常需要更多的时间。虽然这里介绍的方法需要16个小时的蛋白质消化步骤, 但它可以进行一夜之间 (如上所述, 每个样本大约需要30分钟的动手时间)。使用自动采样器进行自动重复测量可以提供高通量测量系统。此前的研究报告了在下午2,7中测量3-nt 的免疫学方法;然而, 由于下午1 5日的3-nt 含量较低, 这种方法在冬季无法检测到3-nt。

与其他标准方法相比, hplc-ecd 方法具有额外的优势;例如, (i) 这种方法不需要提取工艺, (二) 它完全不含洗涤剂, (三) 它的样品要求很小, 重要的是, 它具有较高的灵敏度。收集到过滤器上的粒子经常用声纳分离, 以便进一步研究, 包括对各种成分进行量化。洗涤剂还可用于从过滤器中分离出 pm 结合蛋白。然而, 这些额外的步骤增加了污染的风险, 样品损失, 并低估了由于提取效率, 而且, 大多数洗涤剂是不兼容的 lc/ms。在目前的 hplc-ecd 方法中, 采用简单的空心冲床, 无需额外的样品制备工艺, 即可轻松地将高效液相色谱样品从滤清器中分离出来。圆形样品的面积为28.3 毫米2, 与原来的石英过滤器的尺寸相比非常小 (8 x 10 英寸 = 203.2 x 254毫米 =56, 600 毫米 2)。

如前述, 已仔细审查了 hplc-ecd 条件, 以避免干扰3-nt 信号。流动相的强酸性 ph 值和适当浓度的乙腈对检测非常重要。利用这些条件, 其他化合物, 包括硝基碱, 可以从硝基化合物中分离出来。目前的情况适用于从具有不同物理性质 (颗粒物和等离子体) 的样品中检测3-nt。

为了评估空气中的 3-nt, 测量过滤器重量和消除背景是关键的步骤。一般来说, 大约100毫克的 pm7是在四到七天的时间内收集的;但是, 在 pm7收集前后, 有几个因素会影响滤清器的重量, 包括湿度和静电电荷。为了避免这些影响, 在等远等温度和湿度下, 滤清器重量需要长时间稳定。安装电子天平的地点应保持在稳定的环境中。对于样品制备, 纠正非特异性蛋白酶鸡尾酒和超滤膜的背景效应非常重要, 因为超滤膜通常显示出与3-nt 相似的峰值。

该方法可应用于其他颗粒, 包括室内环境中的颗粒。蛋白质的硝化可能会增加它们的过敏性潜力2。因此, 该方法有助于评价环境清洁度, 防止硝化应激。

在本研究中, 我们报告了一种高度敏感的测量方法大气3-nt 空气采样器过滤器易于操作和廉价的仪器。在大气中产生3-nt 与影响人类过敏性的环境污染物 (如 o3、no2、pm 蛋白和气象元素) 有关。总之, 本研究开发的方法可能有助于评估 o3、各种污染物和 pm 蛋白在各种气象条件下的大气反应。通过开发 hplc-ecd 来估计大气中的 3-硝基酪氨酸, 我们期望更好的环境清洁, 改善人类健康。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢美国环境保护署的 masayuki kubo 在 tspypm2.5采样方面提供的帮助。这项工作得到了 jsps kakenhi 赠款号码 JP16K15373 和 JP18H03039 的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, (1), 15-26 (2012).
  2. Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39, (6), 1673-1678 (2005).
  3. Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14, (1), 155-161 (2016).
  4. D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62, (9), 976-990 (2007).
  5. Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35, (9), 1791-1797 (2001).
  6. Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46, (12), 6672-6680 (2012).
  7. Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141, (3), 265-275 (2006).
  8. Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. Humana Press. 149-158 (2014).
  9. Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
  10. Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89, (3), 529-536 (2004).
  11. Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
  12. Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141, (4), 495-502 (2007).
  13. Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61, (4), 181-189 (2007).
  14. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827, (1), 146-156 (2005).
  15. Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
<em>利用</em>高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中的 3-硝基酪氨酸
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).More

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter