Denne protokol beskriver, hvordan du opretter en reporter system, der kan bruges til at identificere og kvantificere receptor-ligand interaktioner.
Interaktioner mellem receptorer og ligander udgør en grundlæggende biologiske proces. Men direkte forsøg med celler, der udtrykker den indfødte receptor og liganden er udfordrende da ligand på en bestemt receptor kan være ukendte og eksperimentelle procedurer med de indfødte ligand kan være teknisk kompliceret. For at løse disse hindringer, beskriver vi en reporter system for at opdage de bindende og aktivering af en bestemt receptor af en ligand interesse. I denne reporter system, det ekstracellulære domæne af en bestemt receptor er konjugeret med musen CD3ζ og denne kimære protein er så udtrykt i mus BW celler. Disse transfected BW cellerne kan derefter inkuberes med forskellige mål (fx, celler eller antistoffer). Aktivering af en transfected receptor fører til udskillelse af musen interleukin-2 (mIL-2), hvilket kan afsløres ved enzymmaerket assay (ELISA). Denne reporter system har fordelene ved at være følsom og specifik for en enkelt receptor. Derudover varslingsniveau i en bestemt receptor kan nemt kvantificeres og kan bruges selv i tilfælde, hvor ligand for receptor er ukendt. Dette system er implementeret med succes i mange af vores undersøgelser for at karakterisere receptor-ligand interaktioner. Vi har for nylig ansat dette system til at studere aktivering af menneskelige Fcγ receptorer (FcγRs) ved forskellige monoklonale anti-CD20 antistoffer i klinisk brug.
BW reporter system er en teknik til at studere receptor-ligand interaktioner1. Dette system er særligt fordelagtige, når ligand på en bestemt receptor er ukendt eller eksperimenter med den endogene ligand er teknisk vanskeligt. Det kan også bruges til at studere bindingen af monoklonale antistoffer til menneskelige FcγRs. Metoden bygger på at udtrykke en kimære protein i mus BW celler. Denne kimære protein er sammensat af den ekstracellulære domæne af receptor af interesse smeltet til de transmembrane og intracellulære domæner af musen ζ kæde. Binding af passende ligander af receptor fører til udskillelse af musen IL-2, som let kan påvises ved ELISA, som illustreret i figur 1. Denne metode er følsom og specifik for en enkelt receptor, nem at betjene, og yderst reproducerbare. Det kan således supplere yderligere værktøjer til at studere receptor-ligand interaktioner. For eksempel, kan det bruges til at screene flere cellelinjer til tilstedeværelsen af en ligand for en bestemt receptor (selvom liganden, selv ikke er blevet identificeret) eller til at registrere aktivering af menneskelige FcγRs af monoklonale antistoffer eller humant serum indeholdende anti-virale antistoffer. Selvom primære immunceller express endogene FcγRs, er de generelt vanskeligt at håndtere og som regel udtryk for flere Fc-receptorer.
Vi har brugt dette system med succes i mange af vores undersøgelser for at karakterisere receptor-ligand interaktioner. Disse omfatter identifikation flerbasiske som NK celle receptoren NKp462, identificerer PVR og nectin-2 som ligander til mennesker og mus TIGIT3,4, ligand og viser, at fusobacterium nucleatum bakterie binder og aktiverer menneskelige TIGIT5. Derudover har BW celler, der udtrykker Fc-receptorer været brugt med held kan påvise anti-virale antistoffer i patienternes sera6,7,8. Specifikt, vi for nylig har etableret BW celler, der udtrykker menneskelige FcγRs for at registrere differential FcR aktivering af anti-CD20 antistoffer bruges til behandling af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL)9. Vigtigere, er resultaterne af BW reporter system blevet valideret i supplerende forsøg.
Her præsenterer vi en protokol til at generere en reporter system for at undersøge receptor-ligand interaktioner (se en forkortet form af denne protokol i1). Protokollen er sammensat af tre hoveddele: kloning af en kimære protein, som omfatter den ekstracellulære domæne af en bestemt receptor sammenvokset til CD3ζ, Transfektion af et plasmid, der udtrykker fusion protein til BW celler intracellulære domæne (f.eks. , af elektroporation), og kvantitativ påvisning af musen IL-2 ved ELISA. Det endelige produkt af hver af disse dele bør kontrolleres uafhængigt: kloningsprocessen bør kontrolleres af komplet sekventering af fusion protein i target plasmid, Transfektion af BW celler skal derfor bekræftes ved at undersøge et udtryk for den receptor interesse for BW celler (f.eks.ved flowcytometri) og ELISA proces bør kontrolleres af generelle positive kontroller (fx, rekombinant mIL-2) og med specifikke kontrolelementer for transfected BW celler; dvs., mål, der udtrykker en kendt ligand på receptor af interesse (f.eks., celler at udtrykke CD48 kan bruges som en positiv kontrol for BW celler, der udtrykker NK celle receptoren 2B4). For eksempel, kloning processen kan blive vellykket, men fusion protein er ikke udtrykt af BW celler. I dette tilfælde bør elektroporation gentages. Alternativt, hvis der ikke er noget signal over baggrundsniveauet i ELISA-pladen (især for den positive kontrol) transfected BW cellerne kan har undladt at udtrykke receptoren (eller udtrykket er gået tabt) eller et teknisk problem kan være opstået under ELISA-proces.
Denne protokol kan foretages flere ændringer samtidig med at de generelle principper for proceduren. Disse ændringer omfatter den vektor, der anvendes til at udtrykke fusion protein, metoden for transfecting plasmid til BW celler og specifikke parametre relateret til inkubation og ELISA som typen af mål (fx celler, antistoffer, osv.) , antal målceller eller antistof koncentration hvis relevante (vi bruger 50.000 celler pr. brønd og et antistof start dosis på 0,5 µg/brønd), Inkubationstiden (vi bruger en inkubationstiden for 48 h) og supernatanten volumen, der er overført til ELISA-pladen.
Denne metode er følsomme, specifikke og let kan kvantificeres. Den er ideel til screening for forekomst af ligander til specifikke receptorer (især hvis liganden, selv ikke er blevet anerkendt). Efter at forberede transfekteret BW celler, der udtrykker en bestemt receptor, kan disse celler frosne og bruges når der er behov for yderligere forsøg. Vi og andre har anvendt dette system med succes i tidligere undersøgelser for at udforske receptor-ligand interaktioner (for eksempel2,3,5,12,13,14 15,16) og resultaterne af dette system er blevet bekræftet af andre teknikker. Denne metode kan også bruges til at studere aktivering af forskellige menneskelige FcγR receptorer af antistoffer, som er sket for anti-virale antistoffer i serum6,7,8 eller med monoklonale antistoffer imod CD20 9.
Da dette er en reporter system, hvor kun den ekstracellulære segment af receptoren udtrykkes, bør resultaterne af dette system suppleres med yderligere eksperimenter med den endogene receptor, såsom cytotoksicitet assays med naturlige Killer (NK) celler til at undersøge interaktioner med NK celle receptorer. Endvidere, visse ligand/receptor interaktioner kan ikke resultere i en mIL-2 sekretion af reporter system, og derfor kan blive overset. Derudover som en eksperimentel opsætning, skal resultaterne kontrolleres for forskellige parametre som beskrevet ovenfor. Dette er især vigtigt i tilfælde, hvor en sammenligning af to betingelser er påkrævet (f.eks.aktivering af den samme Fc receptor af forskellige antistoffer). Det er også vigtigt at kontrollere, at følsomheden af en specifikke ligand-receptor interaktion er inden for det lineære område af systemet. Ellers kunne det føre til mætning værdier, som kan udelukke en gyldig sammenligning på tværs af betingelser. Dette kan opnås ved hjælp af en mIL-2 standardkurve samt ved at generere en dosis-respons kurve med den testede ligand (for mætte værdier, experimental parametre bør ændres; f.eks.en mindre mængde af supernatanten skal analyseres ved hjælp af ELISA). En anden mulig begrænsning af dette system er brug af target-cellerne med endogene sekreter af mIL-2 (f.eks.mus T celler), som ville maske IL-2 udskillelsen af BW celler. For at overvinde disse meget usædvanlige begivenheder, som er begrænset til musen celler, kan denne reporter system forbedres ved hjælp af forskellige reporter (f.eks.normal god landbrugspraksis) der ikke er udtrykt af target-cellerne.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Esther Singer redigeringsværktøjer sprog. Denne undersøgelse blev støttet af det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC tilskudsaftalens nummer 320473-BacNK. Yderligere støtte blev leveret af jeg-KERNEN programmet om planlægning og budgettering udvalget og Israel Science Foundation og af jeg-Core på kromatin og RNA i genregulering, GIF Foundation, Lewis Family Foundation, ICRF professorat grant, den Helmholtz Israel grant og Rosetrees Trust (alle til O.M.). Denne undersøgelse blev også støttet af Israel Science Foundation (grant 502/15), Kass Medical Research Award og forskning tilskud fra Israel samfund for Hematologi og blodtransfusion medicin (at Anja). O.M er Crown professor i molekylær immunologi.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |