Vi presenterer en metode for å oppdage 3-nitrotyrosine kjemiske modifikasjoner av atmosfæriske proteiner med 6 mm-diameter runder kuttet fra luften sampler prefilters ved hjelp av en høy ytelse flytende kromatografi-elektrokjemiske detektor (såkalt HPLC-ECD).
3-nitrotyrosine (3-NT) genereres fra tyrosin rester i atmosfæriske bio-aerosol proteiner via en reaksjon med ozon (O3) og nitrogendioksid (ingen2). Stabil 3-NT er en spesifikk markør for oksidative skader og er rapportert å ha en promotive effekt å lokke fram allergi. Studien rapporterer vi utviklingen av en svært følsom analysen å kvantifisere 3-NT i sampler luftfiltre samle < 2.5 µm svevestøv (PM2.5) fra urbane miljø luft, inkludert bio-aerosol. I denne metoden, en 6 mm-diameter runde hull ble kuttet fra filtrene av luft samplere og blandet med en uspesifisert protease cocktail for å hydrolyze proteiner. Protein prøver fordøyd til aminosyre nivå ble testet for 3-NT bruker en høy ytelse flytende kromatografi-elektrokjemiske detektor (såkalt HPLC-ECD). Maksimalt 3-NT innholdet ble oppdaget i en forhåndsfiltrere PM i størrelser fra 4,5 til 7.3 μm, med oppdagelsen limit 1.13 pg/m3.
Aerosol- eller luftbårne PM inneholder proteiner fra ulike biologiske opprinnelse, inkludert virus, prokaryoter, sopp, planter (stemt) og dyr (insekter, menneskelige)1. Forholdet mellom proteininnhold i PM er anslått til nesten 5%, som har vært innblandet spille en viktig rolle som en luftbårne allergener2. Siste rapportene tyder på at urbane ambient aerosol av ulike størrelser inneholder aminosyrer med prosenter varierer mellom 0,5% og 2%3. I tillegg er kjemiske modifikasjoner av PM proteiner foreslått genereres av reaksjoner av proteiner med forskjellige miljøgifter, som O3, nitrogendioksid (ingen2) og svoveldioksid (SO2)4.
3-NT-en protein modifikasjon, genereres av nitration av tyrosin rester. En høyere konsentrasjon av O3 og ingen2 har vist seg å fremme nitration av protein molekyler i pseudo atmosfæriske plass5,6. Nitration av tyrosin rester i polypeptid kjeden forbedrer allergifremkallende potensialet av pollen proteiner7. Således, kvantifisering og vurdering av luftbårne 3-NT er et viktig aspekt i møte bekymringene til miljørettet helsevern.
3-NT er også kjent som en biomarkør av oksidativt og nitrosative stress8. En voksende mengde bevis har vist en signifikant sammenheng 3-NT innhold med flere menneskelige sykdommer9,10. På grunn av dens skadevirkninger holder gjenkjenning og kvantitativ vurdering av 3-NT i en biologisk prøve stor relevans å bestemme tilstanden til en persons helse. De siste årene, ulike metoder har blitt introdusert for å beregne NT 3-innhold, inkludert enzym knyttet immunosorbent analyser, HPLC, og LC/MS11. I tidligere studier har vi rapportert en gjenkjennings-metoden bruker mye HPLC-ECD teknikken skjenket med flere fordeler sammenlignet med tidligere metoder. For eksempel krever HPLC-ECD ikke en utvinning eller derivatization prosedyre som gjør det en relativt enkel analysen systemet12. Vi har bekreftet at denne metoden er anvendelig å oppdage 3-NT fra biologiske prøver (plasma fra menneskelige og rotten).
Mange undersøkelser har understreket påvisning av 3-NT i biologiske prøver, oppdagelsen i nonbiological prøver forblir unnvikende og derfor studien har vært forfulgt. Faktisk, for å vurdere den skadelig effekten av luftbårne 3-NT, en kvantitativ metode som er nyttig å oppdage 3-NT direkte fra luftbårne partikler er påkrevd. Derfor vi brukt metoden for eksisterende HPLC-ECD å oppdage 3-NT fra PM2.5 samlet på et glassfiber filter. Ved hjelp av teknikken, 3-NT kan registreres direkte fra små biter (6 mm-diameter runde hull) av prøven fra et PM samling filter. Vi ytterligere vurdert innholdet i 3-NT for ulike PM størrelser og målt oppdagelsen grensen på 3-NT. Denne artikkel foreslår en høy-følsom og høy gjennomstrømming metode for å oppdage 3-NT direkte fra både nonbiological og biologiske prøver.
Denne artikkelen beskriver en kvantifisering metode for å vurdere 3-NT i luftbårne PM samlet på quartz-filtre bruker svært sensitive HPLC-ECD teknikker.
Vanligvis har 3-NT målemetoder blitt utviklet som biomarkers oksidativt stress i menneskelige sykdommer. Antistoff-baserte metoder (f.eks, enzym knyttet immunosorbent analysen) regnes som semi kvantitative fordi det er ingen streng analysen validering og det er vanskelig å vurdere testens reliabilitet. HPLC med elektrokjemiske deteksjon (ECD) og masse massespektrometri-baserte analyser har tilstrekkelig sensitivitet for kvantifisering av NT 3-13. Selv om de er sensitiv, masse massespektrometri-baserte metoder som GC-MS eller GC–MS-/ MS krever derivatization av aminosyrer, og prosessen med derivatization ofte resulterer i dannelsen av gjenstander14.
I forhold til både GC og LC teknikker, HPLC-ECD er relativt billigere og har en tilstrekkelig sensitivitet til tiltak 3-NT. i tillegg til derivatization trinnet GC-og LC-MS ofte krever ekstra tid. Selv om metoden presenteres her krever 16 timer for protein fordøyelse trinn, det kan likevel gjennomføres overnatting (som beskrevet ovenfor, ca 30 minutter med hands-on tid er nødvendig per prøve). Automatisk gjenta målingen ved hjelp av en autosampler kan gi en høy gjennomstrømming målesystem. Tidligere studier har rapportert immunologiske metoder å måle 3-NT i PM2,7; men kan slike metoder ikke finne 3-NT i vintersesongen på grunn av de lave nivåene av 3-NT i PM15.
Metoden HPLC-ECD har flere fordeler fremfor andre standard metoder; for eksempel (i) en utpakkingen er ikke nødvendig i denne metoden, (ii) det er helt vaskemiddel-fri, (iii) har minimal eksempel krav og, viktigst, (iv) har høy følsomhet. Partikler som er samlet på filtre er ofte skilt med sonication for videre undersøkelser, inkludert kvantifisering av ulike komponenter. Vaskemidler brukes også til å isolere PM-bundet proteiner fra filtre. Men disse trinnene øker risikoen for forurensing, prøve tap og undervurdering på grunn av utvinning effektivitet, og dessuten de fleste vaskemidler er inkompatible med LC/MS. I metoden finnes HPLC-ECD kan HPLC prøver lett skilles fra filteret ved hjelp av en enkel hul punch og uten krav til en flere eksempler forberedelsesprosessen. Rund-formet prøven er 28.3 mm2, som er svært liten i forhold til størrelsen på det opprinnelige quartz-filteret (8 x 10 tommer = 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2).
Betingelsen HPLC-ECD har gjennomgått nøye for å unngå interferens på NT 3-signalet, som beskrevet tidligere12. En sterk surt pH mobile fase og en tilstrekkelig konsentrasjonen av acetonitrile er viktig for gjenkjenning. Bruker disse forholdene, kan andre stoffer, inkludert nitro base, skilles fra nitrotyrosine. Den nåværende tilstanden er egnet for påvisning av 3-NT fra prøver med en annen fysisk eiendom (f.eks svevestøv og plasma).
For å evaluere 3-NT i luften, måling av filteret vekten og eliminering av bakgrunnen er avgjørende skritt. Over ca 100 mg av PM7 er generelt samlet over en periode på fire til sju dager. flere faktorer påvirker imidlertid filter vekten før og etter samlingen PM7 , inkludert fuktighet og statisk elektrisk ladning. For å unngå disse effektene, er stabilisering av filteret vekten over lengre nødvendig under subequal temperatur og fuktighet. Plasseringen der den elektroniske balansen er installert bør opprettholdes i et stabilt miljø. For eksempel forberedelse er det viktig å rette bakgrunnen effektene uspesifikke protease cocktail og ultrafiltrasjon membran, som ofte viser en tilsvarende topp til 3-NT.
Denne metoden kan brukes til andre partikler, inkludert de i innendørs miljøer. Nitration av proteiner kan øke deres allergifremkallende potensielle2. Derfor kan denne metoden bidra til å evaluere miljømessige renslighet og unngå nitrosative stress.
I denne studien rapporterer vi en svært følsom målemetode for atmosfæriske 3-NT av sampler luftfiltre med enkel å håndtere og rimelig apparater. Generering av 3-NT i atmosfæren er forbundet med miljøgifter som O3, ingen2, PM proteiner og meteorologiske elementer som påvirker menneskelig allergi fremkallende. Avslutningsvis kan metoden utviklet i stede etterforskningen hjelpe for å vurdere atmosfæriske reaksjon O3, forskjellige miljøgifter og PM proteiner under ulike havner. Med disse bestrebelser for å utvikle HPLC-ECD for en vurdering av 3-nitrotyrosine i atmosfæren, forventer vi bedre miljømessige renslighet, bedre helse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Masayuki Kubo av det oss Environmental Protection Agency for hans hjelp med TS/PM2.5 prøvetaking. Dette arbeidet var støttes delvis av JSP KAKENHI Grant antall JP16K15373 og JP18H03039.
Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
Data processor | Eicom | EPC-300 | |
Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |