De tau aggregatie assay beschreven in dit manuscript bootst de verwachte kenmerken van in vivo misfolding tau en aggregatie.
Aggregatie van eiwitten tau en vorming van gepaarde spiraalvormige filamenten is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer en andere tauopathies. Vergeleken bij andere proteïnen die zijn gekoppeld aan neurodegeneratieve ziekten, de kinetiek van aggregatie gemeld in vitro voor tau-eiwit zijn minder consequent presenteert een relatief hoge variabiliteit. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een in vitro aggregatie bepaling die de verwachte stappen tau misfolding en aggregatie in vivois gekoppeld bootst. De bepaling maakt gebruik van de langste tau isovorm (huTau441) waarin zowel N-terminale zure inserts, alsmede vier microtubuli-bindende domeinen (MBD). De aggregatie van in vitro is geactiveerd door toevoeging van heparine en voortdurend gevolgd door thioflavin T fluorescentie in een 96 goed microplate-indeling. De tau aggregatie bepaling is zeer reproduceerbaar tussen verschillende wells, experimentele loopt en batches van het eiwit. De samenvoeging leidt tot tau PHF-achtige morfologie die zeer efficiënt is in het zaaien van de vorming van DOVO fibrillar structuren. Naast de toepassing in het bestuderen van het mechanisme van tau misfolding en aggregatie, is de huidige bepaling een krachtige tool voor het screenen van geneesmiddelen die met de pathogenese van tau interfereren kunnen.
De ziekte van Alzheimer is een verwoestende neurodegeneratieve stoornis die histopathologically door de accumulatie van extracellulaire seniele plaques van geaggregeerde Amyloid-bèta1 is gedefinieerd en intracellulaire neurofibrillary klitten met geaggregeerde hyperphosphorylated tau-eiwit2. Fysiologische tau is monomeer en gepresenteerd als zes unieke isoforms met 0-2 N terminal inzetstukken en 3 of 4 microtubuli-bindende domeinen3,4 die voortvloeien uit alternatieve splicing en een gemiddelde van 2-3 phosphorylations. Men gelooft dat hyperphosphorylation, misfolding en zelf aggregatie in fibrillary structuren de sleutelelementen van tau pathogenese, als pathologisch beoordeeld in demente personen5,6 vormen.
De geaggregeerde neurofibrillary tau klitten zijn een kenmerk niet alleen voor AD, maar ook voor andere tauopathies, met inbegrip van Frontotemporale lobar degeneratie (FTLD), Pick’s ziekte, Progressieve supranucleaire verlamming (PSP), fronto-temporele dementie (FTD) en primaire leeftijdsgebonden tauopathy (deel)2. Vanuit een biochemisch oogpunt, inzicht in het mechanisme van tau misfolding en aggregatie kan licht werpen op de pathologische processen gekoppeld aan AD en andere tauopathies. Naast het wetenschappelijke aspect zijn robuuste in vitro aggregatie testen waardevolle hulpmiddelen voor screening van drug kandidaten7,8,9,10. Het is van mening dat de samenvoeging van tau een nucleatie afhankelijke polymerisatie proces (NDP)11,12,13,14 volgt. De NDP-kinetiek is sigmoïdale en begint met een energiek ongunstige nucleatie stap gevolgd door een snel energiek downhill aggregatie-proces.
In tegenstelling tot andere amyloidogenic eiwitten, met inbegrip van het prion-eiwit en bèta amyloid α-synuclein, tau doet niet spontaan statistische onder fysiologische omstandigheden en zelfs extreme pHs of hoge temperaturen niet-bevorderlijk voor aggregatie15zijn. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de hydrophylic interacties in de tau aggregatie interface aanwezig. Echter, tau aggregaten efficiënt bij fysiologische concentraties wanneer inductoren zoals heparine16 of andere polyanions17,18 worden gebruikt.
Eerdere pogingen om in te stellen in vitro tau aggregatie testen hebben werpen enig licht op de details van tau misfolding en aggregatie, maar ze kwamen kort voor het nabootsen van wat wordt verondersteld te zijn van de in-vivo -kinetiek van het tau-aggregatie. In de meeste gevallen ontbrak de tau aggregatie kinetiek de fase van de eerste vertraging tau nucleatie is gekoppeld. Dit zou kunnen zijn het gevolg van het gebruik van zeer hoge tau-eiwit concentraties, aanwezigheid van aggregaten in de startende tau-eiwit preparaten en/of gebruik van tau fragmenten met veel hogere aggregatie neiging dan het meer fysiologische volledige lengte tau eiwit19,20,21,22,23. Bovendien, eerdere studies niet ingegaan op de reproduceerbaarheid en robuustheid aspect van tau aggregatie kinetiek.
Hier beschrijven we een robuuste in vitro tau aggregatie assay die bootst de belangrijkste kenmerken van een afhankelijke polymerisatie van nucleatie met een fase van de eerste vertraging overeenkomt met de tau nucleatie gevolgd door de fase van een exponentiële groei. Bovendien, de gegenereerde recombinante tau aggregaten zijn fibrillar in de natuur en hebben een extreem hoge seeding potentie. De bepaling is zeer reproduceerbaar ook tussen tau batches en vertegenwoordigt een waardevol instrument te screenen op aggregatie remmers.
Ondanks talrijke pogingen, de tau aggregatie kinetiek gemeld in de literatuur naar datum ontbreken het gewenste niveau van reproduceerbaarheid en/of sommige van de kenmerken van een nucleatie afhankelijke polymerisatie19,20,21 , 22 , 23 , 25. dit wordt vaak benadrukt door het ontbreken van een lag fase, de inefficiënte zaaien en de niet-fibrillar aard van tau aggregaten. De reden voor deze tekortkomingen kan variëren en omvat suboptimale tau-eiwit kwaliteit (versnippering, aanwezigheid van aggregaten, lage zuiverheid, enz.), keuze van eiwitten en inducerende reagentia en/of experimentele omstandigheden. Een andere complicerende factor zijn de twee cysteïne residuen gelegen rond de tau aggregatie interface die kunnen vormen intra – of inter – moleculaire disulfide bruggen afhankelijk van de redox milieu en de invloed op de efficiëntie van tau aggregatie. In de meeste benaderingen vermindering van reagentia zoals DTT of TCEP zijn gebruikt om de cysteïne-residuen in verminderde vormen en dus verhoging van de niveaus van reproduceerbaarheid25. Bovendien, de coëfficiënt uitsterven van tau is zeer laag die leidt tot problemen in nauwkeurige metingen van de eiwitconcentratie.
We gericht vooral op een paar parameters en kenmerken van de kwaliteit die we beschouwd als cruciaal voor een representatieve, robuuste en reproduceerbare aggregatie-profiel voor tau-eiwit: opheffing van de mogelijkheid van intra – en inter-moleculaire bisulfide vorming, het genereren van een monomeer zeer zuivere tau en verbeteren van de nauwkeurigheid van de bepaling van de concentratie. Alle deze reagens gerelateerde vragen zijn potentiële aandachtspunten die wij als cruciaal voor een optimale assay ontwikkeling beschouwd. Om deze kwesties te behandelen, werd de volledige lengte huTau441 uitgedrukt met twee mutaties, C291A en C322A, en met N – en C-terminaal tags. Mutatie van de residuen van cysteïne heeft minimale impact op het eiwit tau terwijl het elimineren van de anders heel moeilijk te controleren bisulfide overbruggen. Uiting van het eiwit met relatief korte N – en C-terminaal tags toegestaan ons voort te zetten van een tweestaps affiniteit zuivering protocol, wat tot zeer hoge zuiverheid, integriteit en monomeer inhoud leidde. Bovendien, introduceerden we een F8W mutatie die steeg de coëfficiënt uitsterven van het eiwit en veel nauwkeuriger concentratie metingen24toegestaan.
Naast het gebruik van hoogwaardige eiwitten reagentia, werden ook andere parameters assay geoptimaliseerd. De optimale tau: heparine verhouding te rond 0,5 (M/M), die in overeenstemming met eerder gepubliceerde studies26 iswerd geïdentificeerd. Bovendien, mechanische en optische instrumentele instellingen zijn cruciaal om de reproduceerbaarheid en de optimale parameters kunnen verschillen tot op zekere hoogte afhankelijk van de fabrikant.
De aggregatie van tau beschreven in deze test toont kenmerken die zijn gekoppeld aan tau pathogenese in AD en gerelateerde tauopathies. Het proces begint met een fase van de eerste vertraging overeenkomt met de vorming van energierijke kernen en wordt gevolgd door een fase van snelle groei die overeenkomt met fibril groei. De vertragingstijd is lang genoeg om een breed venster om te studeren in detail de seeding proces die een breed scala van zaad concentraties (Figuur 5) terwijl nog steeds niet te lang dus afbraak van eiwitten en/of aspecifieke aggregatie worden vermeden (figuur te openen 2). deze secundaire gebeurtenissen kunnen met name gebeuren wanneer een intrinsiek ongeordende eiwitten zoals huTau441 wordt blootgesteld voor langere tijd aan fysiologische omstandigheden. Het verkregen tau aggregaten display de morfologie van PHFs geïsoleerd van hersenen van AD patiënten en zijn zeer efficiënt in het monomeer tau te werven en te converteren naar DOVO gegenereerd aggregaten, een proces genoemd zaaien. De bepaling is zeer reproduceerbaar is, met de kinetische bochten wordt vrijwel niet te onderscheiden tussen putten, experimentele loopt en eiwit batches. Hoewel de huidige bepaling richt zich alleen op de langste tau isovorm, huTau441, de toepassing kan worden aangepast aan het bestuderen van de conversie van andere vormen van tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica communicatie, pers), het maakt bovendien mechanistisch onderzoek gericht op het samenspel van tau isoforms en eventueel licht werpen op de verschillen tussen tau pathogenese in AD waar zowel 3R en 4R isoforms aanwezig zijn in PHFs en PICK’s ziekte of Frontotemporale dementie waar tau pathologie bevat voornamelijk 3R en 4R tau isoforms, respectievelijk27.
De zeer hoge reproduceerbaarheid van de test mag lezers uit te voeren met relatief gemak in hun specifieke lab-instellingen. De assay bootst wat wordt verondersteld te zijn de in vivo misfolding en aggregatie van tau, inschakelen van mechanistische studies die licht op de pathogenese van tau en het werpen zal vormt een waardevol instrument voor het screenen van drugkandidaten en evalueren van hun inmenging met de verschillende stappen van het proces van de pathogenese.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Hector Quirante voor de expressie en de zuivering van huTau441, Hanna Inganäs en Margot van Winsen voor uitstekende technische ondersteuning en Martin Koldijk voor data-analyse.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |