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Detección de 3-nitrotirosina en ambientes atmosféricos a través de un alto rendimiento sistema Detector electroquímico en cromatografía líquida

doi: 10.3791/58371 Published: January 30, 2019

Summary

Se presenta un método para la detección de 3-nitrotirosina modificaciones químicas de las proteínas atmosféricas con 6 rondas de mm de diámetro de prefiltros de muestreador de aire utilizando un detector electroquímico de cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC-ECD).

Abstract

3-nitrotirosina (3-NT) se genera de los residuos de tirosina en bio-aerosol atmosférico proteínas mediante una reacción con el ozono (O3) y dióxido de nitrógeno (NO2). Estable 3-NT es un marcador específico para el daño oxidativo y se divulga para tener un efecto promotive para provocar alergias. En el presente estudio, se presenta el desarrollo de un análisis altamente sensible para cuantificar 3-NT en los filtros de aire muestreador para recoger < 2,5 μm de material particulado (PM2,5) de aire ambiental urbano, incluyendo bio-aerosoles. En este método, un diámetro de 6 mm agujero redondo fue corte de los filtros de muestreadores de aire y mezclado con una proteasa inespecífica cóctel para hidrolizar proteínas. Las muestras de proteína digeridas a nivel del aminoácido fueron probadas para 3-NT usando un detector electroquímico de cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC-ECD). El contenido máximo de 3-NT fue detectado en un prefiltro para PM de tamaños de 4,5 a 7,3 μm, con un límite de detección de 1.13 pg/m3.

Introduction

Aerosol o aire PM contiene proteínas de diversos orígenes biológicos, incluyendo virus, procariotas, hongos, plantas (polen) y animales (insectos, humanos)1. La relación del contenido de proteínas de PM se estima que casi 5%, lo que se ha implicado a un papel importante como un alérgeno aerotransportado2. Los informes recientes sugieren que aerosol ambiental urbano de diversos tamaños contienen aminoácidos con ratios que oscilan entre 0,5% y 2%3. Además, se han sugerido modificaciones químicas de las proteínas de PM para ser generado por las reacciones de las proteínas con diversos contaminantes, tales como O3dióxido de nitrógeno (NO2) y dióxido de azufre (SO2)4.

3-NT, una modificación de la proteína, se genera por la nitración de los residuos de tirosina. Una mayor concentración de O3 y NO2 se ha demostrado para promover la nitración de las moléculas de proteína en el espacio pseudo-atmosférico5,6. La nitración de los residuos de tirosina de la cadena polipeptídica realza el potencial alergénico de polen proteínas7. Por lo tanto, la cuantificación y evaluación de aire 3-NT es un aspecto importante para abordar las preocupaciones de salud ambiental.

3-NT es también conocido como un biomarcador de oxidativo y nitrosativo estrés8. Un cuerpo emergente de la evidencia ha demostrado una asociación significativa del contenido de 3-NT con varias enfermedades humanas9,10. Debido a sus efectos perjudiciales, la detección y estimación cuantitativa de 3-NT en una muestra biológica tienen gran relevancia en la determinación de la condición de salud de un individuo. En los últimos años se han introducido diversos métodos para estimar el contenido de 3-NT, incluyendo análisis enzima-ligado del inmunosorbente, HPLC y LC/MS de11. En estudios previos, hemos reportado un método de detección mediante la técnica de HPLC-ECD concedida varias ventajas en comparación con los métodos anteriores. Por ejemplo, el HPLC-ECD no requiere un procedimiento de extracción o derivatización es un ensayo relativamente sencillo sistema12. Hemos comprobado que este método es aplicable para detectar 3-NT de muestras biológicas (plasma de humano y rata).

Aunque muchas investigaciones han hecho hincapié en la detección de 3-NT en muestras biológicas, su detección en muestras de Condado sigue siendo evasivo, y por lo tanto, el presente estudio se ha seguido. De hecho, para evaluar el efecto perjudicial de aire 3-NT, un método cuantitativo que sirve detectar 3-NT de partículas en el aire es necesario; por lo tanto, se aplicó el método de HPLC-DPI existente para detectar 3-NT de PM2.5 se recogen en un filtro de fibra de vidrio. Mediante el uso de la técnica, de 3-NT podría ser detectada directamente en pequeños pedazos (agujeros redondos de 6 mm de diámetro) de la muestra de un filtro de colección de PM. Además evalúa el contenido de 3-NT para varios tamaños de PM y mide el límite de detección de 3-NT. El presente artículo propone un método de alta sensibilidad y alto rendimiento para la detección de 3-NT directamente de muestras biológicas y procedimientos.

Protocol

1. colección de Total suspendido partículas PM2.5, o PM7y el método de hidrólisis de proteínas de PM

  1. Recoger el PM de un filtro prefiltro o copia de seguridad.
    1. Antes de la colección de partículas totales en suspensión (TSP), PM2.5y PM7, pesar el filtro de cuarzo.
      Nota: Dado que la contaminación por PM proteínas y péptidos no debería afectar la detección de la nitración de tirosina (ya que carecen de un grupo nitro), no tratamos el filtro de cuarzo a una temperatura elevada antes de la medición. Además, 3-NT contenido en el filtro de cuarzo fue bajo límite de detección, según lo determinado por HPLC-ECD.
    2. Establecer el filtro de cuarzo en un muestreador de aire de alto volumen con un selector de tamaño de partícula para recoger PM7 con un caudal de 1.000 L/min durante 7 d (figura 1B). TSP puede recogerse en un filtro de cuarzo sin un selector de tamaño (figura 1A).
    3. Recoger PM2.5 usando un muestreador de aire de bajo volumen con una unidad de clasificación de tamaño con un caudal de 116 L/min continuamente por 7 d. utilizar esta unidad, las partículas pueden clasificarse como PM4.5-2.5, PM7.3 4.5, PM15-7.3y TSP-PM15 y recogidos en filtros de cuarzo para la clasificación. PM2.5 se pueden recoger en un filtro de copia de seguridad (figura 1).
    4. Registrar el volumen de flujo total en el momento de la colección de filtro. Medir el peso del TSP, PM2.5y PM7 los filtros restando el peso efectuán el peso postcollection. Sellar el filtro en una bolsa de plástico y almacenar a-30 ° C hasta el siguiente paso (ver sección 2).
  2. Proteolyze las muestras.
    1. Disolver el cóctel de proteasas inespecíficas con un tampón de acetato de 0,1 M (pH 7,4). Poner la solución en una membrana de diálisis (corte de peso molecular = Da 5.000) y sumergirlo en 1 L de tampón de acetato de 0,1 M con agitación a 4 ° C. Reemplazar el buffer 2 x cada 12 h y luego realizar diálisis durante la noche para eliminar 3-NT endógeno y nitrito (NO2). Después de la diálisis, recolectar la solución y medir la concentración de proteína por bicinchoninic ácido análisis de proteína (BCA).
    2. Punzón redondeos círculos de 6 mm el prefiltro o filtro de copia de seguridad y ponerlas en microtubos. Hasta cinco piezas de fracciones de 6 mm puede utilizarse para el análisis (figura 2).
    3. Añadir 300 μL de tampón de acetato de 0,1 M que contiene 50 μg de proteína de la proteasa no específica cóctel (preparado en el paso 1.2.1) al tubo para hidrolizar las proteínas de PM a 50 ° C por 16 h con rotación.
      Nota: Para restar endógena 3-NT de la solución Cóctel de proteasas no específicas, es necesario preparar y digerir una muestra sólo Cóctel de proteasas no específicas.
    4. Enjuagar la membrana de ultrafiltración junto con el tubo suministrado mediante la adición del tampón de acetato de 0,1 M y centrifugación (10.000 x g por 30 seg; velocidad exacta depende de la membrana), debido a la contaminación de productos químicos similares a 3-NT en la membrana. Repetir el enjuague 1 x.
    5. La proteólisis, centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 10 minutos carga el sobrenadante en la membrana de ultrafiltración y centrifugar a 10.000 x g y 4 ° C por ultrafiltración (MWCO = 10.000), hasta que se recoge suficiente volumen de elución. Almacenar los eluatos a 4 ° C en la oscuridad.
      PRECAUCIÓN: Debido a la detección de un pico similar a 3-NT en la columna de vuelta, es necesario lavarla bien con agua limpia o con un tampón como agua HPLC y un tampón de acetato de 0,1 M previo para utilizar.

2. determinación del contenido de 3-NT en TSP, PM2,5y7PMa través de un alto rendimiento cromatografía líquida y sistema de detección electroquímica (HPLC-ECD)

Nota: Consulte la figura 3.

  1. Preparar la fase móvil.
    1. Preparar 0.2 M fosfato tampón (pH 2.5) que contiene 50 mg/L EDTA. Medir 98 volúmenes del buffer y dos volúmenes de acetonitrilo (grado HPLC), viértalos en una botella de vidrio limpia y mezcla vigorosamente con una tapa.
    2. Colocar la fase móvil a temperatura ambiente durante varias horas hasta que el aire disuelto se plana.
      Nota: Si el sistema se inicia más temprano, la fase móvil puede ser sonicada y desgasificada en un vacío. Sin embargo, desgasificación demasiado va a cambiar la relación entre el agua y la fase orgánica por medio de evaporación.
  2. El sistema de HPLC-ECD consta de una bomba, una columna HPLC, un desgasificador, una ECD y un inyector. Equilibrar la fase móvil y estabilizar el sistema para reducir el fondo y el ruido.
    1. Instalar la fase móvil y la columna HPLC en el sistema HPLC. Encienda la bomba HPLC y estabilizar la columna con la fase móvil a un flujo de 500 μl/min a 25 ° C temperatura de columna desde el día antes del día de inicio.
    2. Al día siguiente, encender el ECD y los parámetros (la tensión de reducción al-900 mV y la tensión de excitación en 400 mV). Estabilizar durante al menos 3 horas.
  3. Medir la concentración de 3-NT en el PM7.
    1. Preparar diferentes concentraciones de 3-NT (5-500 nM) y un espacio en blanco (sin el 3-NT estándar e inespecífico proteasa cóctel, para asegurarse de que el frasco ni el búfer es contaminado) en un tampón de acetato de 0,1 M.
    2. Ejecutar el procesador de datos HPLC.
    3. Poner cubetas el auto inyector y el volumen de inyección de 25 μl. operar las mismas condiciones de fase móvil y la velocidad de flujo como se menciona en el paso 2.2.1.
      Nota: Si la preparación de la muestra es completa, debe haber muestras, un estándar (5-500 nM), una muestra de sólo Cóctel de proteasas no específicas y un frasco en blanco.
    4. Asegúrese de que la línea de base en el cromatograma es plana y comenzar la inyección de la muestra.
      Nota: Por lo general, 3-NT es detectado en 20-21 min; sin embargo, aproximadamente 30 min se recomienda como el tiempo de ejecución por inyección de la muestra. De lo contrario, picos de contaminante se incluirán en la próxima carrera.

3. Análisis de los cromatogramas y cuantificación del contenido de 3-NT en PM7

  1. Ver el pico de 3-NT de los cromatogramas y calcular el contenido.
    1. Después de la recolección de datos, abra el archivo de datos del cromatograma con software de análisis.
    2. Trazar una línea entre el pico de 3-NT desde la línea de fondo plano y leer la altura de la línea dibujada.
      Nota: El límite cuantitativo es de aproximadamente 5 nM (fmol 125 en una inyección de 25 μl).
      PRECAUCIÓN: El electrodo en la primera infancia se convierte en agotados lentamente, y el límite será alto debido a la relación S/N.
    3. Preparar una línea de regresión de los picos de 3-NT estándar, calcular la pendiente e interceptar.
    4. Asignar estas constantes en la siguiente ecuación y calcular el contenido de 3-NT en las muestras como sigue.
      Muestra 3 – NT (nM) = [pico de la muestra – interceptar] / pendiente de la ecuación (1)
      Nota: La curva estándar debe ser bien representada como una línea recta entre 5 nM y 500 nM.
  2. Calcular el NT 3 en aire ambiente y PM7 del frasco de la muestra.
    1. Multiplicar la concentración de 3-NT por el volumen de reacción (y el factor de dilución, si alguna) y evaluar el contenido absoluto de 3-NT en PM7 del círculo.
    2. Medir el área de filtro recogido y calcular el contenido de 3-NT en el PM total7 filtro por la siguiente ecuación.
      Total PM7 = [3-NT contenido en PM7 del círculo] x [relación del área de filtro de7 PM al área del círculo] x 226.19 (en el caso de conversión de moles a gramos) ecuación (2)
    3. Evaluar el contenido de 3-NT en el aire ambiente o PM7 dividiendo el total de la PM7 el caudal de aire total o PM7 peso (registrado en el paso 1.1.3).

Representative Results

El principio de HPLC-ECD es simple. Las muestras que contienen el objetivo están separadas por la columna de HPLC y fase móvil, y el compuesto objetivo separado es reducido y oxidado en el detector electroquímico.

En el sistema HPLC-ECD, se detecta un pico de 3-NT en aproximadamente 22 minutos. ECDs (PEC-510 y HTEC-500) están conectados paralelamente en la línea HPLC. El primer DIT reduce los grupos hidroxilo en los compuestos, y la próxima oxida las sustancias reducidas. ECDs tienen un rango de detección altamente sensibles de 10-15 M. El límite de detección del sistema HPLC-ECD fue 1.13 pg/m3, que se calculó como la media señal basal (mV) de 10 piezas x 3.

Cromatogramas representativos se muestran en la figura 4. Mediante el análisis de un estándar de 3-NT puro, un pico definitivo con una línea de base estable puede ser detectada (Figura 4A). 3-NT en PM7 también se midió con 6 mm, forma redonda de las muestras (Figura 4B).

Con respecto a la exactitud de la capacidad de detección de 3-NT, cuando un estándar de 3-NT fue inyectado en el HPLC, el pico correspondiente a 3-NT fue detectado en un tiempo de retención de 20 minutos. En las muestras de PM, 3-NT fue separado de otras sustancias, y el independiente pico fue detectado en el mismo tiempo de retención como el estándar. Una típica curva estándar se muestra en la figura 5, donde se observa la linealidad entre 5 y 40 nM. Linealidad se puede ver hasta 500 nM (datos no mostrados).

La tabla 1 muestra el contenido de 3-NT en la atmósfera, calculada como pg/m3 de aire. Se observó la mayor concentración de 3-NT en un prefiltro de PM2.5 en #3 (PM7.3 4.5).

Figure 1
Figura 1 : Esquema de la colección de TSP, PM7y PM2.5. (A) las partículas totales en suspensión (TSP) son recogidas directamente en un filtro de colección (con un caudal de 1.000 L/min). (B) cuando PM7 , las partículas grandes quedan excluidas por un selector de tamaño (con un caudal de 1.000 L/min). (C) PM2.5 se recogen a través de cuatro prefiltros (con un caudal de 116 L/min). Un filtro de cuarzo es utilizado como un filtro de copia de seguridad para PM7 y PM2.5 o como un filtro de colección de TSP, como se muestra en esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Preparación de un círculo redondo m 6. El filtro de la colección fue cortado con una herramienta de hueco con un diámetro de 6 mm. La muestra se almacena en un microtubo de 1.5 mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Diagrama esquemático del sistema HPLC-dpi. 3-NT en una muestra inyectada fue separado en la columna HPLC a través de la cual fluye de la fase móvil. 3-NT fue reducido a aminotyrosine oxidado a iminotyrosine y detectan electroquímicamente en el detector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Cromatogramas típicos en el sistema HPLC-dpi. (A) puro 3-NT analizado por el sistema de HPLC-ECD. Muestra de círculo de 6 mm (B) de un filtro de7 PM USA para detectar 3-NT. Un pico de 3-NT es indicado por una flecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Curva estándar de muestras puras de 3-NT. En otro gráfico se indican los resultados a una concentración menor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Asunto Días de
Colección
Punto 3-NT
(pg/m3 de aire)
PM2.5 Prefiltro #1 27 4 8,25 ± 0.37
Prefiltro #2 27 4 29.66 ± 1.94
Prefiltro #3 27 4 74.37 ± 4.09
Prefiltro #4 27 4 32.70 ± 0.75
Backfilter 7 5 4.21 ± 0.91
PM7 Backfilter 7 1 89.16 ± 6,36
TSP Filtro 7 1 10.34 ± 2.09

Tabla 1: 3-NT en la atmósfera, medida por el sistema de HPLC-dpi. Las manchas circulares de 6 mm de cada filtro se midieron con el sistema de HPLC-ECD. Prefiltros #1 - #4 se recolectaron en el mismo período. Tenga en cuenta que las concentraciones de 3-NT en el aire están influenciadas por diversos factores, como la fecha de recogida, año o lugar. Los datos (n = 3-10) son representados como la media ± el error estándar.

Discussion

Este artículo describe un método de cuantificación para evaluar 3-NT en PM aire recogida en filtros de cuarzo mediante técnicas altamente sensibles de HPLC-ECD.

En general, han sido desarrollados métodos de medición de 3-NT como biomarcadores de estrés oxidativo en enfermedades humanas. Métodos basados en anticuerpos (p. ej., el análisis enzima-ligado del inmunosorbente) son considerados como semi cuantitativo porque no hay ninguna validación análisis estricto y es difícil evaluar la confiabilidad de la prueba. HPLC con detección electroquímica (ECD) y ensayos basados en espectrometría de masa tienen la sensibilidad adecuada para la cuantificación de 3-NT13. Aunque son sensibles, como de métodos basados en espectrometría de masas GC-MS o GC-MS/MS requieren la derivatización de los aminoácidos, y el proceso de derivatización a menudo resulta en la formación de artefactos14.

Comparado con técnicas de la GC y LC, HPLC-ECD es relativamente menos costoso y tiene una sensibilidad suficiente a la medida 3-NT. Además, el paso de derivatización en GC-MS y LC-MS a menudo requiere tiempo adicional. Aunque el método presentado aquí requiere 16 horas para el paso de la digestión de proteínas, se puede, sin embargo, llevar a cabo durante la noche (como se describió anteriormente, se requiere muestra, unos 30 minutos de tiempo de práctica). Repetición automática de la medida mediante el uso de un muestreador automático puede proporcionar un sistema de medición de alto rendimiento. Estudios previos han reportado métodos inmunológicos para medir 3-NT en PM2,7; sin embargo, tales métodos no pudieran detectar 3-NT en el invierno debido a los bajos niveles de 3-NT en el PM15.

El método de HPLC-ECD tiene ventajas sobre otros métodos estándar; por ejemplo, (i) un proceso de extracción no se requiere en este método, (ii) es totalmente libre de detergente, (iii) no tiene requisito de mínimo de la muestra y, lo que es importante, (iv) tiene alta sensibilidad. Las partículas que se recogen en los filtros con frecuencia están separadas por sonicación para otras investigaciones, incluyendo la cuantificación de varios componentes. También se utilizan detergentes para aislar proteínas de PM-límite de filtros. Sin embargo, estos pasos adicionales aumentan el riesgo de contaminación, pérdida de muestra y subestimación debido a la eficiencia de la extracción, y además, la mayoría de los detergentes es incompatible con la LC/MS. En el presente método de HPLC-ECD, muestras HPLC fácilmente pueden ser separadas del filtro mediante un simple punzón hueco y sin el requisito de un proceso de preparación de muestra adicional. El área de la muestra en forma de redonda es 28,3 mm2, que es muy pequeño comparado con el tamaño del filtro original de cuarzo (8 x 10 pulgadas = 203.2 x 254 mm = 51.600 mm2).

La condición de HPLC-ECD ha sido revisada cuidadosamente para evitar interferencias a la señal de 3-NT, como se describió anteriormente12. Un fuerte pH ácido de la fase móvil y una adecuada concentración de acetonitrilo es importante para la detección. Estas condiciones de uso, otros compuestos, incluyendo nitro base, pueden ser separados de nitrotirosina. La situación actual es conveniente para la detección de 3-NT de muestras con una propiedad física diferente (por ejemplo, materia de partículas y plasma).

Para evaluar 3-NT en el aire, la medición del peso de filtro y la eliminación del fondo son pasos críticos. En general, en aproximadamente 100 mg de PM7 se recogen en un período de cuatro a siete días; sin embargo, varios factores afectan el peso del filtro antes y después de la colección de7 PM, incluyendo humedad y electricidad estática. Para evitar estos efectos, la estabilización del peso filtro durante largos periodos es necesaria bajo humedad y temperatura pueden. La ubicación donde está instalado el equilibrio electrónico debería mantenerse en un ambiente estable. Para la preparación de la muestra, es importante corregir los efectos de fondo de la proteasa no específico cóctel y la membrana de ultrafiltración, que demuestran a menudo un pico similar a 3-NT.

Este método puede aplicarse a otras partículas, incluyendo aquellas en ambientes de interior. La nitración de proteínas puede aumentar su potencial alergénico2. Por lo tanto, este método puede ayudar a evaluar la limpieza ambiental y prevenir el estrés nitrosativo.

En este estudio, Divulgamos un método altamente sensible de medición atmosférica 3-NT muestreador de filtros de aire con el aparato fácil de manejar y de bajo costo. La generación de 3-NT en la atmósfera se asocia con contaminantes ambientales como el O3, NO2, proteínas de PM y elementos meteorológicos que afectan la alergenicidad humana. En conclusión, el método desarrollado en la presente investigación puede ayudar a evaluar la reacción atmosférica de O3, distintos contaminantes y proteínas de PM bajo diversas condiciones meteorológicas. Con estos esfuerzos de desarrollo de HPLC-dpi para una valoración de 3-nitrotirosina en el ambiente, esperamos mejor limpieza ambiental, mejorar la salud humana.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el Masayuki Kubo de la nosotros Agencia de protección ambiental por su ayuda con el muestreo de TSP/PM2.5 . Este trabajo fue apoyado en parte por JSP KAKENHI concesión número JP16K15373 y JP18H03039.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software

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Detección de 3-nitrotirosina en ambientes atmosféricos <em>a través de</em> un alto rendimiento sistema Detector electroquímico en cromatografía líquida
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Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).More

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).

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