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Biochemistry

利用网格和收集荧光蛋白陶瓷的结构解

doi: 10.3791/58594 Published: March 19, 2019
* These authors contributed equally

Summary

我们介绍了使用网格德德收集协议来获得一个完整的衍射数据集, 用于随后的结构测定, 由从荧光蛋白 Cerulean 的许多小晶体中收集的部分衍射数据集组成。

Abstract

x 射线晶体学是获取有关生物大分子三维结构的高分辨率信息的主要技术。直到最近, 一个主要的要求是提供相对较大的、很好的衍射晶体, 这些晶体往往很难获得。然而, 串行晶体学的出现和多晶数据收集方法的复兴意味着大晶体的可用性不再需要成为一个限制因素。在这里, 我们展示了自动 MeshAndCollect 协议的使用, 该协议首先标识安装在同一样品支架上的许多小晶体的位置, 然后从一系列部分衍射数据集的晶体中进行收集。随后的合并和在结构确定中的使用。网格和收集可以应用于任何类型的微晶体, 即使弱衍射。作为一个例子, 我们在这里介绍了使用该技术来解决青色荧光蛋白 (CFP) Cerulean 的晶体结构。

Introduction

大分子 x 射线晶体学 (MX) 是迄今为止最常用的方法, 可以深入了解生物大分子的三维结构。然而, 一个主要的瓶颈是相对较大的, 良好的衍射晶体的要求。

通常, 特别是在结晶膜蛋白时, 只能获得最大尺寸中几微米的非常小的晶体。辐射损伤效应限制了可从单个微晶2收集的完整衍射数据集的分辨率, 而且通常有必要通过合并多个数据集来提高信噪比, 从而提高数据集的分辨率。部分衍射数据集, 来自不同的, 但同构晶体。x 射线光束在同步源和其他地方 (例如x 射线自由电子激光器 (x-fels)) 的通量密度的增加, 意味着即使是非常小的生物晶体也可以收集到有用的部分衍射数据集大分子。这反过来又导致了收集和合并从许多不同晶体收集的部分衍射数据集的新技术的发展, 以便为结构解决方案生成完整的数据集。这种技术通常被称为串行晶体学 (sx)3,4,5,6,7, 8。sx 的一个典型例子是使用喷射器设备将晶体浆料的狭窄流引入 x 射线束3,4,5。每次晶体暴露在 x 射线中, 从数千颗单独的晶体中收集 "静止不动" 的衍射图像时, 都会记录衍射图, 然后将这些信息合并以生成完整的数据集。然而, 这类串行数据收集的一个相当大的缺点是, 静止图像的处理可能存在问题。在串行晶体学实验6中, 如果晶体可以旋转, 或者从同一晶体中采集多个衍射图像, 数据质量就会大大提高

就是开发的就是将 sx 与 "标准" mx 旋转数据收集相结合, 并允许实验者以自动方式从同一大分子目标的众多晶体中收集部分衍射数据集安装在相同或不同的样品支架上。然后, 通过合并所收集的部分数据集的最同构, 获得完整的衍射数据集。网格和收集兼容任何最先进的同步加速器 x 射线波束线 mx (理想情况下插入设备设施, 在样品位置的光束尺寸相对较小 (20μm 或更小))。除了从一系列小的、衍射良好的晶体中汇编完整的数据集外, 该方法还非常适用于微晶体衍射质量的初步实验评估和不透明样品的处理,例如, 在中观生长的膜蛋白晶9。

在 MeshAndCollect 实验开始时, 使用低剂量 x 射线扫描确定单个样品支架中包含的许多晶体中每个晶体的两个维的位置。在此扫描过程中收集的衍射图像由 D备 r程序自动分析, 该程序根据样品支架各自的衍射强度对其在样品支架上的位置进行排序。部分数据集的收集位置是根据衍射强度截止时间自动分配的, 在最后一步中, 从每个选定的位置收集衍射数据的小楔形, 通常为±5°旋转。经验表明, 此旋转范围为每个晶体提供了足够的反射量, 用于部分数据集缩放目的, 同时减少了可能的晶体中心问题和在特别拥挤的支持1。然后, 可以手动或使用自动数据处理管道 10111213对单个衍射数据楔形 (部分数据集) 进行处理。对于下游结构的确定, 有必要找到要合并部分数据集的最佳组合 141516 , 之后可以以相同的方式处理生成的完整数据集作为一个起源于单晶实验。

作为网格和收集的一个例子在实践中, 我们在这里提出了青色荧光蛋白 (CFP) Cerulean 的晶体结构的解决方案, 使用的衍射数据集, 由从一系列收集的部分数据集的组合。安装在同一样品支架上的微晶。Cerulean 是由水母aequ列a 维多利亚17号的绿色荧光蛋白 (gfp) 设计的, 其荧光色母是由三个连续氨基酸残基的循环形成的。从 GFP 中获得了色粒的第一和第二残留物, 丝氨酸和酪氨酸, 分别到苏氨酸 (S65T) 和色氨酸 (Y66W), 并适应颜色处理环境与进一步的突变 (Y145A, Y145A, Y145A, M153T和 v163a), 以产生一个显著的, 但次优的荧光水平的 qy= 0.4918,19,20。有人提出, Cerulean 的次优荧光特性与复杂的蛋白质动力学有关, 这些动力学涉及蛋白质21中11种β链的不完全稳定, 并与两种不同色母体的适应有关异构体取决于 pH 值和辐照条件22。我们选择与 Cerulean 合作, 将其作为一种模型蛋白质, 以说明网格和收集协议的使用, 因为根据结晶的不同, 调整晶体尺寸相对容易。Cerulean 的结构与它的父蛋白 GFP 非常相似, 因为它是由一个β桶组成的, 周围有11个β链, 它带有色母粒。

Protocol

1 . 的表达和纯化

注: 这是以 Lelimousin 等人发布的协议为基础的.21

  1. 在大肠杆菌 Bl21 细胞中的快速 has 标记 Cerulean 细胞生长在37°c 的 4 L 的自动诱导培养基 23, 直到 OD 600= 1, 然后在27°c 孵育过夜。
  2. 以 5, 000 x克的速度采集细菌细胞,并通过超声 (40%、5分钟、10秒脉冲、10s 暂停) 在由 20 Mm tris ph 8.0、500 mm nacl 和 1x edtal 蛋白酶抑制剂组成的 200 ml 缓冲液中裂解细胞。
  3. 在相同的缓冲条件下 , 用 100 mM 咪唑将上清液装上 hs 陷阱 ni - nta 柱和。
  4. 池明亮的黄色分数。蛋白质具有固有的颜色, 因此含有硒的组分很容易区分。
  5. 在 20 mM Tris ph 8.0 中的 S75 柱上纯化蛋白质 (4 毫升)。
  6. 将明亮的黄色组分集中, 将蛋白质溶液集中到 15 mg/mL。

2. 结晶

  1. 在 Linbro 板中使用 20°c时的悬挂滴蒸气扩散技术24。在 pH 值6.75、12% PEG8000 和 100 mM MGCL 2 处, 用 100 mm hepes 组成的 100 Mm Hepes 在井中灌满1毫升的沉淀液.对于悬浮液, 将浓缩为15mgml 的1μl 蛋白质与1μl 的沉淀液混合。晶体应出现在24小时内。
  2. 收获所获得的晶体, 并将其转移到由 0.1 m HEPES pH 6.75、22% PEG 8000 组成的种子缓冲液的100μl 中。
  3. 用 0.1 mL 的组织磨床研磨晶体, 并在种子缓冲液中稀释 (比例 1:100)。
  4. 用胰蛋白酶 (同一缓冲液中的 0.5 Mg/ml) 消化蛋白质库存溶液的一个 (1:10 (v/v))。
  5. 将消化后的蛋白质溶液与10% 的含种子缓冲液 (v/v) 混合。
  6. 在 0.1 M HEPES ph 值 7, 14% peg8000, 0.1 mgcl 2 在1-1.5 μl 悬浮液中使用蒸汽扩散方法生长晶体 (10 * 10 * 20μm 3)。

3. 晶体安装

  1. 使用合适的环路,例如,一个700平方孔的网状环路, 每个孔25微米, 安装在 spine 标准样品支架25上。将结晶液从结晶液 (步骤 2.6) 转移到1Μl 的低温保护剂溶液中 (与甘油混合的井状沉淀液 (20% v/v 最终))。
  2. 通过移动晶体下的循环并将其从滴下抬出, 将蛋白质晶体浆料安装到网格环路上。理想情况下, 晶体的最大尺寸应在5μm–30μm 的尺寸范围内, 而不存在安装在环路中的晶体之间的重叠。
  3. 用滤纸快速触摸安装, 将多余的液体擦掉。沉积晶体, 使他们坐在平面的循环包围尽可能少的散装液体。
  4. 将安装到充满液氮的单盘中。将皮球以 100 K 的价格存放在合适的存储容器中, 直到光束时间可用。

4. 同步加速器实验的离线准备

注意: 尽早请求同步加速器光束时间, 并遵循可用访问类型和如何提交给定同步加速器申请的在线指南。ESRF 指南可在 http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying 找到。如果是 ESRF 块分配组 (BAG) 的成员, 则不需要每个特定项目的应用程序。在这种情况下, 实验者应该接近他们的袋子负责调度梁的时间。

  1. 在建议被接受并收到实验邀请后, 让所有参与者完成安全培训。在 "a 表单" (通过ESRF 用户门户, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) 中填写样品所需的安全信息。请联系当地联系人讨论实验。一旦您的 a 表单提交并验证, 它将为您提供实验编号和密码。
  2. 连接到扩展的 ISPyB26 (http://www.esrf.fr/), 然后选择mx
  3. 使用实验编号和 a 窗体中的密码登录。
  4. 选择货件添加 "新建"并填写所需信息。
  5. 选择"添加包裹"并填写相关数据。选择"添加容器", 选择一个非 ipuck 并填写所需的信息, 包括样品持有人在 puck 中的位置。

5. 将样品加载到波束线上

  1. 在实验哈奇中, 将皮球加载到样品转换器 (SC) 中, 并记下其位置。
  2. 互锁实验舱, 进入控制室。
  3. 登录到 ISPyB (https://esrf.fr/)。选择 "准备实验", 查找装运, 选择"下一步" , 并指示供应链中的波束线和皮球位置。
  4. 登录到波束线控制软件, 这里的 mxcube227,28与实验编号和密码提供的 a 表。
    1. 同步可将波束线控制软件与 ISPyB 数据库同步。
  5. 使用波束线控制软件, 将样品支架安装在测角仪上。在 MXCuBE2 中, 右键单击样品转换器区域中的某个位置, 然后选择"安装示例"
  6. 利用大多数 ESRF mx 波束线上安装的 MK3 微型 kappa 测角仪29 , 使用 mxcube2 的 "视觉重新调整" 工作流程30将样品支架的平面与测角仪的旋转轴对齐。
    1. 选择 "中心" 按钮, 然后在循环尖端边缘的中间选择3点点击中心。通过选择"保存"保存居中位置。
    2. 再次单击 "中心" 按钮, 然后在循环的茎开始中间单击中心。通过单击"保存"来保存第二个位置。
    3. 通过单击它选择保存的居中位置之一。
    4. "高级" 下, 将工作流视觉重定向添加到 mxcube2 数据收集队列中。
    5. 通过单击"收集队列" 启动工作流。
    6. 工作流将样品夹持器的平面与测角仪的旋转轴对齐后, 再次居中样品夹持器, 这次是在网格中间的某个位置。
  7. 通过使用 MXCuBE2 旋转欧米茄轴, 将样品支架定向, 使网格的表面与 x 射线光束方向垂直。
  8. 在 MXCuBE2 中, 选择扫描样品支架所需的光束大小 (仅适用于具有可变光束大小的波束线)。
    1. 单击波束线控制软件中的光圈下拉菜单, 然后选择一个值,例如10μm。
  9. 定义网格扫描的网格。
    1. 单击 MXCuBE2 中的网格工具图标。将出现网格工具窗口。
    2. 在 MXCuBE2 的示例视图中, 通过左键单击并将鼠标拖到样品支架上包含晶体的区域上绘制网格。
    3. 要保存网格, 请单击网格工具窗口中的加号按钮 (网格变为绿色)。

6. 准备和执行网格和收集工作流程

  1. 在 MXCuBE2 的分辨率字段中, 输入应收集衍射图像的分辨率 (dmin),例如,此处为1.8。
  2. 在 "高级数据收集" 选项卡中选择"网格和收集", 将其添加到队列中, 然后单击 "收集 队列"。
  3. 在出现的参数窗口中, 使用与波束相关的默认参数。在这里描述的实验中, 默认参数是每个网格扫描点的曝光时间 0.037 s, 100% 传输 (在这种情况下导致 4 x 1011 phps), 每个网格扫描线1°振荡。
  4. 单击 " continue"。利用 DOZOR 软件 1, 根据衍射强度每个栅格点上采集的网格扫描运行和衍射图像进行分析和排序。此过程在后台运行。
  5. 在继 DOZOR 分析之后, 将生成热图, 并根据衍射强度自动分配后续部分数据收集的顺序 (参见图 1)。
    注意: 此步骤的结果也可以在 ISPyB 中进行检查。对于部分数据集的收集, 在波束线控制软件中弹出一个设置的新选项卡, 选择旋转范围 (0.1°)、图像数量 (100)、曝光时间、分辨率、传输、理想情况下, 收集的每个楔形的剂量应低于 garman 极限 (30 mgey)。在所述实验条件下, 每张图像的大约曝光时间为 0.37 s 到0.1秒。
  6. 单击 "继续" 启动部分数据集合。

7. 数据处理

注意: 部分数据集集成了一个合适的程序 (XDS10)。为此, 将使用 Python 脚本来识别每个单独的数据集, 对其进行集成, 并确保不同部分数据集之间的索引是一致的。

  1. 打开包含图像的文件夹:/data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean。
  2. 制作可在收集部分数据集的文件夹中找到的进程子文件夹的安全副本。
    1. 在 Linux 终端上, 使用命令cp–r 进程 _ 备份
  3. 导航到进程文件夹并启动处理脚本。
    1. 在 Linux 终端上, 键入命令cd 进程并命中输入。
    2. 键入Procmultycydata 并命中输入。
      注意: 脚本将要求空间组和单元格参数 (此信息是可选的), 根据说明输入这些参数。在最后一次用户确认后, 脚本将自动运行。

8. 数据集的合并

注意: 在所有部分数据集集成后, 将它们的最佳组合合并, 以生成用于结构确定和细化的最终数据集。这个合并过程的不同的目标可以是获得充分的完整性 (强烈推荐)、高多样性或最佳的数据统计 (高 < I/(i) >、低 r 因素)。后者有时可能以牺牲完整性和多样性为代价, 因此应谨慎选择这一选择。

  1. 使用程序 ccCluster14合并部分数据集。它使用分层聚类分析 (HCA) 来确定同构部分数据集 () 的可能组合。
    1. 在 Unix 终端中键入CcCluster集, 以打开其图形用户界面 (gui)。
      注意: 在 ccCluster GUI 中绘制了一个树状图。这就提出了一个建议, 即哪些部分数据集可能是基于它们之间的同构而最好合并的。
    2. 单击与垂直轴上的值约0.4 相对应的节点。通常, 较高的值将包括更多的部分数据集, 但导致合并统计信息越差, 因为部分数据集的同构程度会降低。
    3. 点击市场数据。选定的群集将在后台处理, 估计的合并统计信息将显示在 GUI 中的新选项卡中。对于不同的数据集组合, 可以重复此步骤。对于部分数据集的良好组合, 完整性应接近 100%, < i (i) > 值高 (在最低分辨率外壳中为10或更高), r-meas31值较低 (在低分辨率外壳中约为 5%)。
  2. 对于所选的每个组合, 使用生成的输入脚本将所选的部分数据集合并到单个 mtz 文件中 (无意义的 32)。
  3. 使用缩放程序 (漫无目的 32) 明确缩放和合并此文件中的强度数据,与源自单晶数据收集的文件一样, 使用输出进行后续阶段阶段和结构解决方案33.

Representative Results

在 MXCuBE2 中实现的 MeshAndCollect (见图 1a) 用于收集位于同一样品支架上的 cerulean 小晶体的部分衍射数据集, 在该支架中难以对晶体进行视觉识别。为了筛选样品持有人, 我们在网环的中心绘制了一个网格 (参见图 1B), 并基于道佐尔分数热图 (参见图 1B, 1B), 自动收集了85个部分衍射数据集。这些被单独地集成了然后合并 (参见上文), 以产生一个数据集以99.8% 的完整性在 dmin = 1.7 (参见表 1)。最高分辨率外壳中的半组相关性 (CC)34为 60% (= 4.7)。正如所料, 分子置换33可以直接解决 Cerulean 的晶体结构, 并利用生成的数据集进行置换。经过细化, 我们得到了22.8% 的 R工作和25.4% 的r 不.具有先前确定结构的叠加 ( PDB 条目 2WSO21) 显示在cα位置为 0 . 1 全局 rmsd 。

合并数据集的统计信息
群集阈值 0.35
部分数据集的数量 25
空间小组 P212121
单位单元 (a、b、c) 50.98、62.76、69. 50
分辨率范围 46.58-1.70 (1.73-1.70)
Rmerge (所有 i + 和-) 0.133 (0.743)
Rmeas (所有 i + & i) 0.142 (0.813)
Rpim (所有 i + & i) 0.047 (0.318)
观察总数/独特 220669/25129
平均值 (i)/(i)) 13.8 (4.7)
锰 (i) 半集相关性 CC(1/2) 0.994 (0.602)
完整性 99.8 (99.5)
多样性 8.8 (6.5)
最终的 R冷冻机 22。8
最终r 免费 25。4

表 1: 合并数据集的统计数据, 表明所收集数据的高质量。

Figure 1
图 1: 使用网格和收集从同一样品支架中包含的一系列小晶体中收集一系列部分数据集.A) MXCuBE2 的用户界面。轴上查看器字段上的绿色椭圆表示网格工具。B) 在生命图像场中, 将一个网格绘制到样品持有人的图像上。C) 道佐尔分数的热图。D) 衍射图像的示例。E) 层次聚类分析后的树状图。红色数据集用于合并。F) Cerulean 的整体结构。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

MX 实验的成功通常取决于是否存在相对较大的衍射晶体。对于从小晶花洒到大晶体优化失败的项目, 网格德达收集提供了通过组合收集的同构部分数据集, 为结构解决方案获得完整的衍射数据集的可能性从一系列的小晶体。该方法与 MX 的同步加速器波束线兼容, 理想情况下具有高光子通量和较小的光束直径, 配备了最先进的衍射仪装置和快速读出检测器。在这样的终端站, 这种实验的数据收集部分大约需要 20分钟, 这取决于要收集的部分数据集的数量和要分析的含有晶体的样本持有者的数量。

网格德德收集实验成功的最重要的先决条件是样品支架上存在足够数量的衍射位置 (理想情况下为 50, 100个)。根据经验, 要分析的晶体的最小尺寸应在最小尺寸约为5μm。该方法与任何一种标准的低温冷却兼容样品支架兼容, 使用刚性和直网式安装可获得最佳效果。

在 ESRF, 就是以用户友好的方式在 Mxcube2 波束控制软件提供的 Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) 工作流程30中实现的。与其他 SX 方法相比, 网格和收集的一个主要优点是, 所收集的数据可以通过用于单晶 MX 的标准程序和自动化管道进行处理。

正如我们的示例所示, MeshAndCollect 非常易于应用, 并导致一系列部分衍射数据集, 通常从小晶体中收集, 这些数据集可以合并生成一个完整的数据集, 用于结构解决方案。此外, MeshAndCollect 还具有打开蛋白质晶体学采样空间的潜力, 因为它提供了一种从结晶试验中收集可用数据的方法, 在结晶试验中, 最后一个优化步骤----大晶体的生产----是不成功的。

鉴于目前 x 射线源 (例如,超亮光源 (ebs) 项目/esrf35) 的发展, 可以预见, 由于辐射损伤增加, 多晶数据收集的类型得到了便利在基于同步的 MX 波束线上, MeshAndCollect 将成为数据收集的标准方法, 而不是像目前这样的例外。

Disclosures

作者们没有什么可以透露的

Acknowledgments

我们感谢 ESRF 通过其内部研究计划提供光束时间。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
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DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
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DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).More

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).

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