Dit protocol wordt beschreven hoe een verslaggever systeem dat kan worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van receptor-ligand interacties te stellen.
Interacties tussen receptoren en liganden vormen een fundamenteel biologisch proces. Echter directe experimenten met cellen die de inheemse receptor uitdrukken en de ligand zijn uitdagend omdat de ligand voor een specifieke receptor kan onbekende en experimentele procedures met de inheemse ligand kunnen technisch ingewikkeld. Om deze belemmeringen, beschrijven we een verslaggever systeem op te sporen van de bindende en activering van een specifieke receptor door een ligand van belang. In dit systeem verslaggever het extracellulaire domein van een specifieke receptor is geconjugeerd met muis CD3ζ en dit chimeer eiwit wordt vervolgens uitgedrukt in muis BW cellen. Deze transfected cellen BW kunnen vervolgens worden geïncubeerd met verschillende doelen (bijvoorbeeldcellen en antilichamen). Activering van een transfected receptor leidt tot de afscheiding van muis interleukin-2 (mIL-2), die kan worden gedetecteerd door de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). Deze verslaggever systeem heeft de voordelen van het gevoelige en specifieke aan een enkele receptor. Bovendien, het Activeringsniveau van een specifieke receptor kan gemakkelijk worden gekwantificeerd en kan worden gebruikt, zelfs in gevallen waar de ligand van de receptor onbekend is. Dit systeem heeft in veel van onze studies te karakteriseren receptor-ligand interacties met succes geïmplementeerd. We hebben onlangs gebruikt dit systeem om te bestuderen van de activering van menselijke Fcγ receptoren (FcγRs) door verschillende monoklonaal anti-CD20 antistoffen bij klinisch gebruik.
Het systeem van de verslaggever BW is een techniek voor het bestuderen van de receptor-ligand interacties1. Dit systeem is vooral voordelig als het ligand voor een specifieke receptor onbekend is of experimenten met de endogene ligand technisch moeilijk zijn. Het kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de binding van monoklonale antilichamen tegen menselijke FcγRs. De methode is gebaseerd op het uiten van een chimeer eiwit in muis BW cellen. Dit chimeer eiwit is samengesteld uit de extracellulaire domein van de receptor van belang gesmolten tot de transmembrane en intracellulaire domeinen van de muis ζ keten. Binding van passende liganden van de receptoren leidt tot afscheiding van muis IL-2, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door ELISA, zoals geïllustreerd in Figuur 1. Deze methode is de gevoelig en specifiek zijn voor een individuele receptor, eenvoudig te bedienen, en zeer reproduceerbaar. Het kan dus extra hulpprogramma’s voor het bestuderen van de receptor-ligand interacties aanvullen. Bijvoorbeeld, kan het worden gebruikt om het scherm verschillende cellijnen voor de aanwezigheid van een ligand voor een specifieke receptor (zelfs als het ligand zelf niet is geïdentificeerd) of om te ontdekken de activering van menselijke FcγRs, door monoclonal antilichamen of door menselijk serum met anti-virale antilichamen. Hoewel de primaire immune cellen express endogene FcγRs, zijn ze over het algemeen moeilijk te hanteren en meestal express verschillende Fc receptoren.
We hebben dit systeem met succes gebruikt in veel van onze studies te karakteriseren receptor-ligand interacties. Deze omvatten hemagglutinine identificeren als het ligand van de NK-cel receptor NKp462, PVR en nectin-2 identificeren als liganden voor mens en muis TIGIT3,4, en waaruit blijkt dat de fusobacterium nucleatum bacterie bindt en Hiermee activeert u een menselijke TIGIT5. Daarnaast BW cellen die uitdrukking geven aan Fc receptoren hebben met succes gebruikt om anti-virale antilichamen in patiënten sera6,7,8. Specifiek, we onlangs opgericht BW cellen die uitdrukking geven aan menselijke FcγRs op te sporen gedifferentieerde FcR activering van anti-CD20 antilichamen gebruikt voor de behandeling van chronische lymfatische leukemie (CLL)9. Nog belangrijker is, zijn de resultaten van het BW verslaggever gevalideerd in complementaire experimenten.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een verslaggever systeem om te onderzoeken receptor-ligand interacties (zie een verkorte vorm van dit protocol in1). Het protocol bestaat uit drie hoofdonderdelen: klonen van een chimeer eiwitten, waaronder de extracellulaire domein van een specifieke receptor gesmolten tot het intracellulaire domein van CD3ζ, transfectie van een plasmide die het fusieproteïne naar BW cellen uitdrukt (bv , door electroporation), en kwantitatieve opsporing van muis IL-2 door ELISA. Het uiteindelijke product van elk van deze delen moet onafhankelijk worden gecontroleerd: het klonen proces dient te worden geverifieerd door volledige sequentiebepaling van het fusie-eiwit in de target-plasmide, de transfectie van de cellen BW dient te worden geverifieerd door het onderzoek van de uitdrukking van de receptor van belang in het BW cellen (bijvoorbeelddoor stroom cytometry) en de ELISA proces dient te worden geverifieerd door algemene positieve controles (b.v., recombinante mIL-2), alsook met de specifieke besturingselementen voor de transfected cellen BW; dat wil zeggen, doelstellingen die uitdrukking geven aan een bekende ligand van de receptor van belang (b.v., cellen dat uitdrukkelijke CD48 kan worden gebruikt als positieve controle voor BW-cellen die uitdrukking geven aan de NK cel receptor 2B4). Bijvoorbeeld, het klonen proces succesvol kan zijn, maar de fusieproteïne wordt niet uitgedrukt door de cellen van het BW. In dit geval moet de electroporation worden herhaald. Als alternatief, als er geen signaal boven het achtergrondniveau van de ELISA-plaat is (vooral voor de positieve controles) BW transfected cellen kunnen hebben gefaald wil de receptor (of de expressie verloren gegaan) of een technisch probleem mogelijk hebben voorgedaan tijdens de ELISA-proces.
Verschillende wijzigingen kunnen worden aangebracht bij dit protocol, met behoud van de algemene beginselen van de procedure. Deze wijzigingen omvatten de vector gebruikt om uit te drukken de fusieproteïne, de methode voor het transfecting van de plasmide BW cellen en specifieke parameters die betrekking hebben op de incubatie en ELISA zoals het soort doel (bijvoorbeeld cellen, antilichamen, enz.) , aantal doelcellen of de antilichaam-concentratie, indien van toepassing (wij gebruiken 50.000 cellen per well en een antilichaam startdosis van 0,5 µg per putje), incubatietijd (wij gebruiken een incubatietijd van 48 uur) en het supernatant volume dat wordt overgedragen aan de ELISA-plaat.
Deze methode is gevoelig, specifieke en gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Het is ideaal voor screening op de aanwezigheid van liganden voor specifieke receptoren (vooral als het ligand zelf is niet erkend). Na de voorbereiding van transfected cellen BW die uitdrukking geven aan een specifieke receptor, kunnen deze cellen worden bevroren en gebruikt wanneer nodig voor aanvullende experimenten. Wij en anderen hebben dit systeem met succes gebruikt in eerdere studies om te verkennen receptor-ligand interacties (bijvoorbeeld2,3,5,12,13,14 15,16) en de resultaten van dit systeem zijn geverifieerd door andere technieken. Deze methode kan ook worden gebruikt om te studeren van de activering van verschillende menselijke FcγR receptoren door antilichamen, zoals is gebeurd voor anti-virale antilichamen in serum6,7,8 of met monoklonale antilichamen tegen CD20 9.
Aangezien dit een verslaggever systeem waarin alleen de extracellulaire segment van de receptor wordt uitgedrukt, moeten de resultaten verkregen door dit systeem worden aangevuld met extra expermenteren de endogene receptor, zoals cytotoxiciteit testen met natuurlijke Killer (NK) cellen te bestuderen van interacties met NK cel receptoren. Bovendien bepaalde ligand/receptor interakties kunnen niet leiden tot een mIL-2 secretie door de verslaggever-systeem, en daarom zou kunnen worden over het hoofd gezien. Bovendien, zoals in enige experimentele opstelling, moeten de resultaten worden geverifieerd voor diverse parameters zoals hierboven beschreven. Dit is vooral belangrijk in gevallen waar een vergelijking van twee voorwaarden vereist (bijvoorbeeldde activering van de dezelfde Fc receptor door verschillende antilichamen is). Het is ook belangrijk om te controleren of de gevoeligheid van een specifieke ligand-receptor interactie binnen het lineaire bereik van het systeem. Anders kan dit leiden tot verzadiging waarden die een geldige vergelijking over voorwaarden beletten kunnen. Dit kan worden bereikt met behulp van een mIL-2 standaard curve alsmede door het genereren van een dosis-responscurve met de geteste ligand (in het geval van het verzadigen van waarden, de experimentele parameters moeten worden gewijzigd; bijvoorbeeld, een kleiner volume van het supernatans dat moet worden geanalyseerd door ELISA). Een andere mogelijke beperking van dit systeem is het gebruik van doelcellen met endogene afscheidingen van mIL-2 (bijvoorbeeldmuis T-cellen) die de IL-2 secretie van BW cellen zou maskeren. Om te overwinnen deze hoogst ongewone voorvallen die zijn beperkt tot de muis cellen, kan deze verslaggever systeem worden verbeterd met behulp van een verschillende verslaggever (bijvoorbeeldGFP) die niet wordt uitgedrukt door de doelcellen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Esther Singer voor het bewerken van de taal. Deze studie werd ondersteund door de Europese Onderzoeksraad onder het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP/2007-2013) / ERC subsidieovereenkomst nummer 320473-BacNK. Verdere steun werd voorzien door de kern programma van de Planning en budgettering Comité en de Israël Science Foundation en de ik-Core op de chromatine en RNA in genregulatie, de GIF-Stichting, de Lewis Family Foundation, de ICRF hoogleraarschap subsidie, de Helmholtz Israël grant en het vertrouwen van de Rosetrees (alle aan O.M.). Deze studie werd ook ondersteund door de Israël Science Foundation (grant 502/15), de Kass medische Research Award en een onderzoek subsidie van de Israël samenleving van hematologie en transfusiegeneeskunde (S.E). O.M is een kroon professor in moleculaire immunologie.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |