El análisis de la agregación de tau se describe en este manuscrito imita las características anticipadas en vivo tau mal plegamiento y agregación.
Agregación de la proteína tau y la formación de filamentos helicoidales apareados es un sello de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías. En comparación con otras proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas, la cinética de agregación divulgado en vitro de la proteína tau son menos consistentes que presenta una variabilidad relativamente alta. Aquí describimos el desarrollo de un ensayo en vitro la agregación que imita los pasos esperados asociados con mal plegamiento y agregación de tau en vivo. El ensayo utiliza la isoforma tau más largo (huTau441) que contiene insertos acídicos N-terminal, así como cuatro dominios de unión a microtúbulos (MBD). La agregación en vitro es desencadenada por la adición de heparina y seguida continuamente por fluorescencia de tioflavina T en un formato de 96 microplaca de bien. El ensayo de agregación de tau es altamente reproducible entre diferentes pozos, funcionamientos experimentales y lotes de la proteína. La agregación conduce a tau PHF-como morfología, que es muy eficiente en el sembrador de la formación de estructuras fibrilares de novo . Además de su aplicación en el estudio del mecanismo de tau mal plegamiento y agregación, el ensayo actual es una robusta herramienta para la detección de drogas que puedan interferir en la patogenia de la tau.
La enfermedad de Alzheimer es un desorden neurodegenerative devastador que histopatológicamente se define por la acumulación de placas seniles extracelulares de agregados amiloides beta1 y Neurofibrilar intracelular que contiene agregado la proteína del tau de Hyperphosphorylated2. Tau fisiológica es monomérica y presentados como seis isoformas únicas que contiene 0-2 inserciones terminales N y 3 o 4 enlace de microtúbulos dominios3,4 derivadas de splicing alternativo y un promedio de 2-3 fosforilaciones. Se cree que la hiperfosforilación, mal plegamiento y uno mismo-agregación de en las estructuras fibrilares constituyen los elementos clave en la patogenia de tau, como patológico evaluado en individuos con demencia5,6.
Los enredos de agregados de tau neurofibrilares son un rasgo distintivo no sólo para el anuncio, sino también para otras tauopatías, incluyendo la degeneración lobular frontotemporal (DLFT), enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva (PSP), la demencia fronto-temporal (FTD) y primaria relacionadas con la edad tauopathy (parte)2. Desde un punto de vista bioquímico, comprender el mecanismo de tau mal plegamiento y agregación podría arrojar luz sobre los procesos patológicos asociados con enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías. Además del aspecto científico, robusto en vitro ensayos de agregación son herramientas valiosas para la detección de drogas los candidatos7,8,9,10. Se cree que la agregación de tau sigue una nucleación dependiente polimerización proceso (NDP)11,12,13,14. La cinética de la NDP es sigmoidal y comienza con un paso de nucleación enérgio desfavorable seguido por un proceso de agregación enérgio rápido cuesta abajo.
A diferencia de otras proteínas amyloidogenic, incluyendo la proteína del prión, beta amiloideo y α-sinucleína, tau no agregan espontáneamente bajo condiciones fisiológicas y pHs incluso extremo o las altas temperaturas son no-conducentes para agregación15. Esto es probablemente debido a las interacciones de hidrofílico presentes en la interfaz de la agregación de tau. Sin embargo, tau agregados eficientemente en concentraciones fisiológicas cuando se utilizan inductores tales como heparina16 u otros polianiones17,18 .
Los esfuerzos anteriores para configurar en vitro ensayos de agregación de tau han arrojado algo de luz sobre los detalles de tau mal plegamiento y agregación, pero vinieron de imitar lo que se cree que la cinética de agregación en vivo tau. En la mayoría de los casos, la cinética de la agregación de tau faltaba la fase de retraso inicial asociada con la nucleación de tau. Esto pudo haber sido la consecuencia del uso de las concentraciones de proteína tau muy alta, presencia de agregados en la preparación de la proteína tau a partir o uso de fragmentos de tau con mucho mayor propensión de la agregación de tau largo más fisiológica la proteína19,20,21,22,23. Además, estudios previos no abordó el aspecto de robustez de la cinética de la agregación de tau y reproducibilidad.
Aquí, describimos un robusto en vitro tau agregación ensayo que imita las características principales de una polimerización de nucleación dependiente con una fase de retraso inicial correspondiente a la nucleación de tau seguida por una fase de crecimiento exponencial. Además, los agregados de tau recombinantes generados son fibrilares en la naturaleza y tienen una potencia extremadamente alta de siembra. El ensayo es altamente reproducible también entre lotes de tau y representa una herramienta valiosa para detectar inhibidores de la agregación.
A pesar de numerosos esfuerzos, la cinética de la agregación de tau divulgado en la literatura a la falta de la fecha el nivel deseado de reproducibilidad o algunas de las características de una nucleación dependiente polimerización19,20,21 , 22 , 23 , 25. esto a menudo se acentúa por la falta de una fase lag, sembrando ineficiente y naturaleza no fibrilar de agregados de tau. La razón de estas deficiencias puede variar e incluye calidad de proteína tau óptimo (fragmentación, presencia de agregados de baja pureza, etcetera.), elección de la proteína y la inducción de reactivos y condiciones experimentales. Otro factor que complica son los dos residuos de cisteína situados alrededor de la interfaz de la agregación de tau pueden intra – o inter – puentes disulfuro molecular dependiendo del ambiente redox y afectan la eficiencia de la agregación de tau. En los enfoques más reducción de reactivos tales como TDT o TCEP se han utilizado para mantener los residuos de cisteína en formas reducidas y así aumentar los niveles de reproducibilidad25. Además, el coeficiente de extinción de tau es muy baja que conduce a dificultades para mediciones precisas de la concentración de proteína.
Nos centramos especialmente en unos parámetros y atributos de calidad que consideramos cruciales para un perfil de agregación sólido, reproducible y representativa para la proteína tau: elimina la posibilidad de intra – y inter-formación del disulfuro molecular, generación de un monómero tau altamente puro y mejorar la exactitud de la determinación de la concentración. Todos estos reactivos relacionados con preguntas son posibles puntos de atención que consideramos esenciales para el desarrollo óptimo del ensayo. Para abordar estas cuestiones, longitud total huTau441 se expresó con dos mutaciones, C291A y C322A y con las etiquetas N y C terminal. Mutación de los residuos de cisteína tiene un impacto mínimo en la proteína tau, eliminando el muy difíciles controlar el puente disulfuro. Expresando la proteína con las etiquetas relativamente corto N – y c-terminal nos permitió seguir un protocolo de purificación de afinidad de dos etapas que condujeron a la muy alta pureza, la integridad y el contenido de monómero. Además, hemos introducido una mutación F8W que aumentó el coeficiente de extinción de la proteína y permite mucho más precisa de las mediciones de concentración24.
Además de utilizar reactivos de proteína de alta calidad, también fueron optimizados otros parámetros de análisis. El tau óptima: cociente de la heparina fue identificada para ser alrededor de 0,5 (M/M) que está en consonancia con los estudios previamente publicados26. Además, configuración instrumental mecánico y óptico es cruciales para garantizar la reproducibilidad y los parámetros óptimos pueden diferir en cierta medida dependiendo del fabricante.
La agregación de tau que se describe en este ensayo muestra características que se asociado con la patogénesis de la tau en AD y relacionadas con tauopatías. El proceso comienza con una fase de retraso inicial correspondiente a la formación de núcleos de alta energía y es seguido por una fase de rápido crecimiento que corresponde al crecimiento de la fibrilla. El tiempo es suficientemente largo para abrir una ventana amplia para estudiar en detalle el proceso de transferencia que abarcan una amplia gama de concentraciones de semillas (figura 5) mientras que todavía no demasiado largo por lo que se evita la degradación de las proteínas o agregación inespecífica (figura 2). estos eventos secundarios podrían suceder especialmente cuando una proteína intrínsecamente desordenada como huTau441 se expone durante largos períodos de tiempo en condiciones fisiológicas. La pantalla de agregados de tau obtenidos la morfología de los PHFs aislado de cerebros de pacientes con EA y son muy eficaces en el reclutamiento tau monomérica y conversión a de novo genera agregados, un proceso que se denomina siembra. El ensayo es altamente reproducible, las curvas cinéticas siendo prácticamente indistinguible entre pozos, funcionamientos experimentales y lotes de proteínas. Aunque el ensayo actual se centra sólo en la más larga isoforma tau, huTau441, la aplicación puede ser adaptada para el estudio de la conversión de otras formas de tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica comunicaciones, en prensa) además, permite estudios mecanísticos se centró en la interacción de los isoforms del tau y posiblemente arrojan luz sobre las diferencias entre la patogénesis de la tau en AD donde 3R y 4R isoformas están presentes en PHFs y de PICK enfermedad o Demencia Frontotemporal donde la patología tau contiene principalmente 3R y 4R isoforms del tau, respectivamente27.
La muy alta reproducibilidad de la prueba debe permitir que los lectores a aplicar con relativa facilidad en sus entornos de laboratorio específicas. El ensayo imita lo que se cree para ser en vivo mal plegamiento y agregación de tau, permitiendo estudios mecanísticos que arrojan luz sobre la patogénesis de tau y constituye una herramienta valiosa para la detección de fármacos candidatos y evaluar su interferencia con los diferentes pasos del proceso de patogénesis.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Hector Quirante para la expresión y purificación de huTau441, Hanna Inganäs y Margot van Winsen excelente soporte técnico y Martin Koldijk para análisis de datos.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |