Summary
Nous présentons une méthode pour détecter des modifications chimiques des protéines atmosphériques 3-nitrotyrosine avec 6 mm de diamètre tours coupés d’air échantillonneur préfiltres à l’aide d’un détecteur électrochimique-chromatographie liquid haute performance (HPLC-DCE).
Abstract
3-nitrotyrosine (3-NT) est généré à partir du résidu tyrosine en bio-aérosols atmosphériques protéines via une réaction avec l’ozone (O3) et de dioxyde d’azote (NO2). 3-NT stable est un marqueur spécifique des dommages oxydatifs et aurait un effet promoteur pour provoquer des allergies. Dans la présente étude, nous rapportons l’élaboration d’un dosage très sensible pour quantifier 3-NT dans les filtres à air échantillonneur de recueillir < 2,5 µm de particules fines (PM2.5) de l’air environnement urbain, y compris les bio-aérosols. Dans cette méthode, un diamètre de 6 mm trous ronds fut coupé des filtres des échantillonneurs d’air et mélangés avec une cocktail de protéase non spécifique afin d’hydrolyser les protéines. Les échantillons de protéines digérées au niveau des acides aminés ont été testés pour 3-NT à l’aide d’un détecteur électrochimique-chromatographie liquid haute performance (HPLC-DCE). La teneur maximale en 3-NT a été détectée dans un préfiltre pour les particules de tailles de 4,5 à 7,3 µm, avec une limite de détection de 1,13 pg/m3.
Introduction
Aérosol ou aéroportée PM contient des protéines de différentes origines biologiques, y compris les virus, les procaryotes, champignons, plantes (pollen) et animaux (insectes, homme)1. Le rapport entre la teneur en protéines de PM est estimée à près de 5 %, ce qui a joué un rôle à jouer un rôle majeur comme un allergène aéroporté2. Des rapports récents suggèrent qu’aérosol ambiant urbain de diverses tailles contiennent des acides aminés avec ratios variant entre 0,5 % et 2 %3. En outre, des modifications chimiques des protéines de PM ont été suggérées pour être générés par les réactions des protéines avec divers polluants, tels que O3, dioxyde d’azote (NO2) et le dioxyde de soufre (SO2)4.
3-NT — une modification des protéines — est généré par la nitration des résidus tyrosine. Une concentration plus élevée de O3 et NO2 a été démontrée pour promouvoir la nitration des molécules de protéine dans l’espace pseudo-atmosphérique5,6. La nitration des résidus de tyrosine dans la chaîne polypeptidique améliore le potentiel allergène de pollen protéines7. Ainsi, la quantification et l’évaluation d’aéroporté 3-NT est un aspect important en répondant aux préoccupations de santé environnementale.
3-NT sont également connu sous le nom des biomarqueurs de l’oxydant et nitrosative insiste sur8. Un corps émergent de la preuve a montré une association significative de la teneur en 3-NT avec plusieurs maladies humaines9,10. En raison de ses effets néfastes, la détection et l’estimation quantitative des 3-NT dans un échantillon biologique tenir grande utilité dans la détermination de l’état de santé d’un individu. Ces dernières années, diverses méthodes ont été introduites pour estimer la teneur en 3-NT, y compris les dosages immuno-enzymatiques, HPLC et LC/MS11. Dans des études précédentes, nous avons rapporté une méthode de détection en utilisant la technique HPLC-DCE conférée avec plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes. Par exemple, l’HPLC-DPE ne nécessite pas une procédure d’extraction ou de dérivation qui en fait un système relativement simple test12. Nous avons confirmé que cette méthode est applicable pour détecter 3-NT à partir d’échantillons biologiques (plasma de l’homme et le rat).
Bien que de nombreuses enquêtes ont insisté sur la détection des 3-NT dans des échantillons biologiques, sa détection dans des échantillons non biologiques reste insaisissable, et c’est pourquoi la présente étude a été poursuivie. En fait, pour évaluer les effets néfastes des aéroportés 3-NT, une méthode quantitative qui permet de détecter 3-NT directement à partir de particules est nécessaire ; par conséquent, nous avons appliqué la méthode HPLC-DCE existante pour détecter 3-NT de PM2.5 recueillies sur un filtre en fibre de verre. À l’aide de la technique, 3-NT a pu être détectée directement à partir de petites pièces (trous ronds de 6 mm de diamètre) de l’échantillon d’un filtre de collecte des PM. Plus loin, nous avons évalué le contenu de 3-NT pour différentes tailles de PM et mesurée à la limite de détection de 3-NT. Le présent article propose une méthode haute sensibilité et le haut débit pour détecter 3-NT directement à partir des échantillons tant biologiques et non biologiques.
Protocol
1. collection de Total suspendu particules PM2,5, ou PM7et la méthode d’hydrolyse de protéines de PM
- Recueillir le PM d’un filtre pré-filtre ou de sauvegarde.
- Avant la collecte de particules totales en suspension (TSP) et PM2,5PM7, peser le filtre à quartz.
Remarque : Étant donné que la contamination par les peptides et les protéines de PM ne devrait pas affecter la détection de la nitration de la tyrosine (car ils n’ont pas un tel groupe de nitro), on n’a pas traité le filtre quartz à haute température avant la mesure. En outre, 3-NT contenu dans le filtre à quartz a été sous la limite de détection, tel que déterminé par HPLC-DCE. - Définissez le filtre quartz sur un échantillonneur d’air grand volume avec un sélecteur de taille de particule de recueillir PM7 à un débit de 1 000 L/min en continu pendant 7 jours (Figure 1 b). TSP peut être recueillie sur un filtre quartz sans un sélecteur de taille (Figure 1 a).
- Recueillir des PM2,5 en utilisant un échantillonneur d’air de faible volume avec une unité de classification de taille à un débit de 116 L/min en continu pour 7 d. à l’aide de cet appareil, les particules peuvent être classés comme PM4,5 à 2,5PM7.3-4.5, PM15-7,3et TSP-PM15 et collecté sur des filtres de quartz pour la classification. PM2.5 peuvent être collectées sur un filtre de sauvegarde (Figure 1).
- Noter le volume de débit total au moment de la collecte de filtre. Mesurer le poids de la FST, PM2,5et PM7 sur les filtres en soustrayant le poids précollecte du poids postcollection. Sceller le filtre dans un sac plastique et conserver à-30 ° C jusqu'à l’étape suivante (voir chapitre 2).
- Avant la collecte de particules totales en suspension (TSP) et PM2,5PM7, peser le filtre à quartz.
- Proteolyze les échantillons.
- Dissoudre le cocktail de la protéase non spécifique avec un tampon d’acétate 0,1 M (pH 7,4). Mettre la solution dans une membrane de dialyse (poids moléculaire coupure = 5 000 Da) et plongez-le dans 1 L de tampon acétate 0,1 M en agitant à 4 ° C. Remplacer le tampon 2 x toutes les 12 h et puis effectuez dialyse pendant la nuit afin d’éliminer 3-NT endogène et nitrite (NO2–). Après la dialyse, recueillir la solution et à mesurer la concentration de la protéine par bicinchoninic acide dosage des protéines (BCA).
- Perforer des cercles ronds de 6 mm sur le préfiltre ou le filtre sauvegarde et mettez-les dans des microtubes. Jusqu'à cinq morceaux des fractions de 6 mm peut être utilisé pour l’analyse (Figure 2).
- Ajouter 300 µL de tampon d’acétate 0,1 M contenant 50 µg de protéines de la protéase non spécifique cocktail (préparé à l’étape 1.2.1) au tube d’hydrolyser les protéines de PM à 50 ° C pendant 16 h avec rotation.
Remarque : Pour soustraire endogène 3-NT de la solution cocktail de protéase non spécifique, il est nécessaire de préparer et de digérer un échantillon de cocktail uniquement de protéase non spécifique. - Rincer la membrane d’ultrafiltration avec son tube fourni en ajoutant 0,1 M de tampon acétate et centrifugation (10 000 x g pendant 30 sec ; la vitesse exacte dépend de la membrane), due à la contamination des produits chimiques similaires à 3-NT dans la membrane. Répéter le rinçage 1 x.
- Après protéolyse, centrifuger les échantillons à 2 500 g pendant 10 min. charge le surnageant dans la membrane d’ultrafiltration et il centrifuger à 10 000 x g et 4 ° C pour ultrafiltration (MWCO = 10 000), jusqu'à ce qu’un volume suffisant d’élution est collecté. Entreposer les éluats à 4 ° C à l’obscurité.
Attention : En raison de la détection d’une crête semblable à 3-NT dans la colonne, il est nécessaire de le laver avec de l’eau propre ou avec un tampon comme eau de CLHP et un tampon d’acétate 0,1 M avant d’utiliser.
2. dosage du NT-3 TSP, PM2,5et PM7via une High-performance Liquid Chromatography et système de détection électrochimique (HPLC-DCE)
Remarque : Voir la Figure 3.
- Préparer la phase mobile.
- Préparer 0,2 M phosphate tamponné (pH 2,5) contenant 50 mg/L d’EDTA. Mesurer 98 volumes du tampon et deux volumes de l’acétonitrile (qualité CLHP), verser dans une bouteille en verre propre et mélanger vigoureusement avec un bouchon.
- Régler la phase mobile à température ambiante pendant plusieurs heures jusqu'à ce que l’air dissous est à plat.
Remarque : Si le système est démarré plus tôt, la phase mobile peut être sonication et dégazée sous vide. Cependant, le dégazage excessif changera le rapport entre l’eau et la phase organique par évaporation.
- Le système HPLC-DPE se compose d’une pompe, une colonne HPLC, un dégazeur, un DPE et un injecteur. Equilibrez la phase mobile et stabiliser le système afin de réduire le fond et le bruit.
- Installer la phase mobile et la colonne HPLC dans le système de CLHP. Mettre en marche la pompe HPLC et stabiliser la colonne avec la phase mobile à un débit de 500 µL/min à 25 ° C température de la colonne du jour avant la date de début.
- Le lendemain, allumer la DPE et réglez les paramètres (la tension de réduction à -900 mV et la tension d’excitation de 400 mV). Stabiliser pendant au moins 3 h.
- Mesurer la concentration de NT-3 dans le PM7.
- Préparer les différentes concentrations de NT-3 normes (5-500 nM) et un blanc (sans la 3-NT standard et non-spécifique protéase cocktail, pour s’assurer que le flacon ni la mémoire tampon est contaminée) dans un tampon d’acétate 0,1 M.
- Exécutez le processeur de données HPLC.
- Mettre les flacons d’échantillon dans l’auto-injecteur et ensemble le volume d’injection à 25 µL. exploiter les mêmes conditions de phase mobile et débit tel que mentionné à l’étape 2.2.1.
Remarque : Si la préparation est terminée, il faut des échantillons, un standard (5-500 nM), un échantillon de cocktail uniquement de protéase non spécifique et un flacon vide. - Assurez-vous que la ligne de base dans le chromatogramme est plate et commencer l’injection de l’échantillon.
Remarque : En général, 3-NT est détecté dans les 20-21 min ; Cependant, environ 30 min est recommandée comme le temps d’exécution par injection de l’échantillon. Dans le cas contraire, des pics de contaminant figureront dans la prochaine exécution.
3. analyse des chromatogrammes et Quantification de la teneur en 3-NT en PM7
- Vérifiez le pic 3-NT dans les chromatogrammes et calculer la teneur.
- Après la collecte de données, ouvrez le fichier de données de chromatogramme avec logiciel d’analyse.
- Tracez une ligne à travers le pic 3-NT de la ligne de base plate et lire la hauteur du pic de la ligne tracée.
Remarque : La limite quantitative est d’environ 5 nM (125 fmol en une injection de 25 µL).
Attention : L’électrode dans la DPE s’épuise lentement, et la limite sera élevée en raison du rapport signal/bruit. - Préparer une courbe de régression des sommets standards 3-NT, calculer la pente et intercepter.
- Attribuer ces constantes dans l’équation suivante et calculer la teneur en 3-NT dans les échantillons comme suit.
Exemple 3 – NT (nM) = [goûter pic – intercepter] / pente EQ. (1)
Remarque : La courbe standard devrait être bien représentée qu’une ligne droite entre 5 nM et 500 nM.
- Calculer le 3-NT dans l’environnement de l’air et le PM7 dans le flacon d’échantillon.
- Multiplier la concentration de NT-3 par le volume réactionnel (et le facteur de dilution, le cas échéant) et d’évaluer la teneur absolue en 3-NT dans PM7 du cercle.
- Mesurer la zone de filtres recueillis et calculer la teneur en 3-NT dans les particules totales7 filtre par l’équation suivante.
Total PM7 = [3-NT contenu dans le PM7 du cercle] x [taux de la zone de filtre de7 PM à l’arrondissement] x 226.19 (dans le cas de la conversion moles grammes) EQ. (2) - Évaluer le contenu de 3-NT dans l’environnement de l’air ou PM7 en divisant le total de PM7 par le volume d’air total ou PM7 poids (enregistré à l’étape 1.1.3).
Representative Results
Le principe de l’HPLC-DCE est simple. Les échantillons contenant la cible sont séparés par la colonne HPLC et la phase mobile, et le composé cible séparées est réduit et/ou oxydé dans le détecteur électrochimique.
Dans le système HPLC-DCE, un pic de 3-NT est détecté en 22 minutes environ. Livrets (PEC-510 et HTEC-500) sont montées en série dans la ligne de CLHP. La premier DPE réduit les groupements hydroxyles dans les composés, et l’autre s’oxyde aux réduction des produits chimiques. Livrets ont une portée de détection très sensible de 10-15 M. La limite de détection du système HPLC-DCE était 1.13 pg/m3, qui a été calculé comme étant le signal moyens basal (mV) de 10 parties x 3.
Chromatogrammes représentatifs sont indiquées à la Figure 4. En analysant une norme 3-NT pure, un pic définitif avec une ligne de base stable peut être détectée (Figure 4 a). 3-NT en PM7 a également été mesuré à l’aide de 6 mm, forme ronde échantillons (Figure 4 b).
Quant à l’exactitude de la capacité de détection 3-NT, lorsqu’une norme 3-NT a été injectée en HPLC, le pic correspondant à 3-NT a été détecté à un temps de rétention de 20 minutes. Dans les échantillons de PM, 3-NT a été séparé des autres substances, et le sommet a été détecté dans le même temps de rétention que la norme. Une courbe d’étalonnage typique est illustrée à la Figure 5, où la linéarité est observée entre 5 et 40 nM. Linéarité peut être vu jusqu'à 500 nM (données non présentées).
Le tableau 1 montre le contenu de 3-NT dans l’atmosphère, calculée comme pg/m3 air. La plus forte concentration de NT-3 dans un préfiltre de2,5 PM a été observée dans #3 (PM7.3-4.5).
Figure 1 : Système de collecte pour TSP, PM7et PM2,5. (A) les particules en suspension totales (TSP) sont recueillies directement sur un filtre de prélèvement (à un débit de 1 000 L/min). (B) lorsque PM7 sont recueillis, les grosses particules sont exclus par un sélecteur de taille (à un débit de 1 000 L/min). (C), PM2,5 sont collectées par le biais de quatre préfiltres (à un débit de 116 L/min). Un filtre quartz est couramment utilisé comme filtre sauvegarde pour PM7 et PM2,5 , ou comme un filtre de collection pour TSP, comme illustré dans cette figure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation d’un cercle de mm-ronde 6. Le filtre de prélèvement a été coupé à l’aide d’un outil de poinçon creux avec un diamètre de 6 mm. Ensuite, l’échantillon a été stocké dans un microtube 1,5 mL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Schéma de principe du système HPLC-DCE. 3-NT dans un échantillon injecté a été séparé dans la colonne HPLC grâce qui coule de la phase mobile. Le 3-NT a été réduit à aminotyrosine, oxydée en iminotyrosine et détecté par voie électrochimique dans le détecteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Chromatogrammes typiques du système HPLC-DCE. (A) Pure 3-NT analysée par le système HPLC-DCE. Échantillon de cercle de 6 mm (B) d’un filtre de7 PM utilisés pour détecter 3-NT. Un pic de 3-NT est indiqué par une flèche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Courbe d’étalonnage des échantillons purs de 3-NT. Les résultats à une concentration inférieure sont indiquées dans un autre graphique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Objet | Jours de Collection |
Spot | 3-NT (pg/m3 air) |
|
| PM2, 5 | Préfiltre #1 | 27 | 4 | 8,25 ± 0,37 |
| Préfiltre #2 | 27 | 4 | 29.66 ± 1,94 | |
| Préfiltre #3 | 27 | 4 | 74.37 ± 4,09 | |
| Préfiltre #4 | 27 | 4 | 32.70 ± 0,75 | |
| Backfilter | 7 | 5 | 4.21 ± 0,91 | |
| PM7 | Backfilter | 7 | 1 | 89.16 ± 6.36 |
| C. À THÉ | Filtre | 7 | 1 | 10,34 ± 2.09 |
Tableau 1 : 3-NT dans l’atmosphère mesurée par le système HPLC-DCE. Les taches circulaires de 6 mm de chaque filtre ont été mesurés en utilisant le système HPLC-DCE. Préfiltres #1 à #4 ont été recueillis dans la même période. Notez que les concentrations de NT-3 dans l’air sont influencées par divers facteurs, tels que la date collectée, année ou emplacement. Les données (n = 3-10) sont représentés comme la moyenne ± l’écart-type.
Discussion
Cet article décrit une méthode de quantification pour évaluer 3-NT dans aéroporté PM recueillie sur les filtres quartz en utilisant des techniques HPLC-DCE hautement sensibles.
En général, les méthodes de mesure 3-NT ont été développés comme biomarqueurs du stress oxydatif dans les maladies humaines. Méthodes axées sur les anticorps (par exemple, le dosage immuno-enzymatique) sont considérés comme semiquantitative parce qu’il n’y a aucune validation de dosage strict et il est difficile d’évaluer la fiabilité du test. HPLC avec détection électrochimique (DCE) et les essais basé sur la spectrométrie de masse ont suffisamment de sensibilité pour la quantification des 3-NT13. Bien qu’ils soient sensibles, méthodes basées sur la spectrométrie de masse comme GC-MS ou GC-MS/MS exigent la dérivation des acides aminés, et le processus de dérivation souvent conduit à la formation des artefacts14.
Par rapport aux techniques de la LC et GC, HPLC-DCE est relativement moins cher et a une sensibilité suffisante à la mesure 3-NT. en outre, l’étape de dérivation en GC-MS et LC-MS nécessite souvent un délai supplémentaire. Bien que la méthode présentée ici nécessite 16 heures pour l’étape de digestion des protéines, elle peut, néanmoins, effectué pendant la nuit (comme décrit ci-dessus, environ 30 minutes de temps de pratique est nécessaire par exemple). Mesure de répétition automatique à l’aide d’un échantillonneur automatique peut prévoir un système de mesure de haut débit. Des études antérieures ont signalé des méthodes immunologiques pour mesurer 3-NT PM2,7; Cependant, ces méthodes pas peuvent détecter 3-NT dans la saison d’hiver en raison de la faiblesse de la 3-NT dans la PM15.
La méthode HPLC-DCE a des avantages supplémentaires par rapport aux autres méthodes standard ; par exemple, (i) un processus d’extraction n’est pas nécessaire dans cette méthode, (ii) il est complètement sans détergent, (iii) il a besoin de l’échantillon minimal et, surtout, (iv) il a une sensibilité élevée. Les particules qui sont collectées sur des filtres sont fréquemment séparés par sonication à des investigations supplémentaires, y compris la quantification des différents composants. Détergents sont également utilisés pour isoler les protéines liées à PM de filtres. Toutefois, ces étapes supplémentaires augmentent le risque de contamination, la perte de l’échantillon et une sous-estimation en raison de l’efficacité de l’extraction, et en outre, la plupart des détergents sont incompatibles avec la LC/MS. Dans la présente méthode HPLC-DCE, échantillons HPLC peuvent être facilement séparés du filtre à l’aide d’un simple coup de poing creux et sans l’obligation d’un processus de préparation d’échantillon supplémentaire. La zone de l’échantillon de forme ronde est 28,3 mm2, qui est très faible par rapport à la taille du filtre quartz original (8 x 10 pouces = 203,2 x 254 mm = 51 600 mm2).
La condition de HPLC-DCE a été examinée soigneusement pour éviter l’interférence au signal 3-NT, comme décrit plus haut12. Un pH acide solide de la phase mobile et une concentration suffisante de l’acétonitrile sont importants pour la détection. En utilisant ces conditions, les autres composés, y compris la base, nitro peuvent être séparés de nitrotyrosine. L’état actuel est approprié pour la détection des 3-NT des échantillons avec une autre propriété physique (p. ex., les matières particulaires et plasma).
Pour évaluer 3-NT dans l’air, la mesure de la masse de filtre et l’élimination de l’arrière-plan sont des étapes critiques. En général, sur environ 100 mg de PM7 sont collectées sur une période de quatre à sept jours ; Toutefois, plusieurs facteurs affectent le poids du filtre avant et après le prélèvement de7 PM, y compris l’humidité et la charge électrique statique. Pour éviter ces effets, la stabilisation du poids filtre pendant de longues périodes est nécessaire sous l’humidité et de température subégaux. L’emplacement d’installation de la balance électronique devrait être maintenue dans un environnement stable. Pour la préparation de l’échantillon, il est important de corriger les effets de fond de la protéase non spécifique du cocktail et la membrane d’ultrafiltration, qui font souvent preuve d’une crête semblable à 3-NT.
Cette méthode peut être appliquée aux autres particules, y compris ceux dans les environnements intérieurs. La nitration des protéines peut augmenter leur potentiel allergène2. Par conséquent, cette méthode peut aider à évaluer la propreté environnementale et prévenir le stress nitrosative.
Dans cette étude, nous présentons une méthode de mesure très sensibles pour atmosphérique 3-NT des filtres à air échantillonneur avec appareil facile à manipuler et peu coûteux. La génération de 3-NT dans l’atmosphère est associée à des polluants environnementaux tels que O3, N°2, protéines de PM et les éléments météorologiques qui affectent les humaine allergénicité. En conclusion, la méthode développée dans cette étude peut aider à évaluer la réaction atmosphérique de O3, divers polluants et protéines de PM dans diverses conditions météorologiques. Avec ces efforts de développement de HPLC-DPE pour une estimation de 3-nitrotyrosine dans l’atmosphère, nous prévoyons mieux la propreté environnementale, améliorer la santé humaine.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Masayuki Kubo de la US Environmental Protection Agency pour son aide avec l’échantillonnage de2,5 c. à thé/PM. Ce travail a été en partie soutenu par JSPS KAKENHI Grant nombre JP16K15373 et JP18H03039.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
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