Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

3-Nitrotyrosine atmosferik ortamlar üzerinden yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör sistemi tespiti

doi: 10.3791/58371 Published: January 30, 2019

Summary

Biz bir yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör (HPLC-ECD) kullanarak hava örnekleyici prefilters--dan kesmek 6 mm çaplı mermi ile 3-nitrotyrosine atmosferik proteinlerin kimyasal değişimleri tespit etmek için bir yöntem mevcut.

Abstract

3-nitrotyrosine (3-NT) Tirozin kalıntı atmosferik biyo-aerosol proteinler aracılığıyla bir tepki ile ozon (O3) ve azot dioksit (NO2) içinde oluşturulur. İstikrarlı 3-NT oksidatif hasar için belirli bir belirtecidir ve alerji temin için değerlerinin bir etkisi olduğu bildirilmektedir. Bu da çalışmanın, biyo-aerosol dahil olmak üzere kentsel çevre havadan 3-NT < 2.5 µm partikül madde (PM2.5) toplamak için hava örnekleyici filtrelerindeki ölçmek için son derece hassas bir tahlil gelişimi rapor. Bu yöntemde, 6 mm çaplı yuvarlak delik hava numune filtreler--dan kesmek ve proteinleri hidrolize için özel olmayan bir proteaz kokteyl ile karışık. Amino asit seviyeye sindirilmiş protein örnekleri 3-bir yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör (HPLC-ECD) kullanarak, NT için test edildi. Maksimum 3-NT oranı 7,3 mikron, 4.5 ölçüler PM algılama limitli 1.13 pg/m3için bir prefilter tespit edilmiştir.

Introduction

Aerosol veya hava indirme PM virüsler, prokaryot, mantarlar, bitkiler (polen) ve hayvanlar (böcekler, insan)1de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik kökenli proteinler içerir. Protein içeriği PM içinde oranı neredeyse hangi bir havada alerjen2olarak önemli bir rol oynamak için karıştığı % 5, olduğu tahmin edilmektedir. Son raporlar öneririz bu kentsel ortam aerosol çeşitli boyutları ile % 0,5 ile % 23arasında değişen oranlarda amino asitler içerir. Buna ek olarak, PM proteinlerin kimyasal değişimleri O3, azot dioksit (NO2) ve kükürt dioksit (SO2)4gibi çeşitli kirleticiler ile proteinlerin reaksiyonlar tarafından oluşturulacak önerilmiştir.

3-NT — bir protein değişiklik — Tirozin kalıntıları nitration tarafından oluşturulur. O3 ve hiçbir2 daha yüksek bir konsantrasyon protein molekülleri sözde atmosferik alan5,6nitration tanıtmak için gösterilmiştir. Tirozin kalıntılarında polipeptid zinciri nitration polen proteinler7alerjenik potansiyelini artırır. Böylece, miktar ve hava 3-NT değerlendirmenin çevre sağlığı endişelerini ele önemli bir yönü olduğunu.

Olarak da bilinen bir biyomarker oksidatif, 3 NT ve nitrosative stres8. Kanıt ortaya çıkan bir vücut 3-NT içeriği anlamlı bir ilişki birkaç insan hastalıkları9,10ile göstermiştir. Zararlı etkileri nedeniyle, algılama ve nicel tahmini 3-NT biyolojik örnek bir bireyin sağlık durumunu belirlemede büyük alaka tutun. Son yıllarda, çeşitli yöntemleri enzim bağlı immunosorbent deneyleri, HPLC, 3 NT içeriği tahmin etmek için ortaya konan ve LC/MS11. Önceki çalışmalarda, önceki yöntemlerine göre birçok avantajı ile ihsan HPLC-ECD tekniği kullanarak bir algılama yöntemi bildirdin. Örneğin, HPLC ECD nispeten basit tahlil sistem12oldu bir çekme ya da derivatization yordam gerektirmez. Biz bu yöntem 3-biyolojik örnekleri (plazma üzerinden insan ve fare) NT'den algılamak için uygulanabilir olduğunu doğruladı.

Birçok araştırmalar 3-NT biyolojik örneklerde tespiti vurgulamamıza rağmen onun algılama nonbiological örneklerinde zor kalır ve dolayısıyla da çalışmanın takip edilmiştir. Aslında, havadaki zararlı etkisini değerlendirmek için 3-NT, 3-NT doğrudan doğruya--dan hava parçacıkları tespit etmek yararlı bir nicel yöntemi gereklidir; Bu nedenle, algılamak için varolan HPLC-ECD yöntemi uygulanan 3-NT PM üzerinden2.5 toplanan Cam elyaflı filtre. Kullanarak tekniği, 3 NT doğrudan küçük tespit edilemedi (6 mm çaplı yuvarlak delikler) adet örnek bir PM koleksiyonu filtresinin dışında. Biz daha fazla 3-NT çeşitli PM boyutları için içeriği değerlendirildi ve algılama sınırı 3-NT ölçülür. Mevcut Madde 3-NT doğrudan doğruya--dan nonbiological ve biyolojik örnekler tespit etmek için yüksek-duyarlı ve yüksek işlem hacmi bir yöntem öneriyor.

Protocol

1. Toplam topluluğu parçacıklar, PM2.5, veya PM7ve hidroliz yöntemi PM proteinler için askıya

  1. Başbakanın prefilter veya yedek filtre toplamak.
    1. Toplam askıya alınan parçacıklar (TSP), PM2.5ve PM7koleksiyonu önce kuvars filtre tartın.
      Not: Verilen (onlar böyle bir nitro grup eksikliği gibi) kontaminasyon PM proteinler ve peptidler Tirozin nitration tespiti etkilememelidir, biz yüksek bir sıcaklık ölçüm önce kuvars filtre tedavi değil. Ayrıca, kuvars filtre içeriğinde 3-NT HPLC-ECD tarafından belirlenen algılama sınırının altında yapıldı.
    2. Kuvars filtre PM7 ' de 1000 L/dk 7 d (Şekil 1B) için sürekli bir akış hızı toplamak için bir parçacık boyutu seçici ile yüksek hacimli hava örnekleyici üzerinde ayarlayın. Çay kaşığı bir kuvars filtre boyutu seçici (Şekil 1A) olmadan üzerinde toplanabilir.
    3. Düşük hacimli hava örnekleyici boyutu sınıflandırma birimi 116 L/dk akış hızında olan kullanarak sürekli için 7 PM2.5 toplamak ö. bu birim kullanarak parçacıklar PM4.5-2.5, PM7,3-4.5, PM15-7,3ve çay kaşığı-am15 sınıflandırılabilir ve Kuvars filtreler için sınıflandırma üzerine toplanan. PM2,5 yedek filtre (Şekil 1 c) toplanabilir.
    4. Toplam akış ses filtre toplanması sırasında kayıt. TSP, ağırlığını ölçmek PM2.5ve PM7 precollection kilo postcollection kilo gelen çıkarılarak tarafından filtreleri. Filtre bir plastik torba mühür ve bir sonraki adım (bakınız Bölüm 2) kadar-30 ° C'de saklayın.
  2. Proteolyze örnekleri.
    1. Nonspesifik proteaz kokteyl 0.1 M asetat arabelleği (pH 7,4) ile geçiyoruz. Çözüm diyaliz membran koymak (moleküler ağırlık kesme 5000 Da =) ve 0.1 M asetat arabellek karıştırarak 4 ° C'de ile 1 litre bırakın Her 12 h x 2 arabellek değiştirmek ve diyaliz gecede endojen 3-NT ve nitrit (NO2-) kaldırmak için gerçekleştirin. Diyaliz sonra çözüm toplamak ve protein konsantrasyonu bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil tarafından ölçün.
    2. Prefilter veya yedek filtre 6 mm yuvarlak daire yumruk ve mikrotüpler koydu. En çok beş adet 6 mm kesirler Analizi (Şekil 2) için kullanılabilir.
    3. 0.1 M asetat arabelleği (1.2.1 adımda hazırlanan) 50 µg nonspesifik proteaz kokteyl protein PM proteinler için döndürme 16 h 50 ° C'de hidrolize tüp içeren 300 µL ekleyin.
      Not: endojen çıkartmak için 3-NT nonspesifik proteaz kokteyl çözümden bu hazırlamak ve nonspesifik proteaz salt kokteyl örnek sindirmek gereklidir.
    4. 0.1 M asetat arabellek ekleme ve centrifuging Ultrafiltrasyon membran ile birlikte sağlanan onun tüp durulama (10.000 x g 30 saniye; tam hız membran üzerinde bağlıdır), kimyasal madde 3-NT zarda benzer bulaşıcı nedeniyle. Durulama 1 tekrar x.
    5. Sonrası proteolizis, 2500 x g 10 dk. yük süpernatant için de örnekleri Ultrafiltrasyon membran santrifüj kapasitesi ve 10.000 x g ve Ultrafiltrasyon için 4 ° C'santrifüj kapasitesi (MWCO = 10.000), elüsyon yeterli hacmi toplanan kadar. Karanlıkta eluates 4 ° C'de depolayın.
      Dikkat: 3-NT spin sütundaki benzer bir zirveye tespiti nedeniyle, temiz su ile iyi veya HPLC su gibi bir arabellek ve 0.1 M asetat arabellek önceden kullanmak için yıkamak gerekli olduğunu.

2. tatlı kaşığı, PM2.5ve am7yolu ile yüksek performanslı sıvı kromatografi ve elektrokimyasal algılama (HPLC-ECD) sistemi 3 NT içerik tespiti

Not: Bkz. Şekil 3.

  1. Mobil faz hazırlayın.
    1. 0.2 M fosfat tampon (pH 2.5) içeren 50 mg/L EDTA hazırlayın. Arabellek 98 birimleri ve Asetonitril (HPLC grade) iki cilt kapalı ölçmek, onları temiz cam şişe içine dökün ve bir kap ile kuvvetle karıştırın.
    2. Mobil faz çözünmüş hava düz gider kadar birkaç saat oda sıcaklığında yerleşmek.
      Not: sistem daha önce başlatılmışsa, mobil faz olabilir sonicated ve bir vakum altında degassed. Ancak, aşırı gaz giderme su ve Organik faz üzerinden buharlaşma arasındaki oranı değişir.
  2. HPLC-ECD sistem bir pompa, HPLC sütun, bir degasser, bir ECD ve bir enjektör oluşur. Mobil faz equilibrate ve arka plan ve gürültü azaltmak için sistem stabilize.
    1. Mobil faz ve HPLC sütun HPLC sistemi yükleyin. HPLC pompa ve 500 µL/dak, 25 ° C sütun sıcaklığında başlangıç gününü önceki gün gelen akış hızında mobil faz sütunla stabilize.
    2. Ertesi gün ECD tutuşturmak ve parametrelerini ayarlamak (azaltma gerilim-900, mV ve uyarma gerilimi 400 mV). En az 3 h stabilize.
  3. 3-NT konsantrasyon PM7ölçmek.
    1. (Standart ve özel olmayan 3-NT proteaz ne şişe, ne de arabellek emin olmak için kokteyl kontamine olmadan) 3-NT standartları (5-500 nM) ve boş bir çeşitli konsantrasyonları bir 0.1 M asetat arabellekte hazırlayın.
    2. HPLC veri işlemcisi çalıştırın.
    3. Örnek şişeleri koymak belgili tanımlık auto-enjektör ve seti 25 µL. enjeksiyon birime mobil faz ve adım 2.2.1 belirtildiği gibi akış hızı aynı koşullar çalışır.
      Not: numune hazırlama tamamsa, olmalıdır örnekler, bir standart (5-500 nM), nonspesifik proteaz salt kokteyl örnek ve boş bir şişe.
    4. Kromatografik temelde düz olduğundan emin olun ve örnek enjeksiyon başlatın.
      Not: Genel olarak, 20-21 min 3-NT algılanır; Bununla birlikte, yaklaşık 30 dakika örnek enjeksiyon başına çalışma süresi olarak önerilir. Aksi takdirde, kirletici doruklarına sonraki vadede eklenecektir.

3. Chromatograms ve miktar PM7 3-NT içerik analizi

  1. 3-NT en yüksek chromatograms içinde kontrol ve içeriği hesaplayın.
    1. Sonra veri toplama, analiz yazılımı ile kromatografik veri dosyasını açın.
    2. Düz satır taban çizgisinden 3-NT tepe arasında bir çizgi çizin ve pik yüksekliği çizilmiş satırından okuyun.
      Not: Nicel sınırıdır yaklaşık 5 nM (25 µL enjeksiyon içinde 125 fmol).
      Dikkat: Elektrot ECD içinde yavaş yavaş tükenmiş olur ve sınırı nedeniyle S/N oranı yüksek olacaktır.
    3. 3-NT standart doruklarına regresyon satırından hazırlamak, yamaç hesaplamak ve yolunu kesmek.
    4. Bu sabitler aşağıdaki denklemi içine atamak ve örnekleri 3-NT içeriğinde aşağıdaki gibi hesaplar.
      Örnek 3-NT (nM) = [örnek tepe-yolunu kesmek] / yamaç EQ (1)
      Not: Standart eğri de 5 arasında düz bir çizgi olarak temsil edilmeli nM ve 500 nM.
  2. 3-NT hava çevre ve PM7 ' den örnek şişeyi hesaplayın.
    1. 3-NT konsantrasyon tepki birim (ve seyreltme faktörü varsa) tarafından çarpın ve mutlak 3-NT içeriği PM7 daire değerlendirmek.
    2. Toplanan filtre alanına ölçmek ve 3 NT içeriği toplam PM içinde hesaplamak aşağıdaki denklem filtresiyle7 .
      Toplam PM7 [3-NT içerik dairenin PM7 ] = [daire alan PM7 filtre alanına oranı] x x 226.19 (durumunda mol gram için dönüştürme) EQ (2)
    3. Toplam Hava akışı birim veya PM tarafından toplam PM7 bölerek hava çevre veya PM7 3-NT içeriğinde değerlendirmek (1.1.3 adımda kaydedilen)7 kilo.

Representative Results

HPLC-ECD Prensibi basittir. Hedef içeren örnekleri HPLC sütun ve mobil faz tarafından ayrılır ve ayrı hedef bileşik ve/veya azaltılmış elektrokimyasal Dedektör okside.

HPLC-ECD sisteminde yaklaşık 22 dakika sonra 3-NT zirve algılanır. ECDs (PEC-510 ve HTEC-500) tandem HPLC doğrultusunda bağlı. İlk ECD bileşikleri hidroksil gruplarını azaltır ve sonraki azaltılmış kimyasallar oksitlenir. ECDs 10-15 M bir son derece hassas algılama aralığı vardır. HPLC-ECD sistem algılama sınırı ortalama bazal sinyali 10 parça x 3 (mV) hesaplanan 1.13 pg/m3, idi.

Temsilcisi chromatograms Şekil 4' te gösterilmiştir. Saf bir 3-NT standart analiz ederek, kesin bir tepe ile istikrarlı bir temel olabilir (Şekil 4A) algıladı. 3-NT PM7 6 mm, yuvarlak şekilli örnekleri (Şekil 4B) kullanarak da ölçüldü.

3-NT standart HPLC, enjekte edildiğinde 3-NT algılama becerisi doğruluğu ile ilgili 3-NT için karşılık gelen en yüksek 20 dakikalık saklama teker teker tespit edilmiştir. PM örnekleri, 3 NT başka maddeler ayrılmış ve bağımsız en yüksek standart olarak aynı saklama anda algılandı. Tipik bir standart eğri Şekil 5nerede doğrusallık 5 ila 40 nM arasında gözlenen, gösterilir. Doğrusallık 500 kadar görülebilir nM (veri gösterilmez).

Tablo 1 atmosfer pg/m3 hava hesaplanan, 3 NT İçindekiler gösterir. 3-bir PM2.5 prefilter NT'de en yoğun #3 (PM7,3-4.5) gözlenmiştir.

Figure 1
Resim 1 : Toplama düzeni için TSP, PM7ve am2.5. (A)toplam askıya alınan parçacıklar (TSP) doğrudan bir koleksiyon filtre (hızında bir akış 1000 L/dak) üzerine toplanır. (B) PM7 toplanan zaman büyük parçacıkların boyutu seçici (hızında bir akış 1000 L/dak) hariç tutulur. (C) PM2.5 (hızında bir akış 116 L/dak) dört prefilters üzerinden toplanır. Kuvars filtre genellikle PM7 ve am2.5 için yedek filtre olarak veya çay kaşığı için koleksiyon filtre olarak bu şekilde gösterildiği gibi kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : 6 mm-yuvarlak daire hazırlanması. Koleksiyon filtre ile 6 mm çapında bir çukur yumruk aracını kullanarak kesildi. Daha sonra örnek bir 1.5 mL microtube içinde depolanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : HPLC-ECD sistem Şematik diyagramı. 3-NT enjekte bir örnek üzerinden mobil faz akar HPLC sütunundaki ayrıldı. 3-NT aminotyrosine için azaltılmış, iminotyrosine için okside ve mamüllerinin dedektörü algılandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : HPLC-ECD sisteminde tipik chromatograms. (A)saf 3-HPLC-ECD sistem tarafından analiz NT. (B) 6 mm daire örnek bir PM7 filtresinin dışında kullanılan 3-NT algılamak için. 3-NT en yüksek bir okla belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Saf 3-NT örnekleri standart eğri. Düşük yoğunluklu sonuçlara başka bir grafikte gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Konu Gün
Koleksiyonu
Spot 3-NT
(pg/m3 hava)
PM2.5 #1 prefilter 27 4 8.25 ± 0.37
#2 prefilter 27 4 29.66 ± 1.94
PreFilter #3 27 4 74.37 ± 4.09
#4 prefilter 27 4 32.70 ± 0,75
Backfilter 7 5 4.21 ± 0,91
7 Backfilter 7 1 89.16 ± 6.36
ÇAY KAŞIĞI Filtre 7 1 10.34 ± 2.09

Tablo 1: 3-NT HPLC-ECD sistemi tarafından ölçülen atmosferde. 6 mm dairesel noktalar her filtre üzerinden HPLC-ECD sistemi kullanılarak ölçüldü. #1 - #4 prefilters aynı dönemde toplanmıştır. Not 3-NT Havadaki konsantrasyonları toplanan Tarih, yıl veya konum gibi çeşitli faktörlerden etkilenir. Verileri (n = 3-10) vardır ortalama ± standart hata temsil.

Discussion

Bu makalede bir miktar yöntemi hava indirme PM Kuvars filtreler son derece hassas HPLC-ECD teknikleri kullanarak toplanan 3-NT değerlendirmektir.

Genel olarak, 3 NT ölçüm yöntemleri insan hastalıklarda oksidatif stres biyolojik olarak geliştirilmiştir. Antikor tabanlı yöntemleri (Örneğin, enzim bağlı immunosorbent assay) yarı kantitatif hiçbir katı tahlil doğrulama ve testin güvenilirliğini değerlendirmek zordur çünkü kabul edilir. HPLC elektrokimyasal algılama (ECD) ve kütle spektrometresi tabanlı deneyleri ile 3-NT13miktar için yeterli hassasiyeti var. Hassas olmalarına karşın, GC-MS gibi kütle spektrometresi tabanlı yöntem veya GC-MS/MS amino asitlerin derivatization gerektirir ve derivatization kez işlem eserler14oluşumunda sonuçlanır.

GC ve LC teknikleri için karşılaştırıldığında, HPLC-ECD nispeten ucuzdur ve ölçü 3 için yeterli bir duyarlılığa sahiptir-NT. Ayrıca, GC-MS ve LC-MS derivatization adımda kez ek süresi gerektirir. Burada sunulan Yöntem 16 saat için protein sindirimi adım gerektirir, ancak bu yine de, gece boyunca dışarıda yapılabilir (yukarıda açıklandığı gibi yaklaşık 30 dakika eller zaman gereklidir örnek). Bir Otomatik Örnekleyici kullanarak otomatik tekrar ölçüm bir yüksek-den geçerek ölçüm sistemi sağlayabilir. Önceki çalışmalar ölçmek için immünolojik Yöntemler bildirdin 3-NT PM2,7; Ancak, bu tür yöntemleri 3-NT PM15seviyesinin düşük nedeniyle kış sezonunda 3-NT algılayamadı.

HPLC-ECD yöntemi diğer standart yöntemler üzerinde ek avantajları vardır; Örneğin, (i) bir ayıklama işlemi bu yöntemde gerekli değildir, (ii) Bu tamamen deterjan ücretsiz, (iii) bu en az örnek gereksinimi vardır ve, önemlisi, (iv) Bu yüksek duyarlılığa sahiptir. Filtreler toplanan parçacıklar sık sonication miktar çeşitli bileşenleri de dahil olmak üzere daha fazla araştırmalar için ayrılır. Deterjanlar da PM bağlı proteinler filtrelerden izole etmek için kullanılır. Ancak, aşağıdaki ek adımları kirlenme, örnek kaybı ve küçümseme ayıklama verimliliği nedeniyle riski artar ve ayrıca, çoğu deterjanlar LC/MS ile uyumsuzdur. Mevcut HPLC-ECD yönteminde HPLC örnekleri kolayca filtresinden basit bir oyuk yumruk kullanarak ve bir ek örnek hazırlama sürecinin zorunluluğu olmadan ayrılabilir. 28,3 mm2orijinal kuvars filtre boyuta göre çok küçüktür, yuvarlak şekilli örnek alanıdır (8 x 10 inç 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2=).

HPLC-ECD durumu dikkatlice 3-NT sinyal için bir girişimi engellemek için gözden geçirilmiş12daha önce açıklandığı gibi. Güçlü bir asidik pH mobil faz ve Asetonitril yeterli bir konsantrasyon algılama için önemlidir. Bu koşul kullanma, nitro temel, dahil olmak üzere diğer bileşikler, nitrotyrosine ayrılabilir. Mevcut durumu 3-NT örneklerinden farklı fiziksel özelliği (Örneğin, partiküler madde ve plazma) tespiti için uygundur.

Değerlendirmek için 3-NT havada, filtre ağırlık ölçümü ve arka ortadan kaldırılması önemli adım vardır. Genel olarak, PM7 yaklaşık 100 mg üzerinde bir 4-7 gün boyunca toplanan vardır; Ancak, çeşitli faktörler önce ve sonra nem ve statik elektrik şarj dahil olmak üzere PM7 koleksiyonu filtre ağırlık etkiler. Bu etkilerinden korunmak için filtre ağırlık sabitleme uzun süre subequal sıcaklık ve nem altında gereklidir. Elektron teraziler yüklendiği konum içinde istikrarlı bir ortam sağlanmalıdır. Numune hazırlama için nonspesifik proteaz kokteyl arka plan etkilerinden ve Ultrafiltrasyon membran kez 3-NT benzer bir zirveye göstermek düzeltmek önemlidir.

Bu yöntem kapalı ortamlarda da dahil olmak üzere diğer parçacıklar uygulanabilir. Proteinlerin nitration onların alerjenik potansiyel2artabilir. Bu nedenle, bu yöntem çevre temizlik değerlendirmek ve nitrosative stres önlemek için yardımcı olabilir.

Bu çalışmada, atmosferik 3-NT hava örnekleyici filtre ele kolay ve ucuz aparatı ile son derece hassas ölçüm yöntemi bildirin. 3-NT atmosferde nesil O3, NO2, PM proteinler ve insan alerjenite etkileyen meteorolojik öğeleri gibi çevresel kirleticiler ile ilişkilidir. Sonuç olarak, mevcut soruşturmada geliştirilen Yöntem atmosferik reaksiyon O3, çeşitli kirleticiler ve PM proteinler çeşitli meteorolojik koşullar altında değerlendirmek için yardımcı olabilir. 3-nitrotyrosine atmosferde bir tahmini için HPLC-ECD geliştirme bu çabaları ile biz daha iyi çevre temizlik, insan sağlığının iyileştirilmesi tahmin.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Masayuki Kubo, ABD Çevre koruma ajansı çay kaşığı/PM2.5 örnekleme ile yardım için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen JSP'ler KAKENHI Grant numarası JP16K15373 ve JP18H03039 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, (1), 15-26 (2012).
  2. Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39, (6), 1673-1678 (2005).
  3. Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14, (1), 155-161 (2016).
  4. D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62, (9), 976-990 (2007).
  5. Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35, (9), 1791-1797 (2001).
  6. Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46, (12), 6672-6680 (2012).
  7. Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141, (3), 265-275 (2006).
  8. Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. Humana Press. 149-158 (2014).
  9. Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
  10. Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89, (3), 529-536 (2004).
  11. Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
  12. Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141, (4), 495-502 (2007).
  13. Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61, (4), 181-189 (2007).
  14. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827, (1), 146-156 (2005).
  15. Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
3-Nitrotyrosine atmosferik ortamlar <em>üzerinden</em> yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör sistemi tespiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).More

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter