التحليل تجميع تاو الموصوفة في هذه المخطوطة يحاكي الميزات المتوقعة في فيفو ميسفولدينج تاو والتجميع.
تجميع البروتين تاو وتشكيل خيوط حلزونية المزدوجة السمة مميزة لمرض الزهايمر وغيرها تاوباثيس. بالمقارنة مع غيرها من البروتينات المرتبطة بأمراض الأعصاب، حركية تجميع المبلغ عنها في المختبر للبروتين تاو أقل اتساقا تقديمه تقلب عالية نسبيا. هنا يصف لنا وضع في المختبر تجميع الإنزيم الذي يحاكي الخطوات المتوقعة المرتبطة مع تاو ميسفولدينج والتجميع في فيفو. ويستخدم المقايسة isoform تاو أطول (huTau441) الذي يحتوي على كلا من الطرفي ن إدراج الحمضية فضلا عن أربعة مجالات ملزمة ميكروتوبولي (مليون برميل يوميا). التجميع في المختبر هو سببها إضافة الهيبارين وتليها الأسفار ثيوفلافين تي في شكل 96 ميكروسكوبية جيدا باستمرار. التحليل تجميع تاو استنساخه عاليا بين آبار مختلفة وتشغيل تجريبي ودفعات من البروتين. التجميع يؤدي إلى تاو مورفولوجيا هوكي الشبيهة التي فعالة جداً في بذر تشكيل هياكل نوفو دي فيبريلار. بالإضافة إلى تطبيقه في دراسة إليه misfolding تاو والتجميع، التحليل الحالي هو أداة قوية لفحص المخدرات التي يمكن أن تتداخل مع إمراضية تاو.
مرض الزهايمر هو اضطراب الأعصاب مدمرة هيستوباثولوجيكالي المعرف بواسطة تراكم لويحات خرف خارج الخلية من مجمعة اميلويد بيتا1 والتشابك نيوروفيبريلاري داخل الخلايا التي تحتوي على تجميع هايبرفوسفوريلاتيد تاو البروتين2. تاو الفسيولوجية أحادي وتقديمها ستة isoforms الفريدة التي تحتوي على 0-2 إدراج الطرفي ن والربط ميكروتوبولي 3 أو 4 المجالات3،4 الناجمة عن الربط بديلة ومتوسط فوسفوريليشنز 2-3. ويعتقد أن هايبرفوسفوريليشن وميسفولدينج والتجميع الذاتي في الهياكل فيبريلاري تشكل العناصر الرئيسية في تاو المرضية، مرضية المقررة في الأفراد الجنونية5،6.
التشابك تاو neurofibrillary المجمعة السمة مميزة للإعلان ليس فقط بل أيضا لسائر تاوباثيس، بما في ذلك انحطاط فصي فرونتوتيمبورال (فتلد) لاختيار المرض والشلل التدريجي supranuclear (PSP)، الخرف فرونتو الزمانية (FTD) والابتدائية تاوباثي المتعلقة بالعمر (الجزء)2. من وجهة نظر الكيمياء الحيوية، فهم إليه misfolding تاو والتجميع يمكن إلقاء الضوء على العمليات المرضية المرتبطة بالإعلانات وأخرى تاوباثيس. بالإضافة إلى الجانب العلمي، قوية في المختبر فحوصات تجميع أدوات قيمة لفحص المخدرات المرشحين7،،من89،10. ويعتقد أن تراكم تاو يتبع التنو بلمرة تعتمد عملية (الحزب الوطني)11،12،،من1314. حركية الحزب الوطني سيجمويدال ويبدأ بخطوة التنو نشاط غير مواتية تليها عملية انحدار سريع نشاط تجميع.
خلافا لغيرها من البروتينات أميلويدوجينيك، بما في ذلك بروتين بريون، وبيتا اميلويد و α-سينوكلين، وتاو لا تجميع عفويا في ظل الظروف الفسيولوجية وتتمثل حتى المتطرفة أو درجات حرارة عالية غير مواتية لتجميع15. وهذا على الأرجح بسبب التفاعلات هيدروفيليك موجودة في واجهة تجميع تاو. ومع ذلك، تاو المجاميع كفاءة عند التركيزات الفسيولوجية عندما تستخدم الحمام مثل الهيبارين16 أو17،بوليانيونس أخرى18 .
الجهود السابقة لإعداد في المختبر فحوصات التجميع تاو قد يلقي بعض الضوء على تفاصيل misfolding تاو والتجميع، ولكن جاءت قصيرة لمحاكاة ما يعتقد أن حركية التجميع تاو في فيفو . في معظم الحالات، كانت تفتقر إلى حركية التجميع تاو في المرحلة الأولى تأخر المرتبطة مع نويات تاو. وهذا قد يكون نتيجة لاستخدام تركيزات البروتين تاو عالية جداً، وجود المجاميع في البروتين تاو انطلاق الأعمال التحضيرية و/أو استخدام أجزاء تاو مع كثير الميل تجميع أعلى مما تاو كامل طول الفسيولوجية أكثر بروتين19،،من2021،،من2223. وعلاوة على ذلك، لم تتناول الدراسات السابقة بإمكانية تكرار نتائج وجوانب قوة تاو التجميع حركية.
وهنا يصف لنا قوية في المختبر تاو تجميع الإنزيم الذي يحاكي الخصائص الرئيسية البلمرة تعتمد التنو مع مرحلة متخلفة أولية المقابلة إلى نويات تاو تليها مرحلة نمو المتسارع. وعلاوة على ذلك، المجاميع تاو المؤتلف الذي تم إنشاؤه فيبريلار في الطبيعة ولها فاعلية بذر مرتفعة للغاية. المقايسة استنساخه بشدة أيضا بين دفعات تاو ويمثل أداة قيمة الشاشة لمثبطات التجميع.
وعلى الرغم من الجهود العديدة، أفادت حركية التجميع تاو في الأدب التاريخ الافتقار إلى المستوى المطلوب في إمكانية تكرار نتائج و/أو بعض الميزات من نويات البلمرة تعتمد19،،من2021 , 22 , 23 , 25-وهذا كثيرا ما شددت على عدم وجود مرحلة انتقالية وبذر عدم كفاءة والطبيعة غير فيبريلار تاو المجاميع. وسبب هذه العيوب يمكن أن تختلف، ويشمل تاو دون المستوى الأمثل نوعية البروتين (التجزؤ، وجود المجاميع، ونقاء منخفضة، إلخ.)، اختيار البروتين وحمل الكواشف واو الظروف التجريبية. عامل تعقيد آخر بقايا سيستين اثنين تقع حول واجهة تجميع تاو التي يمكن أن تشكل داخل أو جملة-ثنائي كبريتيد الجزيئية الجسور تبعاً للبيئة الأكسدة ويؤثر على كفاءة التجميع تاو. في معظم نهج الحد من الكواشف مثل DTT أو تسيب استخدمت للحفاظ على بقايا سيستين في أشكال أقل وبالتالي زيادة مستويات من إمكانية تكرار نتائج25. وعلاوة على ذلك، معامل الانقراض تاو منخفضة جداً مما يؤدي إلى صعوبات في قياسات دقيقة لتركيز البروتين.
نحن تركز خصوصا على عدد قليل من المعلمات والسمات النوعية التي نحن تعتبر حاسمة بالنسبة لملف تجميع قوية واستنساخه والممثل للبروتين تاو: القضاء على إمكانية داخلها-وجملة-تشكيل ثنائي كبريتيد الجزيئية، توليد من مونومر تاو نقية جداً وتحسين دقة تحديد تركيز. كل كاشف هذه المتصلة بمسائل هي نقاط الاهتمام المحتملة التي نحن تعتبر حاسمة بالنسبة للتنمية المثلى بالانزيم. وأعرب huTau441 طول كامل لمعالجة هذه القضايا، مع الطفرات اثنين، C291A، و C322A، والعلامات الطرفي ن وج. طفرة مخلفات سيستين له الحد الأدنى من التأثير على البروتين تاو حين القضاء على خلاف ذلك الصعوبة بمكان السيطرة على سد ثنائي كبريتيد. التعبير عن البروتين مع العلامات الطرفي ن وج قصيرة نسبيا سمح لنا بمتابعة بروتوكول تنقية تقارب خطوتين مما أدى إلى درجة نقاء عالية جداً، والسلامة ومركب المحتوى. وعلاوة على ذلك، قدمنا طفرة F8W زاد معامل الانقراض من البروتين، ويسمح بتركيز أكثر دقة القياسات24.
بالإضافة إلى استخدام كواشف جودة عالية البروتين، كانت أيضا الأمثل المعلمات مقايسة الأخرى. تاو الأمثل: تم تحديد نسبة الهيبارين حوالي 0.5 (M/M) وما يتماشى مع الدراسات المنشورة سابقا26. وعلاوة على ذلك، الإعدادات الآلي الميكانيكية والبصرية حاسمة لضمان إمكانية تكرار نتائج والمعلمات الأمثل قد تختلف إلى حد ما حسب الشركة المصنعة.
تجميع تاو الموصوفة في هذا التحليل يبين الخصائص التي ترتبط مع تاو المرضية في الإعلان والمتعلقة تاوباثيس. العملية تبدأ بمرحلة تأخر أولية المقابلة لتشكيل نواة ذات الطاقة العالية وتبعتها مرحلة نمو سريع الذي يتوافق مع النمو فيبريل. وقت تأخير طويلة بما يكفي لفتح نافذة واسعة للدراسة بالتفصيل عملية البذر تغطي طائفة واسعة من البذور تركيزات (الشكل 5) في حين لا يزال ليس وقتاً طويلاً حتى يتم تفادي تدهور البروتين و/أو التجميع غير محددة (الشكل 2). يمكن أن يحدث هذه الأحداث الثانوية وبخاصة عندما يتعرض بروتين اضطرابه ارتباطاً وثيقا مثل huTau441 لفترات طويلة من الوقت للظروف الفسيولوجية. عرض المجاميع تاو حصل على مورفولوجية ففس معزولة عن أدمغة المرضى الإعلانية، وهي فعالة جداً في توظيف تاو أحادي وتحويله إلى حيثياته إنشاء المجاميع، هي عملية يشار إليها كالبذر. المقايسة يتم استنساخه بدرجة عالية، المنحنيات الحركية التي لا يمكن تمييزها تقريبا بين الآبار وتشغيل تجريبي ودفعات البروتين. على الرغم من أن الفحص الحالي يركز فقط على isoform تاو أطول، huTau441، التطبيق يمكن تكييفها لدراسة تحويل أشكال أخرى من تاو (أمييجدي et al., Acta نيوروباثولوجيكا الاتصالات، في الصحافة) علاوة على ذلك، فإنه تمكن الدراسات الميكانيكية تركز على التفاعل بين إيسوفورمس تاو وربما يلقي الضوء على الاختلافات بين تاو المرضية في الإعلان حيث isoforms 3R و 4R موجودة في ففس وانتقاء للمرض أو العته فرونتوتيمبورال حيث يحتوي على أمراض تاو أساسا 3R و 4R تاو isoforms، على التوالي27.
إمكانية تكرار نتائج عالية جداً للمقايسة ينبغي السماح للقراء بتنفيذ ذلك بسهولة نسبية في إعداداتها معمل محددة. المقايسة يحاكي ما يعتقد أن في فيفو ميسفولدينج وتجميع تاو، تمكين الدراسات الميكانيكية التي سوف تسلط الضوء على تاو المرضية وأنه يشكل أداة قيمة لفرز المرشحين المخدرات وتقييم تدخلها مع الخطوات المختلفة لعملية المرضية.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب يود أن يشكر “هيكتور كويرانتي” للتعبير وتنقية huTau441، Inganäs حنا ومارغو van فينسن للدعم الفني الممتاز ومارتن كولديجك لتحليل البيانات.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |