Este protocolo describe cómo establecer un sistema de reportero que puede utilizarse para identificar y cuantificar las interacciones receptor-ligando.
Interacciones entre receptores y ligandos constituyen un proceso biológico fundamental. Sin embargo, dirigir experimentos con las células que expresan el receptor nativo y el ligando son difíciles ya que el ligando de un receptor específico puede ser desconocido y procedimientos experimentales con el ligando natural pueden ser técnicamente complicados. Para hacer frente a estos obstáculos, describimos un sistema reportero para detectar la Unión y activación de un receptor específico por un ligando de interés. En este sistema de reportero, se conjuga el dominio extracelular de un receptor específico al ratón de CD3ζ y esta proteína quimérica entonces se expresa en células de ratón BW. Estas células transfected BW pueden entonces incubarse con diferentes objetivos (p. ej., células o anticuerpos). Activación de un receptor transfected conduce a la secreción de interleucina 2 de ratón (mIL-2) que puede ser detectada por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Este sistema reportero tiene las ventajas de ser sensible y específico para un solo receptor. Además, el nivel de activación de un receptor específico puede cuantificarse fácilmente y puede utilizarse incluso en casos donde el ligando del receptor es desconocido. Este sistema ha sido implementado con éxito en muchos de nuestros estudios para caracterizar las interacciones receptor-ligando. Recientemente hemos utilizado este sistema para estudiar la activación de los receptores de Fcγ humanas (FcγRs) por anticuerpos anti-CD20 monoclonal diferentes en uso clínico.
El sistema de BW reportero es una técnica para el estudio de las interacciones ligando-receptor1. Este sistema es especialmente ventajoso cuando el ligando de un receptor específico es desconocido o experimentos con el ligando endógeno son técnicamente difíciles. También puede ser utilizado para el estudio de la Unión de anticuerpos monoclonales humanos FcγRs. El método se basa en expresar una proteína quimérica en células de ratón BW. Esta proteína quimérica está compuesto por el dominio extracelular del receptor de interés sobre los dominios transmembranales e intracelulares de la cadena ζ de ratón. Unión de ligandos apropiados del receptor conduce a la secreción de IL-2 de ratón, que puede ser fácilmente detectada por ELISA, como se ilustra en la figura 1. Este método es sensible y específico a un receptor individual, fácil de operar y altamente reproducibles. Así pueden complementar herramientas adicionales para el estudio de las interacciones receptor-ligando. Por ejemplo, puede ser utilizado para varias líneas de celulares por la presencia de un ligando de un receptor específico de la pantalla (aunque no se ha identificado el ligando sí mismo) o para detectar la activación de la FcγRs humana por anticuerpos monoclonales o por suero humano que contengan antiviral anticuerpos. Aunque las células inmunes primarias expresan FcγRs endógena, son generalmente difíciles de manejar y generalmente expresan varios receptores de Fc.
Hemos utilizado este sistema con éxito en muchos de nuestros estudios para caracterizar las interacciones receptor-ligando. Se trata de identificar la hemaglutinina como el ligand del receptor de la célula NK NKp462, identificación de PVR y 2 de la molécula como ligandos para el ser humano y el ratón TIGIT3,4, y demostrando que el fusobacterium nucleatum se une la bacteria y activa humana TIGIT5. Además, han utilizado con éxito células de BW que expresan receptores Fc para detectar anticuerpos antivirales en suero6,7,8 pacientes. En concreto, recientemente establecido células de BW que expresan FcγRs humano para detectar la activación diferencial de FcR de anticuerpos anti-CD20 utilizado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL)9. Lo importante, los resultados del sistema BW reportero han sido validados en experimentos complementarios.
Aquí presentamos un protocolo para la generación de un sistema de reportero para investigar las interacciones receptor-ligando (ver una forma abreviada de este protocolo en1). El protocolo se compone de tres partes principales: la clonación de una proteína quimérica, que incluye el dominio extracelular de un receptor específico fusionado al dominio intracelular de CD3ζ, transfección de un plásmido que expresa la proteína de fusión a las células de BW (p. ej. , por electroporación) y detección cuantitativa de ratón IL-2 por ELISA. El producto final de cada una de estas partes debe ser verificado independientemente: el proceso de clonación debe ser verificado por secuenciación completa de la proteína de fusión en el plásmido de destino, la transfección de las células de BW debe verificarse examinando la expresión de la receptores de interés en las células de BW (por ejemplo, mediante citometría de flujo) y el proceso de ELISA deben ser verificada por general controles positivos (p. ej., mIL-2 recombinante), así como con controles específicos para las células transfected BW; es decir, objetivos que expresan un ligando conocido del receptor de interés (por ejemplo, las células que expresa CD48 puede usarse como un control positivo para células de BW que expresan las NK célula receptor 2B4). Por ejemplo, el proceso de clonación puede ser acertado, pero la proteína de fusión no es expresada por las células de BW. En este caso, debe repetirse la electroporación. Alternativamente, si no hay señal por encima del nivel de fondo de la placa de ELISA (especialmente para los controles positivos) las células transfected BW pueden no han podido expresar el receptor (o la expresión se ha perdido) o puede haber ocurrido un problema técnico durante el el proceso de ELISA.
Varias modificaciones pueden hacerse en el presente Protocolo preservando los principios generales del procedimiento. Estas modificaciones incluyen el vector utilizado para expresar la proteína de la fusión, el método de transferencia del plásmido a las células de BW y parámetros específicos relacionados con la incubación y ELISA como el tipo de objetivo (p. ej., células, anticuerpos, etc.) , número de las células diana o la concentración de anticuerpos si es relevante (usamos 50.000 células por pozo y un anticuerpo a partir de dosis de 0,5 μg/pocillo), tiempo de incubación (nosotros usamos un tiempo de incubación de 48 h) y el volumen de sobrenadante que se transfiere a la placa de ELISA.
Este método es sensible, específico y puede cuantificarse fácilmente. Es ideal para la detección de la presencia de ligandos para receptores específicos (especialmente si el ligando en sí mismo no ha sido reconocido). Después de preparar células transfected de BW que expresan un receptor específico, estas células pueden ser congeladas y utilizadas cuando sea necesario para experimentos adicionales. Nosotros y otros han utilizado este sistema con éxito en estudios anteriores para explorar las interacciones receptor-ligando (por ejemplo2,3,5,12,13,14 15,16) y los resultados obtenidos por este sistema han sido verificados por otras técnicas. Este método puede utilizarse también para estudiar la activación de distintos receptores FcγR humanos por anticuerpos, como se ha hecho para anticuerpos antivirales en el suero6,7,8 o con anticuerpos monoclonales contra el CD20 9.
Ya que este es un sistema de reportero en el que se expresa solamente el segmento extracelular del receptor, los resultados obtenidos por este sistema deberán complementarse con experimentos adicionales con el receptor endógeno, como ensayos de citotoxicidad con natural las células asesinas (NK) para el estudio de las interacciones con NK célula receptores. Por otra parte, ciertas interacciones ligando receptor podrán no resultar en la secreción de una 2 mIL por el sistema de reportero y por lo tanto pueden pasar por alto. Además, como en cualquier instalación experimental, los resultados deben ser verificados para diversos parámetros como se describió anteriormente. Esto es especialmente importante en caso de que una comparación de dos condiciones necesarias (p. ej., activación del mismo receptor de Fc de anticuerpos diferentes). También es importante verificar que la sensibilidad de una interacción ligando-receptor específico está dentro del rango lineal del sistema. De lo contrario esto podría conducir a valores de saturación que pueden impedir una comparación válida en condiciones. Esto puede lograrse usando una curva estándar de mIL-2, así como generar una curva de dosis-respuesta con el ligando probado (en el caso de saturar los valores, los parámetros experimentales deben ser modificados; por ejemplo, un menor volumen de sobrenadante debe ser analizada por ELISA). Otra posible limitación de este sistema es el uso de las células blanco con las secreciones endógenas de mIL-2 (por ejemplo, las células T de ratón) que sería enmascarar la secreción IL-2 de células de BW. Para superar estos acontecimientos altamente inusuales que están confinados a las células de ratón, este sistema reportero podría mejorarse mediante el uso de un reportero diferente (por ejemplo, GFP) que no se expresa por las células diana.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Esther Singer para la edición de la lengua. Este estudio fue apoyado por el Consejo Europeo de investigación de la Unión Europea en el séptimo programa marco (FP/2007-2013) / acuerdo de subvención del CEI número 320473-BacNK. Apoyo adicional fue proporcionado por el principal programa del Comité de presupuestación y la planificación y la Fundación de Ciencias de Israel y por el I-Core en la cromatina y el ARN en la regulación génica, la Fundación de GIF, la Fundación de la familia de Lewis, la beca de la Cátedra ICRF, el Concesión de Israel de Helmholtz y la confianza de Rosetrees (todos a la O.M.). Este estudio también fue apoyado por Israel Science Foundation (grant 502/15), el Premio de investigación médica de Kass y una beca de investigación de Israel sociedad de Hematología y medicina transfusional (a S.E). O.M es corona profesor de Inmunología Molecular.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |