Vi presenterer bruken av MeshAndCollect-protokollen for å få et komplett Diffraksjon datasett, for bruk i etterfølgende proteinstrukturer, består av delvis Diffraksjon datasett fra mange små krystaller av fluorescerende protein Cerulean.
Røntgenkrystallografi er store teknikken brukes til å få høy oppløsning informasjon om 3-dimensjonale strukturer av biologiske makromolekyler. Inntil nylig er en stor krav tilgjengeligheten av relativt store, godt diffracting krystaller, som er ofte utfordrende å få. Men har ankomsten av føljetong krystallografi og en renessanse for multi-krystall datainnsamlingsmetoder ment at tilgjengeligheten av store krystaller trenger ikke lenger være en begrensende faktor. Her illustrere vi bruken av automatiserte MeshAndCollect-protokollen, som først identifiserer plasseringen av mange små krystaller montert på samme eksempel holderen og leder deretter samlingen fra krystaller av en rekke delvis Diffraksjon datasett for etterfølgende fletting og bruk i proteinstrukturer. MeshAndCollect kan brukes til alle typer mikro-krystaller, selv om svakt diffracting. Som et eksempel presenterer vi her bruk av teknikken å løse krystallstruktur av Cyan fluorescerende Protein (CFP) Cerulean.
Macromolecular Røntgenkrystallografi (MX) er langt, den mest brukte metoden for å få atomic oppløsning innsikt i tredimensjonale strukturer av biologiske makromolekyler. En stor flaskehalser er imidlertid behovet for relativt store, godt diffracting krystaller.
Ofte, og spesielt når bandets membran proteiner, bare svært små krystaller av noen få mikroner i største dimensjon kan oppnås. Stråling skader effekter grensen oppløsningen til en komplett Diffraksjon data angitt som kan hentes fra en enkelt mikro krystall2, og svært ofte, er det nødvendig å forbedre signal til støyforhold og dermed angitt oppløsning ved å flette flere delvis Diffraksjon datasett fra ulike, men isomorphic krystaller. Økningen i flux tettheten av X-ray bjelker ved synchrotron kilder og andre steder (f.eks X-ray fri-elektron lasere (X-FELs)), har betydd at nyttig delvis Diffraksjon datasett kan hentes fra selv svært små krystaller av biologisk makromolekyler. Dette, i sin tur har ført til utviklingen av nye teknikker for innsamling og sammenslåing av delvis Diffraksjon datasett samlet fra mange forskjellige krystaller for å produsere et komplett datasett struktur løsning. Slike teknikker er ofte referert til som føljetong krystallografi (SX)3,4,5,6,7,8. En prototypiske eksempel på SX er bruk av injektor enheter å innføre en smal strøm av en krystall slurry i røntgenbilde stråle3,4,5. Et Diffraksjon mønster registreres hver gang en krystall er eksponert for røntgenstråling fører til samlingen, fra tusenvis av individuelle krystaller, ” Diffraksjon stillbilder, informasjon som slås deretter for å produsere et komplett datasett. En betydelig ulempe av denne typen føljetong datainnsamling er imidlertid at behandlingen av stillbilder kan være problematisk. Datakvaliteten er betydelig forbedret hvis krystaller kan roteres og/eller flere Diffraksjon bilder er samlet inn fra samme crystal under føljetong krystallografi eksperimenter6.
MeshAndCollect1 ble utviklet med sikte på å kombinere SX med ‘standard’ MX rotasjon datainnsamling og gir, i en automatisk måte, forskere samle delvis Diffraksjon datasett fra mange krystaller av samme macromolecular målet montert på samme eller forskjellige utvalg innehavere. Et komplett Diffraksjon datasett hentes ved å flette den mest isomorphous av delvis datasettene samlet. MeshAndCollect er kompatibel med alle state-of-the-art synchrotron X-ray beamline for MX (ideelt en innsetting enhet anlegg med en relativt liten (20 µm eller mindre) stråle størrelse utvalg der). I tillegg til kompileringen av komplette datasett fra en rekke små, godt diffracting krystaller er metoden også veldig egnet for første eksperimentelle vurdering av Diffraksjon kvaliteten på mikro-krystaller og for behandling av ugjennomsiktig prøvene, i meso vokst microcrystals membran proteiner9.
På starten av en MeshAndCollect eksperiment bestemmes plasseringen, i to dimensjoner, av mange krystall i en enkelt prøve holder med en lav dose X-ray skanning. Diffraksjon bildene samlet under denne skanningen analyseres automatisk av programmet DOZOR1, som sorterer plasseringen av krystallene på prøven abonnenten i henhold til deres respektive Diffraksjon styrke. Posisjoner for innsamling av delvis datasett tilordnes automatisk basert på en Diffraksjon styrke cut-off og i det siste trinnet, små huddeler Diffraksjon data, vanligvis ±5 ° av rotasjon, er samlet inn fra hver valgte posisjon. Erfaring har vist at dette rotasjon området gir en tilstrekkelig mengde refleksjoner per krystall for delvis datasettet skalering formål, mens på samme tid, redusere mulig krystall sentrering problemer og sjansen til å utsette flere krystaller i en spesielt overfylt støtte1. Individuelle Diffraksjon data kiler (delvis datasett) blir deretter behandlet enten manuelt eller ved hjelp av automatiserte databehandling rørledninger10,11,12,13. For nedstrøms proteinstrukturer er det da nødvendig å finne den beste kombinasjonen av delvis datasett skal flettede14,15,16 som det resulterende komplette datasettet kan behandles på samme måte som en som stammer fra en enkelt krystall eksperiment.
Som et eksempel på MeshAndCollect i praksis presenterer vi her løsningen av krystall Cyan fluorescerende Protein (CFP) Cerulean, bruker et Diffraksjon datasett konstruert av kombinasjonen av delvis datasett fra en rekke microcrystals montert på samme eksempel støtte. Cerulean er konstruert fra Green fluorescerende Protein (GFP) fra maneter Aequorea victoria17, som fluorescerende chromophore er autocatalytically dannet fra cyclisation av tre påfølgende aminosyre rester. Cerulean hentes fra GFP av mutere første og andre rester av chromophore, en serine og en tyrosin, threonin (S65T) og tryptofan (Y66W) henholdsvis og tilpasse chromophore miljøet med ytterligere mutasjoner (Y145A, N146I, H148D, M153T og V163A) å produsere et betydelig, men suboptimal fluorescens nivå av QY = 0.4918,19,20. Suboptimal fluorescerende egenskapene for Cerulean er foreslått å være knyttet til komplekse protein dynamics involverer imperfektum stabilisering av en av de elleve β-trådene protein21 og innkvartering av to forskjellige chromophore isomerene avhengig av pH og bestråling forhold22. Vi valgte å jobbe med Cerulean som en modell protein illustrerer bruken av MeshAndCollect protokollen grunn det relativt enkelt å tuning krystall størrelse avhengig av krystallisering. Strukturen i Cerulean er svært lik som sin overordnede protein GFP, som det er sammensatt av en β fat dannet av elleve β-tråder rundt en α-helix, som bærer chromophore.
Suksessen til et MX eksperiment er vanligvis avhenger av eksistensen av relativt store, godt diffracting krystaller. For prosjekter der optimalisering fra liten krystall dusjer til større krystaller mislykkes, gir MeshAndCollect en mulighet for å få en komplett Diffraksjon datasett for struktur løsning via kombinasjonen av isomorphous delvis datasett samlet fra en rekke små krystaller. Metoden er kompatibel med synchrotron beamlines for MX, helst med en høy Foton forandring og en liten stråle diameter, utstyrt med en toppmoderne diffractometer enhet og en rask-avlesning detektor. På slike en endestasjon tar data collection del av slikt eksperiment ca 20 minutter, avhengig av antall delvis datasett som samles og antall krystall-inneholder eksempel holdere som skal analyseres.
Den viktigste forutsetningen for suksessen til et MeshAndCollect eksperiment er eksistensen av et tilstrekkelig antall (minst 50, 100 ideelt) av diffracting posisjoner på prøven abonnenten. Fra erfaring, bør minimumsstørrelsen på krystaller som skal analyseres være ca 5 µm i minste dimensjon. Metoden er kompatibel med alle slags standard cryo-kjøling kompatibel Prøv innehaverne med de beste resultatene oppnås med mesh ridedyr som er stive og rett.
På ESRF, er MeshAndCollect implementert i en brukervennlig måte i en Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) arbeidsflyt30 tilgjengelig fra den MXCuBE2 beamline programvaren. En stor fordel av MeshAndCollect sammenlignet med andre SX metoder er at de innsamlede dataene kan behandles av standard programmer og automatisert rørledninger brukes for én krystall MX.
Som vårt eksempel viser, MeshAndCollect er svært enkel å bruke og fører til en rekke delvis Diffraksjon datasett, vanligvis samlet fra små krystaller, som kan flettes for å produsere et komplett datasett for bruk i strukturen løsning. Videre har MeshAndCollect potensial til å åpne opp prøvetaking løpet av protein krystallografi som det gir en måte å samle brukbare data fra krystallisering forsøk der optimalisering programmvaren, produksjon av store krystaller, er mislykket.
I lys av dagens utvikling mot lysere X-ray kilder (f.eks ekstremt strålende kilde (EBS) prosjekt/ESRF35) er det forventede at på grunn av økt stråling skade, typen multi-krystall datainnsamling lettere av MeshAndCollect vil bli standardmetoden for datainnsamling, i stedet for et unntak-som er tilfelle – på synchrotron-baserte MX beamlines.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker ESRF for å gi strålen tid gjennom sin egen forskningsprogram.
Beamline | ESRF ID 23-1 | ||
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Crystallization plates XDXm with sealant | Hampton Research | HR3-306 | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
Escherichia coli BL21 (DE3) | Life Technologies Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
HEPES | Euromedex | 10-110-C | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13452-1KG | |
MicroMeshes 700/25 | MiTeGen | SKU: M3-L18SP-25L | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | P5413-500G | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
Superdex 75 10/300 -GL | GE healthcare | 17-5174-01 | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
Unipuck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Programs | |||
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
aimless | MRC Laboratory of Molecular Biology | Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013). | |
ccCluster | ESRF | Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). | local development |
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
MeshAndCollect workflow | ESRF | Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). | local development |
MXCuBE2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). | local development |
XDS | Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung | Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010) |