Ce protocole décrit comment établir un système qui permet d’identifier et de quantifier les interactions ligand-récepteur.
Interactions entre les récepteurs et ligands constituent un processus biologique fondamentaux. Cependant, diriger des expériences avec des cellules qui expriment le récepteur natif et le ligand sont difficiles car le ligand d’un récepteur spécifique peut être inconnu et procédures expérimentales avec le ligand natif peuvent être techniquement compliqués. Pour remédier à ces obstacles, les auteurs décrivent un système pour détecter les liaisons et l’activation d’un récepteur spécifique par un ligand d’intérêt. Dans ce système de journaliste, le domaine extracellulaire d’un récepteur spécifique est conjugué à la souris CD3ζ et cette protéine chimérique est alors exprimée dans les cellules de souris BW. Ces cellules transfectées de BW peuvent ensuite être incubées avec des objectifs différents (par exemple, des cellules ou des anticorps). Activation d’un récepteur transfectée entraîne la sécrétion d’interleukine-2 de la souris (mIL-2) qui peut être détectée par dosage immunoenzymatique (ELISA). Ce système a l’avantage d’être sensible et spécifique à un récepteur unique. En outre, le niveau d’activation d’un récepteur spécifique facilement quantifiable et peut être utilisé même dans les cas où le ligand du récepteur est inconnu. Ce système a été implanté avec succès dans bon nombre de nos études pour caractériser les interactions ligand-récepteur. Nous avons récemment utilisé ce système pour étudier l’activation des récepteurs Fcγ humains (FcγRs) par les anticorps différents anticorps monoclonal anti-CD20 en usage clinique.
Le système de journaliste BW est une technique pour l’étude des interactions de récepteur-ligand1. Ce système est particulièrement avantageux lorsque le ligand d’un récepteur spécifique est inconnu ou expériences avec le ligand endogène sont techniquement difficiles. Il peut être également utilisé pour l’étude de la liaison des anticorps monoclonaux pour FcγRs humaine. La méthode est basée sur exprimant une protéine chimérique dans les cellules de souris BW. Cette protéine chimérique se compose du domaine extracellulaire du récepteur d’intérêt fusionné vers les domaines transmembranaires et intracellulaires de la chaîne ζ de souris. Liaison des ligands appropriés du récepteur entraîne la sécrétion d’il-2 de la souris, qui peut être facilement détecté par ELISA, comme illustré à la Figure 1. Cette méthode est sensible et spécifique à un récepteur individuel, facile à utiliser et très reproductible. Il peut donc compléter des outils supplémentaires pour l’étude des interactions de récepteur-ligand. Par exemple, il peut être utilisé pour plusieurs lignées cellulaires pour la présence d’un ligand pour un récepteur spécifique de l’écran (même si le ligand lui-même n’a pas été identifié) ou pour détecter l’activation de la FcγRs humaine par anticorps monoclonaux ou de sérum humain contenant des anti-viraux anticorps. Bien que les cellules immunitaires primaires expriment FcγRs endogène, ils sont généralement difficiles à manipuler et exprimer habituellement plusieurs récepteurs de Fc.
Nous avons utilisé ce système avec succès dans bon nombre de nos études pour caractériser les interactions ligand-récepteur. Ceux-ci incluent identifiant hémagglutinine comme le ligand du récepteur cellulaire NK NKp462, identifiant PVR et nectin-2 comme ligands pour l’homme et de la souris TIGIT3,4, et montrant que le fusobacterium nucleatum bactérie lie et active humaine TIGIT5. En outre, les cellules de BW qui expriment les récepteurs Fc ont été utilisés avec succès pour détecter les anticorps antivirales dans les sérums de patients’6,7,8. Plus précisément, nous récemment mis en place des cellules de BW qui expriment FcγRs humain pour détecter les différentiels d’activation FcR des anticorps anti-CD20, utilisé pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique (LLC)9. Ce qui est important, les résultats du système BW journaliste ont été validés lors d’expériences complémentaires.
Nous présentons ici un protocole permettant de générer un système rapporteur pour étudier les interactions ligand-récepteur (voir la forme abrégée du présent protocole à1). Le protocole est composé de trois parties principales : clonage d’une protéine chimérique, ce qui inclut le domaine extracellulaire d’un récepteur spécifique fondue au domaine intracellulaire de CD3ζ, transfection d’un plasmide qui exprime la protéine de fusion de cellules de BW (par exemple , par électroporation) et détection quantitative de souris IL-2 par ELISA. Le produit final de chacune de ces pièces doit être vérifié indépendamment : le processus de clonage devraient être vérifié par un séquençage complet de la protéine de fusion dans le plasmide de cible, la transfection des cellules BW doit être vérifiée en examinant l’expression de la récepteur d’intérêt dans les cellules de BW (p. ex., par cytométrie en flux) et le processus d’ELISA doit être vérifiée par des contrôles positifs générales (p. ex., recombinant mIL-2), ainsi qu’avec des contrôles spécifiques pour les cellules transfectées de BW ; par exemple, les cibles qui expriment un ligand connu du récepteur d’intérêt (par exemple, les cellules que CD48 express peut être utilisé comme témoin positif pour les cellules de BW qui expriment le NK cell receptor 2 b 4). Par exemple, le processus de clonage peut réussir, mais la protéine de fusion n’est pas exprimée par les cellules de BW. Dans ce cas, l’électroporation doit être répétée. Ou bien, si il n’y a aucun signal au-dessus du niveau de fond de la plaque ELISA (en particulier pour les contrôles positifs) les cellules transfectées de BW semble ne pas avoir expriment le récepteur (ou l’expression a été perdue) ou un problème technique est survenu au cours de le processus d’ELISA.
Plusieurs modifications peuvent être effectuées, au présent protocole, tout en préservant les principes généraux de la procédure. Ces modifications incluent le vecteur utilisé pour exprimer la protéine de fusion, la méthode pour transfectants le plasmide aux cellules de BW et de paramètres spécifiques liés à l’incubation et ELISA comme le type de cible (par exemple, cellules, anticorps, etc.) , nombre de cellules cibles ou la concentration d’anticorps si nécessaire (nous utilisons 50 000 cellules par puits et d’un anticorps à partir de la dose de 0,5 µg/puits), temps d’incubation (nous utilisons un temps d’incubation de 48 h) et le volume de surnageant qui est transféré à la plaque ELISA.
Cette méthode est sensible, spécifique et peut être facilement quantifié. Il est idéal pour le dépistage de la présence de ligands des récepteurs spécifiques (surtout si le ligand lui-même n’a pas été reconnu). Après avoir préparé les cellules transfectées de BW qui expriment un récepteur spécifique, ces cellules peuvent être congelés et utilisées au besoin pour d’autres expériences. Nous et autres avons utilisé ce système avec succès dans des études antérieures d’explorer les interactions ligand-récepteur (par exemple2,3,5,12,13,,14 15,16) et les résultats obtenus par ce système ont été vérifiés par d’autres techniques. Cette méthode peut aussi servir à étudier l’activation des différents récepteurs FcγR humains par des anticorps, comme a été fait pour des anti-viraux anticorps dans le sérum6,7,8 , ou avec des anticorps monoclonaux contre CD20 9.
Puisqu’il s’agit d’un système dans lequel seul le segment extracellulaire du récepteur s’exprime, les résultats obtenus par ce système devraient être complétées par des expériences additionnelles avec les récepteurs endogènes, telles que les analyses de cytotoxicité naturelle récepteurs de cellules des cellules tueuses (NK) pour étudier les interactions avec le NK. En outre, certaines interactions ligand/récepteur ne peuvent aboutir à une sécrétion de mIL-2 par le système de journaliste et pourraient donc être négligées. En outre, comme dans n’importe quelle installation expérimentale, les résultats doivent être vérifiées pour différents paramètres tel que décrit ci-dessus. Ceci est particulièrement important dans les cas où une comparaison des deux conditions est requis (par exemple, l’activation d’un même récepteur de Fc par types d’anticorps). Il est également important de vérifier que la sensibilité d’une interaction ligand-récepteur spécifique est dans la gamme linéaire du système. Dans le cas contraire, cela pourrait conduire à des valeurs de saturation qui peuvent s’opposer à une comparaison valable dans l’ensemble des conditions. Ceci peut être réalisé en utilisant une courbe standard mIL-2 et en générant une courbe dose-réponse avec le ligand testé (dans le cas de saturer les valeurs, les paramètres expérimentaux devraient être modifiées ; par exemple, un plus petit volume de liquide surnageant doit être analysé par ELISA). Une autre limitation possible de ce système est l’utilisation de cellules cibles avec des sécrétions endogènes de mIL-2 (par exemple, les cellules de souris T) qui masquerait la sécrétion IL-2 de cellules de BW. Pour surmonter ces occurrences très inhabituels qui se limitent à des cellules de souris, ce système pourrait être amélioré en utilisant un journaliste différent (p. ex., GFP) qui n’est pas exprimé par les cellules cibles.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Esther Singer pour l’édition de langue. Cette étude a été financée par le Conseil européen de la recherche au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP/2007-2013) / numéro de convention de subvention ERC 320473-BacNK. A été confortée par le je-CORE programme du Comité budgétisation et de la planification et de l’Israel Science Foundation et le je-Core sur la chromatine et l’ARN dans la régulation des gènes, de la fondation de GIF, de la fondation de la famille Lewis, la subvention de professorat ICRF, le Helmholtz Israël grant et la confiance de Rosetrees (tous à O.M.). Cette étude a été également soutenue par la fondation de sciences d’Israël (subvention 502/15), le Kass Medical Research Award et une bourse de recherche de l’Israël société d’hématologie et de la médecine transfusionnelle (au sager). Occre enseigne couronne d’immunologie moléculaire.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |