Vi præsenterer MeshAndCollect-protokollen til at opnå en komplet diffraktion datasæt, til brug i efterfølgende struktur bestemmelse, der består af delvis diffraktion datasæt indsamlet fra mange små krystaller af fluorescerende proteiner Cerulean.
Røntgenkrystallografi er stor teknik, der anvendes til at opnå høj opløsning oplysninger om de 3-dimensionelle strukturer af biologiske makromolekyler. Indtil for nylig, har et væsentligt krav været tilgængeligheden af relativt stort, godt diffracting krystaller, der er ofte en udfordring at opnå. Dog, fremkomsten af serielle krystallografi og en renæssance i multi krystal dataindsamlingsmetoder har betydet, at tilgængeligheden af store krystaller behøver ikke længere være en begrænsende faktor. Her, illustrere vi anvendelsen af den automatiserede MeshAndCollect protokol, som først identificerer placeringen af mange små krystaller monteret på samme prøveholderen og derefter dirigerer samling fra krystaller af en serie af delvis diffraktion datasæt for efterfølgende fletning og brug i struktur bestemmelse. MeshAndCollect kan anvendes til enhver form for mikro-krystaller, selv om svagt diffracting. Som et eksempel præsenterer vi her teknik til at løse krystalstruktur af Cyan fluorescerende proteiner (FFP) Cerulean.
Makromolekylære røntgenkrystallografi (MX) er langt den mest anvendte metode til at opnå atomare opløsning indsigt i de tre-dimensionelle strukturer af biologiske makromolekyler. En stor flaskehalse er imidlertid kravet om relativt stort, godt diffracting krystaller.
Ofte, og især når crystallizing Membranproteiner, kun meget små krystaller af nogle få mikrometer i den største dimension kan opnås. Strålingsskader virkninger grænse for løsningen af en komplet diffraktion data angivet der kan indsamles fra en enkelt micro krystal2, og meget ofte, det er nødvendigt at forbedre signal-støj-forholdet og dermed datasæt beslutning, ved at flette flere delvis diffraktion datasæt fra forskellige, men isomorfe krystaller. Stigninger i fluxtæthed af X-ray bjælker på synkrotron kilder og andre steder (f.eks. røntgen fri-elektron lasere (X-FELs)), har betydet, at nyttige delvis diffraktion datasæt kan indsamles fra selv meget små krystaller af biologiske makromolekyler. Dette, til gengæld har ført til udviklingen af nye teknikker til indsamling og sammenlægning af delvis diffraktion datasæt indsamlet fra mange forskellige krystaller for at producere et komplet datasæt for struktur løsning. Disse teknikker er almindeligvis omtales som seriel krystallografi (SX)3,4,5,6,7,8. En prototypiske eksempel på SX er brugen af injektor enheder til at indføre en smal strøm af en krystal gylle i X-ray stråle3,4,5. Et diffraktionsmønster registreres, hver gang en krystal er udsat for røntgenstråler fører til samlingen, fra mange tusinder af enkelte krystaller af ‘stadig’ diffraktion billeder, information, som derefter flettes til at producere en komplet datasæt. En stor ulempe ved denne type af seriel dataindsamling er imidlertid, at behandling af still-billeder kan være problematisk. Datakvaliteten er betydeligt forbedret, hvis krystaller kan roteres og/eller flere diffraktion billeder er indsamlet fra den samme krystal under seriel krystallografi eksperimenter6.
MeshAndCollect1 blev udviklet med formålet at kombinere SX med ‘standard’ MX rotation dataindsamling og giver mulighed for i en automatisk måde, eksperimentatorer at indsamle delvis diffraktion datasæt fra talrige krystaller af samme makromolekylære målet monteret på de samme eller forskellige prøve indehavere. En komplet diffraktion datasæt er derefter fremstillet ved en sammenlægning af de mest isomorphous af de delvise datasæt indsamlet. MeshAndCollect er kompatibel med enhver state-of-the-art synkrotron X-ray beamline for MX (ideelt en indsættelse enhed facilitet med en relativt lille (20 µm eller mindre) stråle størrelse på prøve position). Ud over udarbejdelse af komplette datasæt fra en serie af små, godt diffracting krystaller er metoden også meget velegnet til den indledende eksperimentelle vurdering af diffraktion kvalitet af mikro-krystaller og for behandling af uigennemsigtige prøver, f.eks. i meso vokset microcrystals membran proteiner9.
I starten af en MeshAndCollect eksperiment fastlægges holdninger i to dimensioner, hver af de mange crystal indeholdt i en enkelt prøveholderen ved hjælp af en lav dosis X-ray scanning. De diffraktion billeder indsamlet under denne scanning analyseres automatisk af programmet DOZOR1, der sorterer holdninger af krystaller på prøveholderen efter deres respektive diffraktion styrke. Holdninger til indsamling af delvis datasæt tildeles automatisk på grundlag af en diffraktion styrke cut-off, og i det sidste trin, små kiler af diffraktion data, typisk ±5 ° rotation, er indsamlet fra hver valgte position. Erfaringen har vist, at denne rotation rækkevidde giver en tilstrækkelig mængde af refleksioner pr. krystal for delvis datasæt skalering formål, mens på samme tid reducere mulige krystal centrering spørgsmål og chancen for at afsløre flere krystaller i en især overfyldt støtte1. Enkelte diffraktion data kiler (delvis datasæt) er derefter behandlet enten manuelt eller ved hjælp af edb rørledninger10,11,12,13. For downstream struktur bestemmelse er det så nødvendigt at finde den bedste kombination af delvis datasæt til at være flettede14,15,16 , hvorefter den resulterende komplet datasæt kan behandles på samme måde med en oprindelse fra en enkelt krystal eksperiment.
Som et eksempel på MeshAndCollect i praksis præsenterer vi her løsningen af krystalstruktur af Cerulean Cyan fluorescerende proteiner (FFP) ved hjælp af en diffraktion datasæt konstrueret ud fra kombinationen af delvis datasæt indsamlet fra en række microcrystals monteret på den samme prøve støtte. Cerulean har været manipuleret fra grøn fluorescerende proteiner (NGL) fra vandmænd Aequorea victoria17, hvis fluorescerende farvelegeme dannes autocatalytically fra cyclisation af tre på hinanden følgende aminosyrerester. Cerulean er fremstillet af normal god landbrugspraksis muterer de første og anden rester af farvelegeme, en Serin og en tyrosin, threonin (S65T) og tryptophan (Y66W) henholdsvis og tilpasse farvelegeme miljø med yderligere mutationer (Y145A, N146I, H148D, M153T og V163A) til at producere en betydelig, men suboptimal fluorescens niveau af QY = 0,4918,19,20. Cerulean suboptimal fluorescerende egenskaber er blevet foreslået til at være forbundet med komplekse protein dynamics involverer den ufuldkomne stabilisering af en af de elleve β-tråde af protein21 og overnatning for to forskellige farvelegeme isomerer afhængigt af pH og bestråling betingelser22. Vi valgte at arbejde med Cerulean som en model protein illustrerer brugen af MeshAndCollect-protokollen grund til den forholdsvis lette tuning krystal størrelse afhængig af krystalliseringen. Cerulean struktur er meget lig at dens overordnede protein normal god landbrugspraksis, som det består af en β-tønde dannet af elleve β-tråde omkring en α-helix, som bærer farvelegeme.
Normalt afhænger succes af en MX eksperiment eksistensen af relativt stort, godt diffracting krystaller. For projekter hvor optimering fra lille krystal brusere til større krystaller mislykkes, giver MeshAndCollect en muligheden for at få en komplet diffraktion datasæt for struktur løsning via kombinationen af isomorphous delvis datasæt indsamlet fra en serie af små krystaller. Metoden er forenelig med synkrotron beamlines for MX, ideelt med en høj photon flux og en lille lysbundtets diameter, udstyret med en topmoderne diffractometer enheden og en hurtig-udlæsning detektor. På sådan en endestation, vil data collection del af sådan et eksperiment tage omkring 20 minutter, afhængig af antallet af delvise datasæt skal indsamles og antallet af krystal-holdige prøve indehavere skal analyseres.
Den vigtigste forudsætning for succes i en MeshAndCollect eksperiment er eksistensen af et tilstrækkeligt antal (mindst 50, 100 ideelt) af diffracting positioner på prøveholderen. Fra erfaring bør minimumsstørrelsen af krystaller skal analyseres omkring 5 µm i den mindste dimension. Metoden er forenelig med enhver form for standard cryo-køling kompatible prøve indehavere med de bedste resultater er opnået ved hjælp af mesh mounts, der er stive og lige.
På ESRF, er MeshAndCollect implementeret på en brugervenlig måde i en Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) arbejdsproces30 tilgængelige fra MXCuBE2 beamline control software. En stor fordel ved MeshAndCollect i forhold til andre SX metoder er at de indsamlede data kan behandles af standard programmer og automatiseret rørledninger anvendes til enkelt krystal MX.
Som eksemplet viser, MeshAndCollect er meget let at anvende og fører til en række delvis diffraktion datasæt, normalt indsamlet fra små krystaller, som kan flettes til at producere en komplet datasæt til brug i struktur løsning. Desuden har MeshAndCollect potentiale til at åbne prøveudtagning rum for Proteinkrystallografi da det giver en måde at indsamle brugbare data fra krystallisering forsøg hvor det sidste optimering skridt, produktion af store krystaller, er mislykket.
I lyset af de aktuelle udvikling i retning af lysere X-ray kilder (f.eks. meget genial kilde (EBS) projekt/ESRF35) er det overskuelig, på grund af øget strålingsskader, typen af multi krystal dataindsamling lettet af MeshAndCollect vil blive standardmetode til indsamling af data, snarere end en undtagelse-som det er tilfældet – på synkrotron-baserede MX beamlines.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker ESRF for at levere beam tid gennem sin in-house forskningsprogram.
Beamline | ESRF ID 23-1 | ||
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Crystallization plates XDXm with sealant | Hampton Research | HR3-306 | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
Escherichia coli BL21 (DE3) | Life Technologies Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
HEPES | Euromedex | 10-110-C | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13452-1KG | |
MicroMeshes 700/25 | MiTeGen | SKU: M3-L18SP-25L | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | P5413-500G | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
Superdex 75 10/300 -GL | GE healthcare | 17-5174-01 | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
Unipuck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Programs | |||
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
aimless | MRC Laboratory of Molecular Biology | Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013). | |
ccCluster | ESRF | Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). | local development |
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
MeshAndCollect workflow | ESRF | Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). | local development |
MXCuBE2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). | local development |
XDS | Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung | Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010) |