Vi presenterar användning av protokollet MeshAndCollect att erhålla en komplett diffraktion datamängd, för användning i efterföljande strukturbestämning, sammansatt av partiell diffraktion uppsättningar data som samlats in från många små kristaller av fluorescerande protein Cerulean.
Röntgenkristallografi är den stora teknik som används för att få hög upplösning upplysningar om de 3-dimensionella strukturerna av biologiska makromolekyler. Tills nyligen, har en större kravet varit tillgången på relativt stora, väl diffracting kristaller, som ofta är utmanande att få. Men har tillkomsten av seriell kristallografi och en renässans i flera kristall datainsamlingsmetoder inneburit att tillgängligheten av stora kristaller inte längre behöver vara en begränsande faktor. Här, illustrera vi användningen av de automatiserade MeshAndCollect-protokollet, som först identifierar många små kristaller som monteras på samma provhållaren ståndpunkter och sedan leder samlingen från kristaller i en serie av partiell diffraktion datauppsättningar för efterföljande sammanslagning och användning i strukturbestämning. MeshAndCollect kan tillämpas på någon typ av mikro-kristaller, även om svagt diffracting. Som ett exempel presenterar vi här användningen av teknik för att lösa kristallstrukturen i den Cyan fluorescerande Protein (GFP) Cerulean.
Makromolekylär röntgenkristallografi (MX) är den överlägset den mest använda metoden för att få atomär upplösning insikt i den tredimensionella strukturen av biologiska makromolekyler. En större flaskhalsar är dock kravet på relativt stora, väl diffracting kristaller.
Ofta, och särskilt när utkristalliseras membranproteiner, bara mycket små kristaller på några mikrometer i den största dimensionen kan erhållas. Strålskador effekter gräns resolutionen av en komplett diffraktion data som kan samlas in från en enda micro crystal2, och mycket ofta, är det nödvändigt att förbättra signal-brusförhållande och därmed data ange upplösning, genom en sammanslagning av flera partiell diffraktion datauppsättningar från olika, men isomorfa kristaller. Ökningarna i flödestäthet av röntgen strålar på synkrotron källor och annorstädes (t.ex. röntgen gratis-elektron lasrar (X-FELs)), har inneburit att användbar partiell diffraktion datauppsättningar kan hämtas från även mycket små kristaller av biologiska makromolekyler. Detta, i sin tur har lett till utvecklingen av ny teknik för insamling och sammanslagning av partiell diffraktion datauppsättningar samlas in från många olika kristaller för att framställa en komplett datauppsättning för struktur lösning. Sådana tekniker är vanligen kallad seriell kristallografi (SX)3,4,5,6,7,8. En prototypiska exempel på SX är användning av injektor enheter att införa en smal ström av en kristall slurry i X-ray balk3,4,5. En diffraktionsmönster registreras varje gång en kristall utsätts för röntgen leder till samlingen, från många tusentals enskilda kristaller, ” diffraktion stillbilder, information som är sedan samman för att producera en fullständig uppsättning data. En betydande nackdel med denna typ av insamling av seriell data är dock att behandlingen av stillbilder kan vara problematiskt. Kvaliteten på uppgifterna är betydligt bättre om kristaller kan roteras eller flera diffraktion bilder samlas in från samma kristallen under seriell kristallografi experiment6.
MeshAndCollect1 utvecklades i syfte att kombinera SX med ‘standard’ MX rotation datainsamling och tillåter, i ett automatiskt sätt, praktiker att samla partiell diffraktion datamängder från många kristaller av samma makromolekylära mål monterade på samma eller olika prov innehavare. En komplett diffraktion datauppsättning erhålls sedan genom en sammanslagning av den mest isomorft av de partiella data samlas in. MeshAndCollect är kompatibel med alla state-of-the-art synkrotron röntgen beamline för MX (helst en infogning enhet anläggning med en relativt liten (20 µm eller mindre) balk storlek vid provposition). Förutom att sammanställningen av komplett datamängder från en serie av små, väl diffracting kristaller är metoden också mycket lämplig för den första experimentella bedömningen av diffraktion kvaliteten på mikro-kristaller och för behandling av ogenomskinlig prover, t.ex. i meso vuxit microcrystals av membranet proteiner9.
I början av ett MeshAndCollect experiment fastställs positionerna, i två dimensioner, för var och en av många kristallen som ingår i en enda provhållare med en låg dos röntgen scan. Diffraktion bilder som samlats in under genomsökningen analyseras automatiskt av programmet DOZOR1, vilket sorterar placerar av kristallerna på provhållaren enligt deras respektive diffraktion styrka. Positioner för insamling av partiell datauppsättningar tilldelas automatiskt baserat på en diffraktion styrka cut-off och, i det sista steget, små kilar av diffraktion data, typiskt ±5 ° rotation, samlas in från varje vald position. Erfarenheten har visat att denna rotation urval ger en tillräcklig mängd reflektioner per crystal för ofullständig uppsättning uppgifter skalning ändamål, medan på samma gång, minska möjligt crystal centrering frågor och chansen att exponera flera kristaller i en särskilt trångt stöd1. Enskilda diffraktion data kilar (partiell datauppsättningar) är sedan bearbetas antingen manuellt eller med hjälp av automatisk databehandling rörledningar10,11,12,13. För strukturbestämning av nedströms är det då nödvändigt att hitta den bästa kombinationen av partiell datauppsättningar vara sammanslagna14,15,16 varefter den resulterande komplett datauppsättningen kan behandlas på samma sätt som en med ursprung från en enda kristall experimentera.
Som ett exempel på MeshAndCollect i praktiken presenterar vi här lösningen av kristallstrukturen i den Cyan fluorescerande Protein (GFP) Cerulean, använder en diffraktion datauppsättning tillverkade av kombinationen av partiell uppsättningar data som samlats in från en rad microcrystals monterad på samma prov stöd. Cerulean har utvecklats från det grönt fluorescerande Protein (GFP) från maneter Aequorea victoria17, vars fluorescerande Kromoforen bildas autocatalytically från cyklisering av tre på varandra följande aminosyra rester. Cerulean erhålls från GFP genom muterar de första och andra resterna av Kromoforen, en serin och en tyrosin, treonin (S65T) och tryptofan (Y66W) respektive och anpassa kromofor miljön med ytterligare mutationer (Y145A, N146I, H148D, M153T och V163A) att producera en betydande, men ändå suboptimala fluorescens nivå av QY = 0.4918,19,20. Suboptimal fluorescerande egenskaperna för Cerulean har föreslagits att kopplas till komplexa protein dynamics som involverar ofullkomlig stabiliseringen av en av de elva β-delarna av protein21 och inkvartering av två olika kromofor isomerer beroende på pH och bestrålning villkor22. Vi valde att arbeta med Cerulean som en modell protein som illustrerar användningen av protokollet MeshAndCollect tack vare den relativt enkel trimning crystal storlek beroende på kristallisation. Strukturen i Cerulean påminner mycket om att dess överordnade protein GFP, som det utgörs av en β-fat bildat av elva β-trådar kring en α-helix, som bär Kromoforen.
Framgången för ett MX experiment beror oftast på förekomsten av relativt stora, väl diffracting kristaller. För projekt där optimering från liten kristall duschar till större kristaller misslyckas, ger MeshAndCollect en möjlighet att få en komplett diffraktion datamängd för struktur lösning via kombinationen av isomorft datauppsättningar med delvis insamlade från en serie av små kristaller. Metoden är kompatibel med synkrotron linjer för MX, helst med en hög photon flux och en liten stråle diameter, utrustad med en toppmodern diffractometer enhet och en snabb-avläsning detektor. På sådan en slutstation tar den data collection del av sådant experiment cirka 20 minuter, beroende på antalet partiella data set som ska samlas in och antalet crystal-innehållande prov innehavare ska analyseras.
Den viktigaste förutsättningen för att lyckas med ett MeshAndCollect experiment är förekomsten av tillräckligt många (minst 50, 100 idealiskt) av diffracting positioner på provhållaren. Från erfarenhet, bör kristaller analyseras vara minst cirka 5 µm i den minsta dimensionen. Metoden är kompatibel med någon slags standard cryo-kylning kompatibel prova innehavare med bästa resultat uppnås med hjälp av mesh fästen som är stel och rak.
Vid ESRF implementeras MeshAndCollect på ett användarvänligt sätt i ett arbetsflöde Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 tillgängliga från MXCuBE2 beamline kontroll mjukvaran. En stor fördel med MeshAndCollect jämfört med andra SX-metoder är att insamlade data kan bearbetas av vanliga program och automatiserade rörledningar som används för enda kristall MX.
Vårt exempel visar MeshAndCollect är mycket lätt att applicera och leder till en rad delvis diffraktion datauppsättningar, vanligtvis samlas in från små kristaller, som kan slås samman för att producera en fullständig uppsättning data för användning i struktur lösning. MeshAndCollect har dessutom potential att öppna upp provtagning utrymme av röntgenkristallografi eftersom det ger ett sätt att samla användbara data från kristallisering prövningar där det sista steget-optimering produktionen av stora kristaller, är misslyckat.
Mot bakgrund av den aktuella utvecklingen mot ljusare röntgenkällor (t.ex. extremt lysande källa (EBS) projektet/ESRF35) är det kan förutses att på grund av ökad strålning skada, typ av flera kristall datainsamling underlättas genom MeshAndCollect blir standardmetoden för datainsamling, snarare än ett undantag – som för närvarande är fallet – på synkrotron-baserade MX linjer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar ESRF för att tillhandahålla beam tid genom dess egna forskningsprogram.
Beamline | ESRF ID 23-1 | ||
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Crystallization plates XDXm with sealant | Hampton Research | HR3-306 | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
Escherichia coli BL21 (DE3) | Life Technologies Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
HEPES | Euromedex | 10-110-C | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13452-1KG | |
MicroMeshes 700/25 | MiTeGen | SKU: M3-L18SP-25L | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | P5413-500G | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
Superdex 75 10/300 -GL | GE healthcare | 17-5174-01 | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
Unipuck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Programs | |||
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
aimless | MRC Laboratory of Molecular Biology | Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013). | |
ccCluster | ESRF | Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). | local development |
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
MeshAndCollect workflow | ESRF | Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). | local development |
MXCuBE2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). | local development |
XDS | Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung | Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010) |