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एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-विद्युत डिटेक्टर प्रणाली के माध्यम से वायुमंडलीय वातावरण में 3-Nitrotyrosine का पता लगाने

doi: 10.3791/58371 Published: January 30, 2019

Summary

हम 6 मिमी व्यास एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-विद्युत डिटेक्टर (HPLC-ECD) का उपयोग कर एयर पारखी फिल्टर से कटौती के साथ वायुमंडलीय प्रोटीन के 3-nitrotyrosine रासायनिक संशोधनों का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

3-nitrotyrosine (3-NT) में tyrosine अवशेष से वायुमंडलीय जैव एयरोसोल प्रोटीन के माध्यम से एक प्रतिक्रिया के माध्यम से उत्पन्न होता है ओजोन (ओ3) और नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (कोई2). स्थिर 3-NT ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए एक विशिष्ट मार्कर है और एलर्जी को बढ़ावा देने के लिए एक प्रवर्तक प्रभाव है की सूचना दी है । वर्तमान अध्ययन में, हम एक अति संवेदनशील परख के विकास की रिपोर्ट 3-हवा पारखी फिल्टर में NT-के लिए < २.५ µm इकट्ठा बात कण (प्रधानमंत्री२.५) शहरी पर्यावरण वायु से, जैव एयरोसोल सहित । इस विधि में, एक 6 मिमी व्यास दौर छेद हवा पारखी के फिल्टर से काट दिया और प्रोटीन hydrolyze करने के क्रम में एक गैर विशिष्ट छेड़ने कॉकटेल के साथ मिलाया गया था. एमिनो एसिड स्तर को पचाने वाले प्रोटीन नमूने 3-NT एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-विद्युत डिटेक्टर (HPLC-ECD) का उपयोग कर के लिए परीक्षण किया गया । अधिकतम 3-NT सामग्री का पता ४.५ से ७.३ माइक्रोन, १.१३ pg/एम3का पता लगाने की सीमा के साथ आकार के प्रधानमंत्री के लिए एक फ़िल्टर में पाया गया ।

Introduction

एयरोसोल या हवाई, वायरस, prokaryotes, कवक, पौधों (पराग), और जानवरों (कीड़े, मानव)1सहित विभिन्न जैविक मूल से प्रोटीन होता है । पीएम में प्रोटीन सामग्री का अनुपात करीब 5% होने का अनुमान है, जिसे हवाई एलर्जी2के रूप में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए फंसाया गया है । हाल की रिपोर्टों का सुझाव है कि शहरी विभिंन आकारों के परिवेश एयरोसोल ०.५% और 2%3के बीच लेकर अनुपात के साथ अमीनो एसिड होते हैं । इसके अतिरिक्त पीएम प्रोटीन के रासायनिक संशोधनों में विभिन्न प्रदूषकों जैसे कि ओ3, नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (NO2), और सल्फर डाइऑक्साइड (SO2)4के साथ प्रोटीन की प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पन्न किए जाने का सुझाव दिया गया है ।

3-NT-एक प्रोटीन संशोधन-tyrosine अवशेषों के nitration द्वारा उत्पंन होता है । 3 ओ की एक उच्च एकाग्रता और कोई2 छद्म वायुमंडलीय अंतरिक्ष5,6में प्रोटीन अणुओं के nitration को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में tyrosine अवशेषों की nitration पराग प्रोटीन की एलर्जी क्षमता को बढ़ाता है7. इस प्रकार, ठहराव और हवाई 3 का आकलन-NT पर्यावरण के स्वास्थ्य की चिंताओं को संबोधित करने में एक महत्वपूर्ण पहलू है ।

3-NT भी ऑक्सीडेटिव और nitrosative तनाव8के एक अगोचर के रूप में जाना जाता है । सबूत के एक उभरते शरीर के कई मानव रोगों9,10के साथ 3-NT सामग्री का एक महत्वपूर्ण संघ दिखाया गया है । इसके हानिकारक प्रभाव के कारण, एक जैविक नमूना में पता लगाने और 3-NT का मात्रात्मक आकलन एक व्यक्ति के स्वास्थ्य की स्थिति का निर्धारण करने में महान प्रासंगिकता पकड़ो । हाल के वर्षों में, विभिंन तरीकों के लिए 3-एंजाइम-immunosorbent परख, HPLC, और नियंत्रण रेखा से जुड़े सहित NT सामग्री, अनुमान शुरू किया गयाहै/ पिछले अध्ययनों में, हम एक का पता लगाने के HPLC-ECD तकनीक पिछले तरीकों की तुलना में कई फायदे के साथ कोताही का उपयोग कर विधि की सूचना दी है । उदाहरण के लिए, HPLC-ECD एक निष्कर्षण या derivatization प्रक्रिया है जो यह एक अपेक्षाकृत सरल परख प्रणाली12बनाता है की आवश्यकता नहीं है । हमने पुष्टि की है कि इस विधि जैविक नमूनों से 3-NT का पता लगाने के लिए लागू है (मानव और चूहे से प्लाज्मा) ।

हालांकि कई जांचों जैविक नमूनों में 3-NT का पता लगाने पर बल दिया है, जैविक नमूनों में इसकी पहचान मायावी बनी हुई है, और इसलिए वर्तमान अध्ययन को आगे बढ़ाया गया है । वास्तव में, हवाई के हानिकारक प्रभाव का आकलन करने के लिए 3-nt, एक मात्रात्मक विधि है कि 3 का पता लगाने के लिए उपयोगी है-nt सीधे हवाई कणों से आवश्यक है; इसलिए, हम एक ग्लास-फाइबर फ़िल्टर पर एकत्र२.५ से 3-NT का पता लगाने के लिए मौजूदा HPLC-ECD विधि लागू है । तकनीक का उपयोग करके, 3-NT सीधे छोटे टुकड़ों से पता लगाया जा सकता है (6 मिमी-व्यास दौर छेद) एक प्रधानमंत्री संग्रह फ़िल्टर से नमूना । हम आगे विभिंन प्रधानमंत्री के आकार के लिए 3-nt की सामग्री का मूल्यांकन किया और 3-nt का पता लगाने की सीमा मापा । वर्तमान लेख एक उच्च संवेदनशील और उच्च प्रवाह विधि का प्रस्ताव 3-NT दोनों गैर जैविक और जैविक नमूनों से सीधे पता लगाने के लिए ।

Protocol

1. कुल निलंबित कणों का संग्रह, पीएम२.५, या पीएम7, और पीएम प्रोटीन के लिए Hydrolysis विधि

  1. किसी फ़िल्टर या बैकअप फ़िल्टर से PM को एकत्रित करें.
    1. कुल निलंबित कणों (टीएसपी), पीएम२.५, और पीएम7के संग्रह से पहले, क्वार्ट्ज फिल्टर वजन ।
      ध्यान दें: पीएम द्वारा कि प्रदूषण को देखते हुए प्रोटीन और पेप्टाइड्स tyrosine nitration का पता लगाने को प्रभावित नहीं करना चाहिए (के रूप में वे इस तरह के एक नाइट्रो समूह की कमी), हम माप से पहले एक उच्च तापमान पर क्वार्ट्ज फिल्टर का इलाज नहीं किया. साथ ही, क्वार्ट्ज फ़िल्टर में 3-NT सामग्री का पता लगाना सीमा के अंतर्गत था, के रूप में HPLC-ECD द्वारा निर्धारित है ।
    2. एक कण आकार चयनकर्ता के साथ एक उच्च मात्रा हवा पारखी पर क्वार्ट्ज फिल्टर सेट 7 डी (चित्रा 1b) के लिए लगातार १,००० L/मिनट की एक प्रवाह दर पर इकट्ठा करने के लिए । टीएसपी आकार चयनकर्ता (आंकड़ा 1a) के बिना एक क्वार्ट्ज फिल्टर पर एकत्र किया जा सकता है ।
    3. इकट्ठा प्रधानमंत्री२.५ एक आकार वर्गीकरण इकाई के साथ एक कम मात्रा हवा नमूना का उपयोग कर ११६ एल के लिए लगातार/इस इकाई का उपयोग करते हुए, कणों को पीएम4.5-2.5, पीएम7.3-4.5, पीएम15-7.3, और टीएसपी-प्रधानमंत्री 15 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है और वर्गीकरण के लिए क्वार्ट्ज फिल्टर पर एकत्र । पीएम२.५ एक बैकअप फिल्टर (चित्रा 1C) पर एकत्र किया जा सकता है ।
    4. फ़िल्टर संग्रह के समय कुल प्रवाह वॉल्यूम रिकॉर्ड करें । postcollection के वजन से लेकर रिकलेक्शन वेट को घटा कर फिल्टर्स पर टीएसपी, पीएम२.५, और पीएम7 के वजन का उपाय करें । एक प्लास्टिक की थैली में फिल्टर सील और अगले कदम (2 अनुभाग देखें) तक-30 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
  2. नमूनों को Proteolyze ।
    1. एक ०.१ एम एसीटेट बफर (पीएच ७.४) के साथ विशिष्ट तंग कॉकटेल भंग । एक डायलिसिस झिल्ली में समाधान रखो (आणविक वजन cutoff = ५,००० दा) और यह 1 में विसर्जित ०.१ एम एसीटेट बफर के 4 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी के साथ. बफर 2x हर 12 एच बदलें, और फिर अंतर्जात 3-NT और नाइट्राइट (कोई2-) को दूर करने के क्रम में डायलिसिस रात का प्रदर्शन । डायलिसिस के बाद, समाधान इकट्ठा करने और bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापने ।
    2. पंच फिल्टर या बैकअप फिल्टर से बाहर 6 मिमी के दौर हलकों और उन्हें microtubes में डाल दिया । 6 मिमी भागों के पांच टुकड़े करने के लिए विश्लेषण (चित्रा 2) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. ३०० µ एल के ०.१ एम एसीटेट बफर युक्त ५० µ जी के प्रोटीन की विशिष्ट चिढ़ाने कॉकटेल (कदम 1.2.1 में तैयार) ट्यूब को hydrolyze के लिए ५० ° c पर रोटेशन के साथ 16 घंटे के लिए ।
      नोट: अंतर्जात को घटाना करने के लिए 3-NT गैर-विशिष्ट चिढ़ाना कॉकटेल समाधान से, यह आवश्यक है तैयार करने और एक गैर-विशिष्ट टीज़ कॉकटेल केवल नमूना पचाने के लिए ।
    4. ०.१ मीटर एसीटेट बफर और केंद्रापसारक (१०,००० एक्स जी 30 सेकंड के लिए जोड़ने के द्वारा इसकी आपूर्ति की ट्यूब के साथ ultrafiltration झिल्ली कुल्ला; सटीक गति झिल्ली पर निर्भर करता है), झिल्ली में 3-NT के समान रसायनों को दूषित करने के कारण । कुल्ला 1x दोहराएं ।
    5. पोस्ट-प्रोटियोलिसिस, 10 मिनट के लिए २,५०० x g पर नमूने केंद्रापसारक । ultrafiltration झिल्ली में supernatant लोड और १०,००० x जी और ultrafiltration के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह केंद्रापसारक (MWCO = १०,०००), जब तक पर्याप्त रेफरेंस की मात्रा एकत्र की है । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर eluates की दुकान ।
      चेतावनी: कारण स्पिन कॉलम में 3-NT के लिए एक समान चोटी का पता लगाने के लिए, यह अच्छी तरह से साफ पानी के साथ या HPLC पानी के रूप में एक बफर और एक ०.१ मीटर एसीटेट बफर के साथ प्रयोग करने से पहले धोने के लिए आवश्यक है ।

2.3-NT सामग्री का निर्धारण टीएसपी में, पीएम२.५, और पीएम7केजरिए एक हाई-परफॉरमेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी और विद्युत डिटेक्शन (HPLC-ECD) सिस्टम

नोट: चित्र 3देखें ।

  1. मोबाइल फेज तैयार करें ।
    1. तैयार ०.२ एम फॉस्फेट बफर (पीएच २.५) युक्त ५० मिलीग्राम/L EDTA. बफर के ९८ संस्करणों और acetonitrile (HPLC ग्रेड) के दो संस्करणों को मापने, उन्हें एक साफ कांच की बोतल में डालना, और एक टोपी के साथ जोरदार मिश्रण.
    2. भंग हवा फ्लैट जाता है जब तक कई घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मोबाइल चरण बसा ।
      नोट: यदि सिस्टम पहले शुरू कर दिया है, मोबाइल चरण sonicated और degassed एक निर्वात के तहत किया जा सकता है । हालांकि, ओवर-degassing पानी और कार्बनिक चरण वाष्पीकरण के माध्यम के बीच अनुपात बदल जाएगा ।
  2. HPLC-ECD प्रणाली एक पंप, एक HPLC कॉलम, एक degasser, एक ECD, और एक इंजेक्टर होते हैं । मोबाइल चरण Equilibrate और पृष्ठभूमि और शोर को कम करने के लिए प्रणाली को स्थिर ।
    1. मोबाइल चरण और HPLC सिस्टम में HPLC स्तंभ स्थापित करें । HPLC पम्प चालू करें और प्रारंभ दिन से पहले दिन से 25 ° c स्तंभ तापमान पर ५०० µ l/मिनट की प्रवाह दर पर मोबाइल चरण के साथ स्तंभ को स्थिर करें ।
    2. अगले दिन पर, ECD प्रज्वलित और पैरामीटर सेट (में कमी वोल्टेज-९०० एमवी और उत्तेजना वोल्टेज पर ४०० एमवी). यह कम से कम 3 एच के लिए स्थिर ।
  3. 3-NT एकाग्रता को पीएम7में मापने ।
    1. 3-nt मानकों के विभिंन सांद्रता (5-500 एनएम) और एक खाली (3-nt मानक और गैर विशिष्ट छेड़ने कॉकटेल के बिना, सुनिश्चित करें कि न तो शीशी और न ही बफर दूषित है) एक ०.१ मीटर एसीटेट बफर में तैयार करते हैं ।
    2. HPLC डेटा प्रोसेसर चलाएं ।
    3. ऑटो इंजेक्टर में नमूना शीशियों रखो और इंजेक्शन की मात्रा सेट करने के लिए 25 µ l चरण में उल्लेख किया के रूप में मोबाइल चरण और प्रवाह दर की ही शर्तों को संचालित.
      नोट: नमूना तैयारी पूरी हो गई है, तो नमूने, एक मानक (5-500 एनएम), एक गैर-विशिष्ट को छेड़ने वाला कॉकटेल केवल नमूना, और एक खाली शीशी होना चाहिए ।
    4. सुनिश्चित करें कि वर्णलेख में आधार रेखा समतल है और नमूना इंजेक्शन प्रारंभ करें ।
      नोट: सामान्यतया, 3-NT 20-21 मिनट में पाया जाता है; हालांकि, लगभग 30 मिनट प्रति नमूना इंजेक्शन चल रहे समय के रूप में सिफारिश की है । अन्यथा अगले रन में contaminant चोटियों को शामिल किया जाएगा ।

3-पीएम7 में 3-NT कंटेंट के Chromatograms और ठहराव का एनालिसिस

  1. chromatograms में 3-NT पीक की जांच करें और सामग्री की गणना ।
    1. डेटा संग्रह के बाद, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ वर्णलेख डेटा फ़ाइल खोलें ।
    2. समतल आधार रेखा से 3-NT पीक में एक पंक्ति आरेखित करें और आरेखित रेखा से पीक ऊंचाई पढ़ें ।
      नोट: मात्रात्मक सीमा लगभग 5 एनएम (एक 25 µ एल इंजेक्शन में १२५ fmol) है ।
      चेतावनी: ECD में इलेक्ट्रोड धीरे समाप्त हो जाता है, और S/N अनुपात के कारण सीमा उच्च हो जाएगा ।
    3. 3-NT मानक चोटियों से एक प्रतीपगमन लाइन तैयार, ढलान की गणना, और अवरोधन.
    4. इन स्थिरांकों को निंन समीकरण में असाइन करें और 3-NT सामग्री नमूनों में निंनानुसार परिकलन ।
      नमूना 3 – NT (एनएम) = [नमूना पीक-अवरोधन]/ढाल Eq. (1)
      नोट: मानक वक्र अच्छी तरह से 5 एनएम और ५०० एनएम के बीच एक सीधी रेखा के रूप में प्रतिनिधित्व किया जाना चाहिए ।
  2. हवा के वातावरण में 3-NT की गणना और शाम7 नमूना शीशी से ।
    1. प्रतिक्रिया की मात्रा से 3-nt एकाग्रता गुणा (और कमजोर पड़ने फैक्टर, यदि कोई हो), और पूर्ण 3-nt सामग्री का मूल्यांकन में7 बजे सर्कल से ।
    2. एकत्र फ़िल्टर क्षेत्र को मापने और 3-NT सामग्री कुल PM7 फ़िल्टर में निम्न समीकरण द्वारा परिकलित करें ।
      कुल पीएम7 = [3-NT सामग्री में पीएम7 सर्कल के] x [प्रधानमंत्री के अनुपात7 फिल्टर क्षेत्र के सर्किल क्षेत्र के लिए] x २२६.१९ (ग्राम के लिए तिल परिवर्तित करने के मामले में) Eq. (2)
    3. 3-NT सामग्री का मूल्यांकन हवा के वातावरण में या पीएम7 कुल वायु प्रवाह की मात्रा या पीएम 7 वजन (1.1.3 चरण में दर्ज) के द्वारा योग शाम 7 को विभाजित करके करें ।

Representative Results

HPLC-ECD सिद्धांत सरल है । लक्ष्य युक्त नमूने HPLC कॉलम और मोबाइल चरण से अलग कर रहे हैं, और अलग लक्ष्य यौगिक विद्युत डिटेक्टर में कम और/

HPLC-ECD सिस्टम में, लगभग 22 मिनट में एक 3-NT पीक का पता लगाया है । ECDs (पीईसी-५१० और एचटीईसी-५००) HPLC लाइन में मिलकर जुड़े हुए हैं. पहले ECD यौगिकों में हाइड्रॉक्सिल समूहों को कम कर देता है, और अगले ऑक्सीकरण कम रसायनों । ECDs 10-15 एम के एक अति संवेदनशील जांच रेंज है । HPLC-ECD प्रणाली की पता लगाने की सीमा १.१३ स्नातकोत्तर/एम3, जो 10 भागों x 3 के माध्य बेसल संकेत (एमवी) के रूप में गणना की गई थी ।

प्रतिनिधि chromatograms चित्रा 4में दिखाया गया है । एक शुद्ध 3-NT मानक, एक स्थिर आधारभूत के साथ एक निश्चित चोटी का विश्लेषण करके पता लगाया जा सकता है (चित्र 4a) । 3-NT में पीएम7 को 6 एमएम, गोल आकार के नमूनों (फिगर 4B) का इस्तेमाल करते हुए भी मापा गया ।

3-nt का पता लगाने की क्षमता, 3-nt मानक HPLC में इंजेक्ट किया गया था जब की शुद्धता के बारे में 3-nt करने के लिए संगत पीक 20 मिनट का एक अवधारण समय पर पाया गया । पीएम के नमूनों में 3-NT को अन्य पदार्थों से अलग कर दिया गया था और मानक के अनुरूप एक ही अवधारण समय पर स्वतंत्र चोटी का पता लगाया गया था । एक ठेठ मानक वक्र चित्रा 5में दिखाया गया है, जहां रैखिकता 5 और ४० एनएम के बीच मनाया जाता है । रैखिकता ५०० एनएम तक देखा जा सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

तालिका 1 वातावरण में 3-NT सामग्री दिखाता है, के रूप में गणना pg/ एक पीएम२.५ में 3-NT की उच्चतम एकाग्रता #3 (प्रधानमंत्री7.3-4.5) में मनाया गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : टीएसपी, पीएम7, और पीएम२.५के लिए कलेक्शन स्कीम । () कुल निलंबित कणों (टीएसपी) एक संग्रह फिल्टर पर सीधे एकत्र कर रहे है (१,००० एल के एक प्रवाह दर/ () जब प्रधानमंत्री7 एकत्र किया जाता है, बड़े कणों एक आकार चयनकर्ता द्वारा (१,००० एल के एक प्रवाह की दर पर/ (C) प्रधानमंत्री२.५ चार से अधिक फ़िल्टर (११६ L/मिनट की एक प्रवाह दर पर) के माध्यम से एकत्र की है । एक क्वार्ट्ज फिल्टर आमतौर पर प्रधानमंत्री के लिए एक बैकअप फिल्टर के रूप में प्रयोग किया जाता है7 और प्रधानमंत्री२.५ या टीएसपी के लिए एक संग्रह फिल्टर के रूप में, इस आंकड़े में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : 6 मिमी गोल सर्कल की तैयारी । संग्रह फ़िल्टर एक 6 मिमी व्यास के साथ एक खोखले पंच उपकरण का उपयोग काट रहा था । इसके बाद नमूना १.५ एमएल microtube में जमा हुआ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : HPLC-ECD प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख । एक इंजेक्शन नमूने में 3-NT HPLC स्तंभ के माध्यम से जो मोबाइल चरण बहती में अलग किया गया था । 3-NT aminotyrosine करने के लिए कम हो गया था, ऑक्सीकरण iminotyrosine के लिए, और डिटेक्टर में electrochemically का पता लगाया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : HPLC-ECD प्रणाली में ठेठ chromatograms । () शुद्ध 3-NT HPLC-ECD प्रणाली द्वारा विश्लेषण किया । () एक बजे से 6 मिमी सर्कल नमूना7 3-NT का पता लगाने के लिए इस्तेमाल फिल्टर । एक 3-NT पीक एक तीर द्वारा इंगित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : शुद्ध 3-NT नमूनों के मानक वक्र । एक कम एकाग्रता पर परिणाम एक और ग्राफ में संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

विषय के दिन
संग्रह
जगह 3-NT
(pg/एम3 वायु)
पीएम 2.5 फ़िल्टर #1 27 4 ८.२५ ± ०.३७
फ़िल्टर #2 27 4 २९.६६ ± १.९४
फ़िल्टर #3 27 4 ७४.३७ ± ४.०९
फ़िल्टर #4 27 4 ३२.७० ± ०.७५
Backfilter 7 5 ४.२१ ± ०.९१
PM7 Backfilter 7 1 ८९.१६ ± ६.३६
छोटा चम्मच फ़िल्टर 7 1 १०.३४ ± २.०९

तालिका 1:3-HPLC-ECD प्रणाली द्वारा मापा वातावरण में NT । प्रत्येक फिल्टर से 6 मिमी परिपत्र धब्बे HPLC-ECD प्रणाली का उपयोग कर मापा गया. समान अवधि में फ़िल्टर #1-#4 एकत्र किए गए । ध्यान दें कि हवा में 3-NT की सांद्रता विभिन्न कारकों से प्रभावित होती है, जैसे एकत्र तिथि, वर्ष, या स्थान । डेटा (n = 3-10) मानक त्रुटि का अर्थ ± के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Discussion

यह आलेख वर्णन करता है कि एक ठहराव विधि का मूल्यांकन करने के लिए हवाई में 3-NT अत्यधिक संवेदनशील HPLC-ECD तकनीकों का उपयोग कर क्वार्ट्ज फिल्टर पर एकत्र ।

सामांय में, 3-NT माप विधियों मानव रोगों में ऑक्सीडेटिव तनाव के के रूप में विकसित किया गया है । एंटीबॉडी आधारित तरीकों (जैसे, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख) अर्द्ध मात्रात्मक के रूप में माना जाता है क्योंकि वहां कोई सख्त परख मांयता है और यह परीक्षण की विश्वसनीयता का आकलन करने के लिए मुश्किल है । HPLC विद्युत डिटेक्शन (ECD) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित परख के साथ 3-NT13के ठहराव के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता है । हालांकि वे संवेदनशील हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री-gc जैसे तरीकों पर आधारित-ms या gc-ms/ms अमीनो एसिड की derivatization की आवश्यकता होती है, और derivatization की प्रक्रिया अक्सर14कलाकृतियों के गठन में परिणाम.

दोनों gc और नियंत्रण रेखा तकनीक की तुलना में, HPLC-ECD अपेक्षाकृत कम खर्चीला है और एक पर्याप्त संवेदनशीलता को मापने के लिए 3-NT. साथ ही, GC-ms और lc-ms में derivatization चरण अक्सर अतिरिक्त समय की आवश्यकता है । हालांकि यहां प्रस्तुत विधि प्रोटीन पाचन कदम के लिए 16 घंटे की आवश्यकता है, यह कर सकते हैं, फिर भी, रातोंरात बाहर किया जा (जैसा कि ऊपर वर्णित है, हाथ के बारे में 30 मिनट-समय पर नमूना प्रति आवश्यक है) । किसी स्वतः नमूना का उपयोग करके स्वचालित दोहराएँ माप एक उच्च-प्रवाह माप सिस्टम प्रदान कर सकता है । पिछले अध्ययनों ने बताया है प्रतिरक्षा तरीकों को मापने के लिए 3-NT में PM2,7; हालांकि, पीएम15में 3-nt के निम्न स्तर होने के कारण इस तरह के तरीके सर्दियों के मौसम में 3-nt का पता नहीं लगा सके ।

HPLC-ECD विधि अन्य मानक विधियों पर अतिरिक्त लाभ है; उदाहरण के लिए, (i) एक निष्कर्षण प्रक्रिया इस विधि में आवश्यक नहीं है, (ii) यह पूरी तरह से डिटर्जेंट-मुक्त है, (iii) यह न्यूनतम नमूना आवश्यकता है, और, महत्वपूर्ण बात, (iv) यह उच्च संवेदनशीलता है. फिल्टर पर एकत्र कणों अक्सर विभिन्न घटकों के ठहराव सहित आगे की जांच के लिए sonication द्वारा अलग कर रहे हैं । डिटर्जेंट को भी पीएम से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है-फिल्टर से बंधे प्रोटीन । हालांकि, इन अतिरिक्त कदम संदूषण, नमूना हानि के जोखिम को बढ़ाने के लिए, और निष्कर्षण दक्षता के कारण आकलन, और इसके अलावा, सबसे डिटर्जेंट नियंत्रण रेखा के साथ असंगत/ वर्तमान HPLC-ECD विधि में, HPLC नमूने आसानी से फ़िल्टर से एक साधारण खोखले पंच का उपयोग करके और एक अतिरिक्त नमूना तैयारी प्रक्रिया की आवश्यकता के बिना अलग किया जा सकता है । गोल के आकार का नमूना क्षेत्र है २८.३ मिमी2, जो मूल क्वार्ट्ज फिल्टर के आकार की तुलना में बहुत छोटा है (8 x 10 इंच = २०३.२ x २५४ mm = ५१,६०० mm2) ।

HPLC-ECD शर्त 3-NT संकेत करने के लिए हस्तक्षेप से बचने के लिए सावधानीपूर्वक की समीक्षा की गई है, जैसा कि पहले12बताया गया है । मोबाइल चरण और acetonitrile के एक पर्याप्त एकाग्रता का एक मजबूत अंलीय पीएच पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । इन शर्तों का उपयोग, नाइट्रो आधार सहित अन्य यौगिकों, nitrotyrosine से अलग किया जा सकता है. वर्तमान हालत एक अलग भौतिक संपत्ति के साथ नमूनों से 3-NT का पता लगाने के लिए उपयुक्त है (जैसे, बात और प्लाज्मा कण) ।

हवा में 3-NT का मूल्यांकन करने के लिए, फ़िल्टर वजन और पृष्ठभूमि के उंमूलन के माप महत्वपूर्ण कदम हैं । सामान्य तौर पर,7 बजे के लगभग १०० मिलीग्राम से अधिक चार से सात दिनों की अवधि में एकत्र कर रहे हैं; हालांकि, कई कारकों फिल्टर वजन से पहले और बाद में आर्द्रता और स्थैतिक विद्युत प्रभारी सहित7 संग्रह, प्रभावित करते हैं । इन प्रभावों से बचने के लिए, लंबी अवधि के लिए फिल्टर वजन का स्थिरीकरण तापमान और आर्द्रता के तहत आवश्यक है । स्थान जहां इलेक्ट्रॉनिक संतुलन स्थापित किया गया है एक स्थिर वातावरण में बनाए रखा जाना चाहिए । नमूना तैयारी के लिए, यह गैर-विशिष्ट छेड़ने कॉकटेल और ultrafiltration झिल्ली है, जो अक्सर 3-NT के लिए एक समान चोटी दिखाने से पृष्ठभूमि प्रभाव को सही करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इस विधि इनडोर वातावरण में उन सहित अंय कणों के लिए लागू किया जा सकता है । प्रोटीन के nitration उनकी एलर्जी की क्षमता में वृद्धि हो सकती है2। इसलिए, इस विधि से पर्यावरण सफाई का मूल्यांकन करने और nitrosative तनाव को रोकने में मदद मिल सकती है ।

इस अध्ययन में, हम आसान करने के लिए संभाल और सस्ती तंत्र के साथ हवा पारखी फिल्टर के वायुमंडलीय 3-NT के लिए एक अति संवेदनशील माप विधि की रिपोर्ट. वातावरण में 3-NT की पीढ़ी पर्यावरण प्रदूषण जैसे हे3, कोई2, प्रधानमंत्री प्रोटीन, और मौसम के तत्वों के साथ जुड़ा हुआ है जो मानव allergenicity को प्रभावित करता है । अंत में, वर्तमान जांच में विकसित विधि ओ3के वायुमंडलीय प्रतिक्रिया का आकलन करने में मदद कर सकते हैं, विभिंन प्रदूषक, और प्रधानमंत्री प्रोटीन विभिंन मौसम की स्थिति के तहत । वातावरण में 3-nitrotyrosine के एक अनुमान के लिए HPLC-ECD विकसित करने के इन प्रयासों के साथ, हम बेहतर पर्यावरण सफाई की आशा, मानव स्वास्थ्य में सुधार ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने टीएसपी के साथ उनकी मदद के लिए अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी के Masayuki क्युबो का शुक्रिया अदा किया/२.५ नमूना । इस काम को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर JP16K15373 और JP18H03039 के हिस्से में सपोर्ट किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software

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References

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एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-विद्युत डिटेक्टर प्रणाली के <em>माध्यम से</em> वायुमंडलीय वातावरण में 3-Nitrotyrosine का पता लगाने
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Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).More

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).

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