Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter en reporter system som kan brukes til å identifisere og telle reseptor-ligand interaksjoner.
Interaksjoner mellom reseptorer og ligander utgjør en grunnleggende biologisk prosess. Imidlertid direkte eksperimenter med celler som uttrykker innfødt reseptoren og ligand er utfordrende siden ligand en bestemt reseptoren kan være ukjent og eksperimentelle prosedyrer med innfødt ligand kan være teknisk komplisert. For å løse disse hindringene, beskriver vi en reporter system for å oppdage bindingen og aktivering av en bestemt reseptor ved en ligand rundt. I denne reporteren system, ekstracellulære domenet til en bestemt reseptor er konjugert til musen CD3ζ og denne chimeric protein uttrykkes deretter musen BW celler. Disse transfekterte BW cellene kan da være inkubert med forskjellige mål (f.eks, celler eller antistoffer). Aktivering av en transfekterte reseptor fører til utskillelsen av musen interleukin-2 (mIL-2) som kan oppdages av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Dette reporter systemet har fordelene av å være følsom og bestemte å en enkelt reseptor. I tillegg aktiveringsnivået for en bestemt reseptor lett kan kvantifiseres og kan brukes selv i tilfeller der ligand av reseptoren er ukjent. Dette systemet er implementert med hell i mange av våre studier som karakteriserer reseptor-ligand interaksjoner. Vi har nylig ansatt dette systemet å studere aktivering av menneskelig Fcγ-reseptorer (FcγRs) av ulike monoklonale anti-CD20 antistoffer i klinisk bruk.
BW reporter systemet er en teknikk for å studere reseptor-ligand interaksjoner1. Dette systemet er spesielt fordelaktige når ligand en bestemt reseptoren er ukjent eller eksperimenter med endogene ligand teknisk vanskelig. Det kan også brukes for å studere binding av monoklonale antistoffer mot menneskelig FcγRs. Metoden er basert på uttrykke et chimeric protein i musen BW celler. Dette chimeric protein består av ekstracellulære domenet til reseptoren rundt del transmembrane og intracellulær domener av musen ζ kjeden. Binding av aktuelle ligander av reseptoren fører til sekresjon av musen IL-2, som lett kan oppdages ved ELISA, som vist i figur 1. Denne metoden er følsom og gjelder for en enkelt reseptoren, enkel å betjene, og svært reproduserbare. Det kan således utfyller ekstra verktøy for å studere reseptor-ligand interaksjoner. For eksempel, kan den brukes til skjermen flere linjer for tilstedeværelsen av en ligand for en bestemt reseptor (selv om ligand selv ikke er identifisert) eller å oppdage aktivering av menneskelig FcγRs av monoklonale antistoffer eller humant serum inneholder anti-viral antistoffer. Selv om primære immunceller express endogene FcγRs, er de generelt vanskelig å håndtere og vanligvis express flere Fc reseptorer.
Vi har brukt dette systemet med hell i mange av våre studier som karakteriserer reseptor-ligand interaksjoner. Disse inkluderer identifisere haemagglutinin som ligand av NK celle reseptor NKp462, identifisere PVR og nectin-2 som ligander for menneske og mus TIGIT3,4, og viser at fusobacterium nucleatum bakterie binder og aktiverer menneskelige TIGIT5. I tillegg har BW celler som uttrykker Fc reseptorer blitt brukt med hell å oppdage anti-viral antistoffer i pasientenes sera6,7,8. Spesielt etablert vi nylig BW celler som uttrykker menneskelige FcγRs for å oppdage differensial FcR aktivering av anti-CD20 antistoffer brukes for behandling av kronisk lymfatisk leukemi (CLL)9. Viktigst, har resultatene av BW reporter systemet validert komplementære eksperimenter.
Her presenterer vi en protokoll for å generere en reporter system for å undersøke reseptor-ligand samhandlinger (se en forkortet form av denne protokollen i1). Protokollen består av tre hoveddeler: kloning av en chimeric protein, som inkluderer den ekstracellulære domenet av en bestemt reseptor smeltet intracellulær domenet av CD3ζ, hva av en plasmider som uttrykker fusion protein BW celler (f.eks , av electroporation), og kvantitative mus IL-2 med ELISA. Det endelige produktet av hver av disse delene må bekreftes uavhengig: kloning prosessen må verifiseres av komplett sekvensering av fusion proteinet i målet plasmider, hva BW cellene må bekreftes ved å undersøke uttrykk for den reseptor for BW cellene (f.eksav flowcytometri) og ELISA prosessen må bekreftes ved generelt positiv kontroller (f.eks, rekombinant mIL-2) eller med bestemte kontroller for transfekterte BW cellene; dvs. mål som uttrykker en kjent ligand av reseptoren av interesse (f.eks, celler som uttrykker CD48 kan også brukes som en positiv for BW celler som uttrykker NK celle reseptor 2B4). For eksempel, kloning prosessen kan være vellykket, men fusion protein er uttrykt ikke av BW cellene. I dette tilfellet skal electroporation gjentas. Alternativt, hvis det ikke er noe signal over bakgrunnsnivået av ELISA plate (spesielt for positiv kontrollene) transfekterte BW cellene ikke uttrykke reseptoren (eller uttrykket er brutt) eller et teknisk problem har oppstått i ELISA prosessen.
Flere endringer gjøres til denne protokollen samtidig bevare de generelle prinsippene av prosedyren. Disse endringene inkluderer vektoren å uttrykke fusion protein, metoden for transfecting plasmider BW celler og bestemte parametere knyttet til inkubasjon og ELISA som type mål (f.eks celler, antistoffer, osv.) , antall målcellene eller antistoff konsentrasjonen hvis relevant (vi bruker 50 000 celler per brønn og et antistoff starter dose 0,5 µg/vel), inkubasjon tid (vi bruker en inkubasjon tid 48 h) og supernatant volumet som overføres til ELISA plate.
Denne metoden er sensitiv, bestemt og lett kan kvantifiseres. Det er ideelt for screening for tilstedeværelsen av ligander for spesifikke reseptorer (spesielt hvis ligand selv ikke har blitt anerkjent). Etter å forberede transfekterte BW celler som uttrykker en bestemt reseptor, kan disse cellene frosset og brukes ved behov for ekstra eksperimenter. Vi og andre har brukt dette systemet ble tidligere studier for å utforske reseptor-ligand samhandlinger (for eksempel2,3,5,12,13,14 15,16) og resultatene av dette systemet har blitt bekreftet av andre teknikker. Denne metoden kan også brukes til å studere aktivering av ulike menneskelige FcγR reseptorer av antistoffer, som har blitt gjort for anti-viral antistoffer i serum6,7,8 eller monoklonale antistoffer mot CD20 9.
Siden dette er en reporter system som bare ekstracellulære segmentet av reseptoren uttrykkes, bør resultatene oppnås ved dette systemet suppleres med flere eksperimenter med endogene reseptoren, som cytotoksisitet analyser med naturlig Killer (NK) celler å studere interaksjon med NK celle reseptorer. Videre enkelte ligand/reseptor interaksjoner resulterer ikke i en mIL-2 sekresjon av reporteren systemet, og derfor kan overses. I tillegg i noen eksperimentelle oppsett, skal resultatene bekreftes for ulike parametere som beskrevet ovenfor. Dette er spesielt viktig i tilfeller der en sammenligning av to forhold er nødvendig (f.eksaktivering av samme Fc reseptoren av ulike antistoffer). Det er også viktig å kontrollere at følsomheten til en bestemt ligand-reseptor interaksjon innen lineær systemet. Ellers kan dette føre til metning verdier som kan utelukke en gyldig sammenligning over betingelser. Dette kan oppnås ved hjelp av en standard mIL-2-kurve og generere en dose-respons kurve med testet ligand (ved saturating verdier, eksperimentelle parameterne bør endres. f.eksen mindre mengde nedbryting skal analyseres med ELISA). En annen mulig begrensning av dette systemet er bruken av målcellene med endogene sekret av mIL-2 (f.eksmus T celler) som ville skjule IL-2 utskillelsen av BW celler. For å overvinne disse svært uvanlig forekomster som er begrenset til musen celler, kan reporter systemet forbedres ved hjelp av ulike reporter (f.eksGFP) som ikke er uttrykt ved målcellene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Esther Singer for redigering. Denne studien ble støttet av den europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant avtalen antall 320473-BacNK. Ytterligere støtte ble gitt av jeg-kjernen i planlegging og budsjettering komité og Israel Science Foundation og jeg-kjernen på Chromatin og RNA i Gene regulering, GIF grunnlaget, Lewis Family Foundation, ICRF professorat tilskuddet, den Helmholtz Israel grant og Rosetrees tillit (alle ved O.M.). Denne studien ble også støttet av Israel Science Foundation (grant 502/15) Kass medisinsk forskning prisen og et forskningsstipend fra Israel Society for hematologi og transfusjon medisin (til S.E). O.M er krone professor molekylær immunologi.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |