פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת כתב כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת קולטן-ליגנד אינטראקציות.
אינטראקציות בין קולטני ליגנדים מהווים תהליך ביולוגי בסיסי. אולם, ישירה ניסויים עם תאים המבטאים את הקולטן מקורית, ליגנד מאתגרת כיוון ליגנד של קולטן מסוים עשוי להיות לא ידוע בצרות עם ליגנד מקורי יכול להיות מסובך טכנית. כדי לטפל מכשולים אלה, נתאר מערכת הכתב כדי לזהות את איגוד והפעלה של קולטן ספציפי ליגנד עניין. מערכת זו כתב, המחשבים חוץ-תאי של קולטן מסוים היא מצומדת העכבר CD3ζ, חלבון chimeric זה מתבטא ואז העכבר BW תאים. אז יכול להיות מודגרות תאים אלה-BW transfected עם מטרות שונות (למשל, תאים או נוגדנים). הפעלה של קולטן transfected מוביל הפרשת interleukin-2 העכבר (mIL-2) אשר ניתן להבחין מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה). מערכת הכתב הזה יש את היתרונות של להיות רגיש וספציפי על קולטן בודד. בנוסף, רמת ההפעלה של קולטן ספציפי בקלות ניתן לכמת והוא יכול לשמש גם במקרים בו ליגנד של הקולטן אינו ידוע. מערכת זו יושמה בהצלחה ברבות מן המחקרים שלנו לאפיון אינטראקציות קולטן-ליגנד. יש לנו עובדים לאחרונה מערכת זו כדי ללמוד את ההפעלה של רצפטורים Fcγ האנושית (FcγRs) באמצעות נוגדנים anti-CD20 monoclonal שונים בשימוש קליני.
מערכת הכתב BW היא שיטת לימוד אינטראקציות קולטן-ליגנד1. מערכת זו היא יתרון במיוחד כאשר ליגנד של קולטן מסוים אינו ידוע או ניסויים ליגנד אנדוגני קשים מבחינה טכנית. זה יכול לשמש גם ללמוד את הכריכה של נוגדנים חד-שבטיים FcγRs האנושי. השיטה מבוססת על ביטוי חלבון chimeric בתאים העכבר BW. חלבון chimeric זה מורכב תחום חוץ-תאי של הקולטן עניין דבוקה על התחומים transmembrane, תאיים של הרשת אפי ‘ עכבר ‘. איגוד של ליגנדים המתאים של הקולטן מוביל הפרשת il-2 העכבר, אשר ניתן לאתרם בקלות על ידי אליסה, כמופיע באיור1. שיטה זו היא רגיש ואת ספציפי לקולטן בודדים, קלה לתפעול, במיוחד לשחזור. זה יכול ובכך משלימים כלים נוספים ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד. לדוגמה, ניתן להשתמש למסך מספר שורות תאים לנוכחות של ליגנד על קולטן ספציפי (גם אם ליגנד עצמה לא זוהתה) או כדי לזהות את ההפעלה של האדם FcγRs על ידי נוגדנים חד-שבטיים או בנסיוב אדם המכילים אנטי-ויראליות נוגדנים. למרות ראשי תאים חיסוניים אקספרס FcγRs אנדוגני, הם בדרך כלל קשה להתמודד עם ולבטא בדרך כלל מספר הקולטנים Fc.
השתמשנו במערכת זו בהצלחה ברבות מן המחקרים שלנו לאפיון אינטראקציות קולטן-ליגנד. אלה כוללים זיהוי haemagglutinin ליגנד של הקולטן התא NK NKp462, זיהוי PVR ו- nectin-2 ליגנדים עבור האדם והעכבר TIGIT3,4, ומאגד להראות את זה nucleatum fusobacterium את החיידק, הפעלת TIGIT האנושי5. בנוסף, BW תאים המבטאים קולטנים Fc שימשו בהצלחה לזהות נוגדנים אנטי ויראלית של המטופלים סרה6,7,8. באופן ספציפי, לאחרונה הקמנו BW תאים המבטאים FcγRs האנושית לזהות הפעלת ה-FcR דיפרנציאלית של נוגדנים אנטי-CD20 המשמש לטיפול של לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL)9. חשוב, יש התוצאות של מערכת הכתב BW מאומתים בניסויים משלימים.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מערכת הכתב לחקור אינטראקציות קולטן-ליגנד (ראה צורה מקוצרת של פרוטוקול זה1). הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים עיקריים: שיבוט של חלבון chimeric, הכולל את תחום חוץ-תאי קולטן ספציפי התמזגו לתחום תאיים של CD3ζ, תרביות תאים של פלסמיד המבטאת את חלבון כימרי לתאים BW (למשל , מאת אלקטרופורציה), וזיהוי כמותי של העכבר il-2 מאת אליסה. המוצר הסופי של כל אחד מחלקים אלה צריך לאמת באופן עצמאי: תהליך השיבוט צריך להיות מאומת על ידי רצף שלם של החלבון פיוז’ן של פלסמיד היעד, תרביות תאים של תאי BW צריך לאמת על ידי בחינת הביטוי של קולטן עניין ב BW התאים (למשל, על ידי cytometry זרימה), ואת התהליך אליסה צריך לאמת על-ידי פקדים חיובי הכללית (למשל, 2 מיליון recombinant), כמו גם עם פקדים ספציפיים עבור התאים BW transfected; קרי, מטרות המבטאים של ליגנד הידוע של הקולטן עניין (לדוגמה, תאים CD48 אקספרס ניתן כפקד חיובי עבור תאים BW המבטאים את NK תא קולטן 2B4). למשל, תהליך השיבוט יכול להיות מוצלח, אבל חלבון כימרי אינו מתבטא על ידי תאים BW. במקרה כזה, יש לחזור על אלקטרופורציה. לחלופין, אם אין סימן מעל פני הרקע של צלחת אליסה (במיוחד עבור הפקדים חיובי) התאים BW transfected עשוי נכשלו להביע את הקולטן (או הביטוי אבד) או בעיה טכנית ייתכן שאירעה במהלך התהליך אליסה.
מספר שינויים יכול להתבצע על פרוטוקול זה תוך שמירה על עקרונות כלליים של ההליך. שינויים אלה כוללים את הווקטור המשמש כדי לבטא את חלבון כימרי, שיטת העבודה transfecting את פלסמיד לתאים BW ו פרמטרים ספציפיים הקשורים הדגירה אליסה כגון סוג היעד (למשל, התאים, נוגדנים, וכו ‘) , מספר התאים היעד או ריכוז נוגדן אם רלוונטי (אנו משתמשים 50,000 תאים לכל טוב, נוגדן מתחיל במינון של µg 0.5/טוב), זמן הדגירה (אנו משתמשים זמן הדגירה של 48 שעות) ונפח supernatant שמועבר לצלחת אליסה.
שיטה זו היא רגישה, ספציפית ולא ניתן לכמת בקלות. זה אידיאלי לסינון לנוכחות של ליגנדים עבור קולטני מסוימים (במיוחד אם ליגנד עצמה לא הוכר). לאחר הכנת transfected BW תאים המבטאים קולטן ספציפי, תאים אלה יכולים להיות קפוא, המשמש בעת הצורך לניסויים נוספים. אנחנו ואחרים השתמשו במערכת זו בהצלחה במחקרים קודמים כדי לחקור את קולטן-ליגנד אינטראקציות (לדוגמה2,3,5,12,13,14 15,16) ואת התוצאות המתקבלות על-ידי מערכת זו אומתו על ידי טכניקות אחרות. בשיטה זו יכול לשמש גם כדי ללמוד את ההפעלה של רצפטורים שונים FcγR האנושי באמצעות נוגדנים, כפי שעשו עבור נוגדנים אנטי-ויראליות בסרום-6,–7,–8 או עם נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD20 9.
מאחר שזוהי מערכת הכתב שבו מבוטא רק על קטע חוץ-תאי של הקולטן, הממצאים שבידי מערכת זו יש השלמה על ידי ניסויים נוספים עם הקולטן אנדוגני, כגון מבחני cytotoxicity עם הטבע תאים הרוצח (NK) ללמוד אינטראקציות עם NK התא קולטנים. יתר על כן, אינטראקציות ליגנד/קולטן מסוים עלולה לא הפרשת mIL-2 על ידי מערכת הכתב, לכן אולי אפשר להתעלם. בנוסף, כמו כל הגדרת הניסוי, התוצאות צריך לאמת עבור פרמטרים שונים כפי שתואר לעיל. הדבר חשוב במיוחד במקרים בהם השוואה של שני תנאים נדרשים (למשל, הפעלת הקולטן Fc אותו באמצעות נוגדנים שונים). חשוב גם לוודא הרגישות של אינטראקציה ליגנד מסוים-קולטן הוא בתוך הטווח. ליניארית של המערכת. אחרת זה יכול להוביל ערכי הרוויה אשר עשוי למנוע השוואה תקפה בכל התנאים. זו יכולה להיות מושגת באמצעות עיקול תקן mIL-2, כמו גם על ידי יצירת עקומת מנה-תגובה עם ליגנד שנבדקו (במקרה של קולח ערכים, הפרמטרים ניסיוני צריך להיות שונה; למשל, נפח קטן יותר של תגובת שיקוע צריך להיות מנותח על ידי אליסה). עוד מגבלה אפשרי של מערכת זו הוא השימוש של התאים היעד עם הפרשות אנדוגני של מיליון-2 (למשל, העכבר T תאים) אשר יסתיר את הפרשת il-2 תאים BW. כדי להתגבר על התרחשויות אלה יוצאת דופן אשר מרותקים לתאים העכבר, מערכת זו כתב יכולים להשתפר באמצעות עיתונאי שונים (למשל, ה-GFP) אשר לא בא לידי ביטוי על-ידי תאי היעד.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים אסתר זמר על עריכת שפה. מחקר זה נתמך על ידי המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / הסכם גרנט ERC מספר 320473-BacNK. תמיכה נוספת סופק על ידי אני-ליבת התוכנית התכנון ואת ועדת תקציב הקרן הלאומית למדע על ידי אני-הליבה-כרומטין ו- RNA הכונה, קרן GIF, הקרן המשפחתית על לואיס, המענק פרופסורה ICRF, הלמהולץ ישראל גרנט, הקרן Rosetrees (הכל כדי וכך). מחקר זה נתמך גם על ידי הקרן הלאומית למדע (גרנט 502/15), פרס מחקר רפואי קס ומענק מחקר של האגודה ישראל להמטולוגיה ורפואה עירוי (כדי חווה). O.M הוא פרופסור הכתר של אימונולוגיה מולקולרית.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |