हम 6 मिमी व्यास एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-विद्युत डिटेक्टर (HPLC-ECD) का उपयोग कर एयर पारखी फिल्टर से कटौती के साथ वायुमंडलीय प्रोटीन के 3-nitrotyrosine रासायनिक संशोधनों का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ।
3-nitrotyrosine (3-NT) में tyrosine अवशेष से वायुमंडलीय जैव एयरोसोल प्रोटीन के माध्यम से एक प्रतिक्रिया के माध्यम से उत्पन्न होता है ओजोन (ओ3) और नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (कोई2). स्थिर 3-NT ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए एक विशिष्ट मार्कर है और एलर्जी को बढ़ावा देने के लिए एक प्रवर्तक प्रभाव है की सूचना दी है । वर्तमान अध्ययन में, हम एक अति संवेदनशील परख के विकास की रिपोर्ट 3-हवा पारखी फिल्टर में NT-के लिए < २.५ µm इकट्ठा बात कण (प्रधानमंत्री२.५) शहरी पर्यावरण वायु से, जैव एयरोसोल सहित । इस विधि में, एक 6 मिमी व्यास दौर छेद हवा पारखी के फिल्टर से काट दिया और प्रोटीन hydrolyze करने के क्रम में एक गैर विशिष्ट छेड़ने कॉकटेल के साथ मिलाया गया था. एमिनो एसिड स्तर को पचाने वाले प्रोटीन नमूने 3-NT एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-विद्युत डिटेक्टर (HPLC-ECD) का उपयोग कर के लिए परीक्षण किया गया । अधिकतम 3-NT सामग्री का पता ४.५ से ७.३ माइक्रोन, १.१३ pg/एम3का पता लगाने की सीमा के साथ आकार के प्रधानमंत्री के लिए एक फ़िल्टर में पाया गया ।
एयरोसोल या हवाई, वायरस, prokaryotes, कवक, पौधों (पराग), और जानवरों (कीड़े, मानव)1सहित विभिन्न जैविक मूल से प्रोटीन होता है । पीएम में प्रोटीन सामग्री का अनुपात करीब 5% होने का अनुमान है, जिसे हवाई एलर्जी2के रूप में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए फंसाया गया है । हाल की रिपोर्टों का सुझाव है कि शहरी विभिंन आकारों के परिवेश एयरोसोल ०.५% और 2%3के बीच लेकर अनुपात के साथ अमीनो एसिड होते हैं । इसके अतिरिक्त पीएम प्रोटीन के रासायनिक संशोधनों में विभिन्न प्रदूषकों जैसे कि ओ3, नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (NO2), और सल्फर डाइऑक्साइड (SO2)4के साथ प्रोटीन की प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पन्न किए जाने का सुझाव दिया गया है ।
3-NT-एक प्रोटीन संशोधन-tyrosine अवशेषों के nitration द्वारा उत्पंन होता है । 3 ओ की एक उच्च एकाग्रता और कोई2 छद्म वायुमंडलीय अंतरिक्ष5,6में प्रोटीन अणुओं के nitration को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में tyrosine अवशेषों की nitration पराग प्रोटीन की एलर्जी क्षमता को बढ़ाता है7. इस प्रकार, ठहराव और हवाई 3 का आकलन-NT पर्यावरण के स्वास्थ्य की चिंताओं को संबोधित करने में एक महत्वपूर्ण पहलू है ।
3-NT भी ऑक्सीडेटिव और nitrosative तनाव8के एक अगोचर के रूप में जाना जाता है । सबूत के एक उभरते शरीर के कई मानव रोगों9,10के साथ 3-NT सामग्री का एक महत्वपूर्ण संघ दिखाया गया है । इसके हानिकारक प्रभाव के कारण, एक जैविक नमूना में पता लगाने और 3-NT का मात्रात्मक आकलन एक व्यक्ति के स्वास्थ्य की स्थिति का निर्धारण करने में महान प्रासंगिकता पकड़ो । हाल के वर्षों में, विभिंन तरीकों के लिए 3-एंजाइम-immunosorbent परख, HPLC, और नियंत्रण रेखा से जुड़े सहित NT सामग्री, अनुमान शुरू किया गयाहै/ पिछले अध्ययनों में, हम एक का पता लगाने के HPLC-ECD तकनीक पिछले तरीकों की तुलना में कई फायदे के साथ कोताही का उपयोग कर विधि की सूचना दी है । उदाहरण के लिए, HPLC-ECD एक निष्कर्षण या derivatization प्रक्रिया है जो यह एक अपेक्षाकृत सरल परख प्रणाली12बनाता है की आवश्यकता नहीं है । हमने पुष्टि की है कि इस विधि जैविक नमूनों से 3-NT का पता लगाने के लिए लागू है (मानव और चूहे से प्लाज्मा) ।
हालांकि कई जांचों जैविक नमूनों में 3-NT का पता लगाने पर बल दिया है, जैविक नमूनों में इसकी पहचान मायावी बनी हुई है, और इसलिए वर्तमान अध्ययन को आगे बढ़ाया गया है । वास्तव में, हवाई के हानिकारक प्रभाव का आकलन करने के लिए 3-nt, एक मात्रात्मक विधि है कि 3 का पता लगाने के लिए उपयोगी है-nt सीधे हवाई कणों से आवश्यक है; इसलिए, हम एक ग्लास-फाइबर फ़िल्टर पर एकत्र२.५ से 3-NT का पता लगाने के लिए मौजूदा HPLC-ECD विधि लागू है । तकनीक का उपयोग करके, 3-NT सीधे छोटे टुकड़ों से पता लगाया जा सकता है (6 मिमी-व्यास दौर छेद) एक प्रधानमंत्री संग्रह फ़िल्टर से नमूना । हम आगे विभिंन प्रधानमंत्री के आकार के लिए 3-nt की सामग्री का मूल्यांकन किया और 3-nt का पता लगाने की सीमा मापा । वर्तमान लेख एक उच्च संवेदनशील और उच्च प्रवाह विधि का प्रस्ताव 3-NT दोनों गैर जैविक और जैविक नमूनों से सीधे पता लगाने के लिए ।
यह आलेख वर्णन करता है कि एक ठहराव विधि का मूल्यांकन करने के लिए हवाई में 3-NT अत्यधिक संवेदनशील HPLC-ECD तकनीकों का उपयोग कर क्वार्ट्ज फिल्टर पर एकत्र ।
सामांय में, 3-NT माप विधियों मानव रोगों में ऑक्सीडेटिव तनाव के के रूप में विकसित किया गया है । एंटीबॉडी आधारित तरीकों (जैसे, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख) अर्द्ध मात्रात्मक के रूप में माना जाता है क्योंकि वहां कोई सख्त परख मांयता है और यह परीक्षण की विश्वसनीयता का आकलन करने के लिए मुश्किल है । HPLC विद्युत डिटेक्शन (ECD) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित परख के साथ 3-NT13के ठहराव के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता है । हालांकि वे संवेदनशील हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री-gc जैसे तरीकों पर आधारित-ms या gc-ms/ms अमीनो एसिड की derivatization की आवश्यकता होती है, और derivatization की प्रक्रिया अक्सर14कलाकृतियों के गठन में परिणाम.
दोनों gc और नियंत्रण रेखा तकनीक की तुलना में, HPLC-ECD अपेक्षाकृत कम खर्चीला है और एक पर्याप्त संवेदनशीलता को मापने के लिए 3-NT. साथ ही, GC-ms और lc-ms में derivatization चरण अक्सर अतिरिक्त समय की आवश्यकता है । हालांकि यहां प्रस्तुत विधि प्रोटीन पाचन कदम के लिए 16 घंटे की आवश्यकता है, यह कर सकते हैं, फिर भी, रातोंरात बाहर किया जा (जैसा कि ऊपर वर्णित है, हाथ के बारे में 30 मिनट-समय पर नमूना प्रति आवश्यक है) । किसी स्वतः नमूना का उपयोग करके स्वचालित दोहराएँ माप एक उच्च-प्रवाह माप सिस्टम प्रदान कर सकता है । पिछले अध्ययनों ने बताया है प्रतिरक्षा तरीकों को मापने के लिए 3-NT में PM2,7; हालांकि, पीएम15में 3-nt के निम्न स्तर होने के कारण इस तरह के तरीके सर्दियों के मौसम में 3-nt का पता नहीं लगा सके ।
HPLC-ECD विधि अन्य मानक विधियों पर अतिरिक्त लाभ है; उदाहरण के लिए, (i) एक निष्कर्षण प्रक्रिया इस विधि में आवश्यक नहीं है, (ii) यह पूरी तरह से डिटर्जेंट-मुक्त है, (iii) यह न्यूनतम नमूना आवश्यकता है, और, महत्वपूर्ण बात, (iv) यह उच्च संवेदनशीलता है. फिल्टर पर एकत्र कणों अक्सर विभिन्न घटकों के ठहराव सहित आगे की जांच के लिए sonication द्वारा अलग कर रहे हैं । डिटर्जेंट को भी पीएम से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है-फिल्टर से बंधे प्रोटीन । हालांकि, इन अतिरिक्त कदम संदूषण, नमूना हानि के जोखिम को बढ़ाने के लिए, और निष्कर्षण दक्षता के कारण आकलन, और इसके अलावा, सबसे डिटर्जेंट नियंत्रण रेखा के साथ असंगत/ वर्तमान HPLC-ECD विधि में, HPLC नमूने आसानी से फ़िल्टर से एक साधारण खोखले पंच का उपयोग करके और एक अतिरिक्त नमूना तैयारी प्रक्रिया की आवश्यकता के बिना अलग किया जा सकता है । गोल के आकार का नमूना क्षेत्र है २८.३ मिमी2, जो मूल क्वार्ट्ज फिल्टर के आकार की तुलना में बहुत छोटा है (8 x 10 इंच = २०३.२ x २५४ mm = ५१,६०० mm2) ।
HPLC-ECD शर्त 3-NT संकेत करने के लिए हस्तक्षेप से बचने के लिए सावधानीपूर्वक की समीक्षा की गई है, जैसा कि पहले12बताया गया है । मोबाइल चरण और acetonitrile के एक पर्याप्त एकाग्रता का एक मजबूत अंलीय पीएच पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । इन शर्तों का उपयोग, नाइट्रो आधार सहित अन्य यौगिकों, nitrotyrosine से अलग किया जा सकता है. वर्तमान हालत एक अलग भौतिक संपत्ति के साथ नमूनों से 3-NT का पता लगाने के लिए उपयुक्त है (जैसे, बात और प्लाज्मा कण) ।
हवा में 3-NT का मूल्यांकन करने के लिए, फ़िल्टर वजन और पृष्ठभूमि के उंमूलन के माप महत्वपूर्ण कदम हैं । सामान्य तौर पर,7 बजे के लगभग १०० मिलीग्राम से अधिक चार से सात दिनों की अवधि में एकत्र कर रहे हैं; हालांकि, कई कारकों फिल्टर वजन से पहले और बाद में आर्द्रता और स्थैतिक विद्युत प्रभारी सहित7 संग्रह, प्रभावित करते हैं । इन प्रभावों से बचने के लिए, लंबी अवधि के लिए फिल्टर वजन का स्थिरीकरण तापमान और आर्द्रता के तहत आवश्यक है । स्थान जहां इलेक्ट्रॉनिक संतुलन स्थापित किया गया है एक स्थिर वातावरण में बनाए रखा जाना चाहिए । नमूना तैयारी के लिए, यह गैर-विशिष्ट छेड़ने कॉकटेल और ultrafiltration झिल्ली है, जो अक्सर 3-NT के लिए एक समान चोटी दिखाने से पृष्ठभूमि प्रभाव को सही करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
इस विधि इनडोर वातावरण में उन सहित अंय कणों के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटीन के nitration उनकी एलर्जी की क्षमता में वृद्धि हो सकती है2। इसलिए, इस विधि से पर्यावरण सफाई का मूल्यांकन करने और nitrosative तनाव को रोकने में मदद मिल सकती है ।
इस अध्ययन में, हम आसान करने के लिए संभाल और सस्ती तंत्र के साथ हवा पारखी फिल्टर के वायुमंडलीय 3-NT के लिए एक अति संवेदनशील माप विधि की रिपोर्ट. वातावरण में 3-NT की पीढ़ी पर्यावरण प्रदूषण जैसे हे3, कोई2, प्रधानमंत्री प्रोटीन, और मौसम के तत्वों के साथ जुड़ा हुआ है जो मानव allergenicity को प्रभावित करता है । अंत में, वर्तमान जांच में विकसित विधि ओ3के वायुमंडलीय प्रतिक्रिया का आकलन करने में मदद कर सकते हैं, विभिंन प्रदूषक, और प्रधानमंत्री प्रोटीन विभिंन मौसम की स्थिति के तहत । वातावरण में 3-nitrotyrosine के एक अनुमान के लिए HPLC-ECD विकसित करने के इन प्रयासों के साथ, हम बेहतर पर्यावरण सफाई की आशा, मानव स्वास्थ्य में सुधार ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने टीएसपी के साथ उनकी मदद के लिए अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी के Masayuki क्युबो का शुक्रिया अदा किया/२.५ नमूना । इस काम को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर JP16K15373 और JP18H03039 के हिस्से में सपोर्ट किया गया ।
Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
Data processor | Eicom | EPC-300 | |
Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |