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Biology

Ein BW-Reporter-System für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

doi: 10.3791/58685 Published: January 7, 2019

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Reporter-System zu etablieren, die verwendet werden können, zu identifizieren und zu quantifizieren-Rezeptor-Ligand-Interaktionen.

Abstract

Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden bilden einen fundamentalen biologischen Prozess. Jedoch direkte Experimente mit Zellen, die den nativen Rezeptor exprimieren und Liganden sind anspruchsvoll, da die Liganden an einen spezifischen Rezeptor möglicherweise unbekannt und experimentelle Verfahren mit dem nativen Liganden können technisch kompliziert sein. Um diese Hindernisse zu lösen, beschreiben wir ein Reporter System um die Bindung und Aktivierung eines spezifischen Rezeptors durch ein Ligand von Interesse zu erkennen. In diesem System Reporter die extrazelluläre Domäne an einen spezifischen Rezeptor ist Maus CD3ζ konjugiert und dieses Chimäre Protein wird dann im BW Mauszellen ausgedrückt. Diese transfizierten Zellen BW können dann mit verschiedenen Zielen (z.B., Zellen oder Antikörper) inkubiert werden. Aktivierung eines transfizierten Rezeptors führt zur Sekretion von Maus Interleukin-2 (mIL-2) die durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) nachgewiesen werden können. Dieser Reporter-System hat die Vorteile der Sensitivität und Spezifität an einen einzigen Rezeptor. Darüber hinaus das Aktivierungsniveau der einen spezifischen Rezeptor quantifiziert werden kann und kann verwendet werden, auch in Fällen, wo die Liganden an den Rezeptor nicht bekannt ist. Dieses System wurde erfolgreich in viele unserer Studien-Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu charakterisieren umgesetzt. Wir haben vor kurzem dieses System die Aktivierung des menschlichen Fcγ Rezeptoren (FcγRs) von verschiedenen monoklonalen Anti-CD20-Antikörper in der klinischen Anwendung studieren beschäftigt.

Introduction

BW-Reporter-System ist eine Technik für das Studium-Rezeptor-Ligand Interaktionen1. Dieses System ist besonders vorteilhaft, wenn die Liganden an einen spezifischen Rezeptor unbekannt ist oder Experimente mit den endogenen Liganden technisch schwierig sind. Es kann auch verwendet werden, für die Bindung von monoklonalen Antikörpern gegen menschliche FcγRs zu studieren. Die Methode basiert auf ein chimäres Protein in Mauszellen BW zum Ausdruck zu bringen. Dieses Chimäre Protein besteht aus der extrazellulären Domäne des Rezeptors des Interesses zu den transmembranen und intrazellulären Domänen der Maus ζ Kette verschmolzen. Bindung der entsprechenden Liganden des Rezeptors führt zur Sekretion von Maus Il-2, die leicht durch ELISA, erkannt werden kann, wie in Abbildung 1dargestellt. Diese Methode ist empfindlich und spezifisch für eine einzelne Rezeptor, einfach zu bedienen, und hoch reproduzierbare. Es kann somit zusätzliche Werkzeuge für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen ergänzen. Zum Beispiel kann verwendet werden, verschiedene Zelllinien für die Anwesenheit eines Liganden für einen spezifischen Rezeptor auf den Bildschirm (auch wenn die Liganden selbst nicht identifiziert wurde) oder die Aktivierung des menschlichen FcγRs durch monoklonale Antikörper oder durch menschliches Serum mit Anti-Virus zu erkennen Antikörper. Obwohl primäre Immunzellen endogenen FcγRs zum Ausdruck bringen, sind sie in der Regel schwierig zu handhaben und in der Regel mehrere Fc-Rezeptoren äußern.

Wir haben dieses System erfolgreich in viele unserer Studien eingesetzt, um Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu charakterisieren. Dazu gehören Hämagglutinin als Liganden des NK Zelle Rezeptors NKp462, Identifizierung von PVR und Nectin-2 als Liganden für Mensch und Maus TIGIT3,4, zu identifizieren und zeigt, dass die Fusobacterium Nucleatum Bakterium bindet und menschliche TIGIT5aktiviert. Darüber hinaus wurden BW-Zellen, die Fc-Rezeptoren express erfolgreich zur antivirale Antikörper im Patienten Sera6,7,8zu erkennen. Insbesondere haben wir vor kurzem BW-Zellen, die menschliche FcγRs um differentielle FcR Aktivierung von Anti-CD20-Antikörper zur Behandlung von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL)9erkennen ausdrücken. Wichtig ist, wurden die Ergebnisse der BW-Reporter-System in komplementären Experimenten validiert.

Protocol

1. Generation ein Plasmid, das drückt die Chimäre konstruieren

Hinweis: Ziel ist es, ein Plasmid zu generieren, die drückt die extrazelluläre Domäne des Rezeptors des Interesses zu den transmembranen und intrazellulären Domänen der Maus CD3ζ Kette (Abb. 2A) verschmolzen.

  1. Rufen Sie die Reihenfolge der extrazellulären Domäne des Rezeptors von Interesse, einschließlich das Signalpeptid ab. Erhalten Sie DNA-Material, die diesen Rezeptor (z. B. cDNA oder ein Plasmid) zum Ausdruck bringen soll.
  2. DNA-Material, das den transmembranen ausdrückt und die intrazellulären Domänen der Maus CD3ζ Kette erhalten (zB., cDNA oder ein Plasmid).
  3. Entwerfen Sie die Sequenz des Fusionsproteins basierend auf der allgemeinen Struktur in Abbildung 2Agezeigt. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Sequenz innerhalb der gleichen Codon Leserahmen. Diese Sequenz wird verwendet, um geeignete Primer zu entwerfen und überprüfen das Endprodukt.
  4. Design zwei PCR-Reaktionen auf jedes der Fragmente von der Fusionsproteinen separat zu verstärken (Abb. 2 b, 2 C)10.
    Hinweis: Die spezifischen Bedingungen für die PCR-Reaktionen (z. B.., Dehnung Zeit und Temperatur Glühen) hängen von der Art der Primer, die für einen spezifischen Rezeptor ausgelegt sind.
    1. Das extrazelluläre Segment des Rezeptors zu verstärken.
      1. Entwerfen Sie eine 5'-Grundierung, die das Signalpeptid des Rezeptors, einer Konsensussequenz Kozak und eine entsprechende Beschränkung Site (Abb. 2 b) gehört.
      2. Entwerfen Sie eine 3'-Primer, die beide Teile des Fusionsproteins (Abb. 2 b) Flanken. Beispielsweise kann dieser 3'-Primer für den ersten Entwurf der letzten 20 Basenpaaren des extrazellulären Segments des Rezeptors und die ersten 9 Basenpaare CD3ζ Segment enthalten.
        Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit zum Hinzufügen einer Einschränkung-Website, der 3'-Primer, da diese Grundierung verwendet wird, um die verschmolzenen Sequenz zu erzeugen, und nicht zur Unterbindung dient.
    2. Verstärken Sie das CD3ζ-Segment.
      1. Entwerfen Sie eine Grundierung 5' die Flanken der beiden Teile des Fusionsproteins (Abbildung 2). Beispielsweise kann für den ersten Entwurf der Primer 5' die letzten 9 Basenpaare der extrazellulären Segment des Rezeptors und die ersten 20 Basenpaaren des Segments CD3ζ enthalten.
        Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit zum Hinzufügen einer Einschränkung Website, der 5'-Primer, da diese Grundierung verwendet wird, um die verschmolzenen Sequenz zu erzeugen, und nicht zur Unterbindung dient.
      2. Entwerfen Sie eine Grundierung 3' Ende der CD3ζ-Sequenz sowie eine entsprechende Beschränkung Site (Abbildung 2) umfasst.
    3. Die Primer-Sequenzen in jedem dieser beiden Reaktionen zu korrigieren, so dass die Anlasstemperatur ähnlich wie bei jedem Paar (beachten Sie das die Grundierung, die Sequenzen der beiden Teile des Fusionsproteins umfasst ist, nur mit einem Teil der Sequenz in jeder Reaktion glüht).
  5. Führen Sie eine zusätzliche PCR, in denen eine Mischung aus der PCR-Produkte der ersten beiden Reaktionen wie die DNA-Vorlage mit dem Primer 5' des Segments extrazelluläre Rezeptor (Schritt 1.4.1.1) und die 3' des Segments CD3ζ (Schritt 1.4.2.2) (Abb. 2D)10 verwendet wird . Diese Reaktion sollte die verschmolzene Schlusssequenz generieren.
  6. Gehen Sie wie gewohnt zum Klonen.
    1. Verbinden Sie das Endprodukt PCR zum Ziel Schnitt Vektor (der Ziel-Vektor ist in der Regel pcDNA3, G418 und Ampicillin-Resistenz ausdrückt).
    2. Verwandeln Sie zuständigen Bakterien11den aufgespaltenen Vektor.
      1. 50 µL der zuständigen Bakterien auf Eis auftauen.
      2. Die Bakterien der aufgespaltenen Vektor hinzu und inkubieren Sie für 20 min auf Eis.
      3. Inkubation bei 42 ° C für 45 s.
      4. Fügen Sie 200 µL LB ohne Antibiotika.
      5. Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln.
      6. Samen auf eine LB-Platte mit den entsprechenden Antibiotika (z.B. Ampicillin-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL).
    3. Sammeln Sie und wachsen Sie mehrere Bakterienkolonien in 5 mL LB (in 15 mL Tuben).
    4. Extrahieren Sie am nächsten Tag Plasmide mit einem Mini-Prep Kit.
    5. Die gen-Einlage mit Restriktionsenzymen zu analysieren.
    6. Folge die entsprechenden Kolonien und überprüfen Sie die Reihenfolge und den Leserahmen (wie in Schritt 1.3).
  7. Verwandeln Sie zuständigen Bakterien11verifizierte Plasmid.
    1. 20 µL der zuständigen Bakterien auf Eis auftauen.
    2. Die Bakterien 1 µL des Plasmids hinzu und inkubieren Sie für 20 min auf Eis.
    3. Inkubation bei 42 ° C für 45 s.
    4. Fügen Sie 200 µL LB ohne Antibiotika.
    5. Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln.
    6. Saatgut auf einem Bakterienwachstum Teller mit den entsprechenden Antibiotika (z.B. Ampicillin-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL).
  8. Wachsen Sie am nächsten Tag eine bakterielle Kolonie in einem großen LB-Behälter mit 0,1 mg/mL Ampicillin (~ 250 mL).
  9. Durchführen Sie am nächsten Tag Maxi Prep gemäß den spezifischen Anweisungen vom Kit.
    Hinweis: Für die Elektroporation-Verfahren ist eine große Menge von Plasmid erforderlich, wie unten aufgeführt.

2. die Transfektion von Plasmid, das das chimäres Protein in BW Zellen ausdrückt

Hinweis: Verschiedene Methoden können auch zur Transfektion eingesetzt werden (zB., durch Lentivirale Infektion). Führen Sie bevor die Elektroporation Ethanol Ausfällung der DNA wie unten beschrieben. Die nächsten Schritte erfordern sterile Bedingungen.

  1. Am Vortag vorbereiten Elektroporation der BW5147 Zellen ("BW"). Platte 10 Platten (10 cm) mit 10 mL von 100.000 BW5147 Zellen/mL (d. h. insgesamt 10 x 106 Zellen) mit RPMI ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 1 % Natrium Pyruvat, 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Penicillin-Streptomycin ("komplette Mittel").
  2. 100 µg pcDNA3-Plasmid, das Schmelzverfahren Protein in einer 1,5-2 mL Tube ausdrückt und fügen Sie 3 M Natriumacetat bei pH 5,3-5,5 hinzu. Das Volumen der Natriumacetat entsprechen 0,1 (10 %) des Volumens von 100 µg Plasmid; titrieren den pH-Wert des Natriumacetat mit dem pH-Meter durch Zugabe von NaOH oder HCl.
  3. Fügen Sie 2,5 Bände von 100 % Ethanol, die Mischung aus dem Plasmid und das Natriumacetat, wie in Schritt 2.2 (2.5 x das Gesamtvolumen des Plasmids und Natrium-Acetat) beschrieben. Inkubation über Nacht bei-20 ° C oder 2 h bei 70 ° C.
  4. 2.4. 24 h nach der BW-Zellen überzogen haben, sammeln Sie alle BW Zellen (~ 100 mL) in 2-50 mL-Tuben. Die Zellen für 5 min bei 515 X g Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  5. Wieder aussetzen Sie das Pellet aus beiden Rohren in 25 mL RPMI - in einer einzigen 50 mL Tube. Zum Beispiel wieder auszusetzen Sie das Pellet eine Röhre mit 25 mL RPMI - und dann verwenden Sie diese Flüssigkeit, um die Flüssigkeit in der anderen 50 mL Tube neu auszusetzen, so dass insgesamt Pellet aus dem BW-Zellen wieder in 25 mL Medium in einem einzigen Rohr aufgehängt ist.
    Hinweis: Das Medium sollte ohne Zusätze, da das Serum mit Elektroporation stören könnten.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder für 5 min bei 515 X g. Wieder aussetzen Sie das Pellet in 1 mL RPMI, und übertragen Sie den Inhalt auf einem 0,4 cm-Küvetten auf Eis.
  7. Zentrifugieren Sie das Plasmid, das Ethanol Niederschlag (Schritt 2.3) für 30 min bei 16.000 x g und 4 ° c unterzogen
  8. Einmal waschen Sie, mit 1 mL 70 % igem Ethanol und Zentrifuge für weitere 20 min bei 16.000 x g und 4 ° C (um das Salz zu waschen).
  9. Entfernen Sie das Ethanol und die Pellets leicht trocknen lassen (d. h. in ein offenes Rohr in der Gewebekultur-Haube). Wieder aussetzen Sie das Pellet mit 100 µL RPMI-vorher auf 60 ° c erhitzt
  10. Die Zellen in der Küvette neu suspendierten Plasmid (Schritt 2.8) hinzu und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  11. Electroporate der Zellen bei 0,23 kV, 250 Rechtsfähigkeit. Dies dauert ca. 4 ms.
  12. Übertragen Sie die elektroporiert Zellen auf eine 50 mL-Tube, fügen Sie 50 mL des kompletten Medium und Zentrifuge für 5 min in 515 X g.
  13. Verwerfen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit 50 mL des kompletten Medium.
  14. Platte elektroporiert Zellen in Kultur 24-Well-Gerichte (1 mL pro Bohrloch, für eine Gesamtmenge von ~ 50 Brunnen) und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h.
  15. Wählen Sie die transfizierten Zellen mit Antibiotika. Nach 48 h fügen Sie 1 mL der kompletten Medium ergänzt mit 10 mg/mL G418 in jede Vertiefung (in diesem Stadium ist das Endvolumen in jedem gut 2 mL und die letztendliche Konzentration an G418 in jedem ist gut 5 mg/mL).
    Hinweis: Wenn das Plasmid verschiedene Antibiotika-Resistenz enthält, bestimmen Sie die antibiotische Konzentration erforderlich, um die untransfected BW-Zellen vor diesem Schritt zu töten.
  16. Alle 48 h sorgfältig entsorgen 1 mL des oberen Bandes von jedem Bohrloch ohne rühren das Medium in den Brunnen (BW Zellen neigen dazu, an der Unterseite des Brunnens werden). Fügen Sie komplette Medium mit 5 mg/mL G418 in jede Vertiefung ergänzt, so dass das Endvolumen in jedem Bohrloch wieder 2 mL ist.
  17. Prüfen Sie regelmäßig die Kultur-Platten für das Zellwachstum in alle Wells.
    Hinweis: Eine Änderung in der Farbe des Mediums zu gelb kann helfen, wachsende Zellen zu identifizieren; am Anfang des Mediums werden jedoch gelb wegen der G418 selbst. Positive Vertiefungen (Brunnen mit wachsenden Zellen) zu identifizieren. Diese Vertiefungen G418 resistent sind und daher Fusionsproteins ausdrücken sollen. Dieser Vorgang dauert in der Regel ca. 3 Wochen.

3. Überprüfung des Ausdrucks der transfizierten Rezeptor in Zellen in der positiven Vertiefungen.

  1. Fleck transfected BW-Zellen mit einem spezifischen Antikörper gegen den Rezeptor der transfizierten war.
  2. Vergleichen Sie die Expression des Rezeptors durch Durchflusszytometrie zum Ausdruck der Kontrollzellen (untransfected BW-Zellen).
  3. Nach Überprüfung von einem oder mehreren Brunnen in Kultur wachsen Zellen sofort für experimentelle Zwecke verwenden oder Einfrieren für zukünftige Anwendungen.
  4. Der Ausdruck des transfizierten Rezeptors vor der Ausführung eines neuen Experiments zu überprüfen. Nach ein paar Wochen des Wachstums, die Zellen mit G418 mit einem stabilen Rezeptor-Expression kann G418 aus dem Kulturmedium weggelassen werden.

(4) Inkubation der BW transfizierten Zellen mit Ziele

Hinweis: Wenn Sie die transfizierten Zellen BW zum ersten Mal verwenden, ist es vorzuziehen, testen sie auf Ziele, die eine bekannte Liganden des Rezeptors von Interesse zum Ausdruck bringen oder auf Platte-gebundenen Antikörper spezifisch gegen den Rezeptor von Interesse (Vernetzung Experimente; siehe unten, Abschnitt 4.2.1.3).

  1. Teilen Sie vorzugsweise die BW Zellen 24 h vor dem Experiment (z. B. durch Hinzufügen von 10 mL des kompletten Medium bis 2 mL der Zellen in der Kultur in einer neuen Kultur-Platte 10 cm).
  2. Inkubieren Sie transfizierten Zellen BW mit ihren Zielen. Führen Sie das Experiment gleichzeitig auf Kontrollzellen BW, die ein leerer Vektor (oder elterliche BW Zellen) ausdrücken. 96F Platten sind zu bevorzugen (aber 96U Platten können auch verwendet werden). Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung. Alle Zellen in das komplette Medium aussetzen.
    1. Bereiten Sie die Ziele. Der Typ des Ziels kann variiert in Abhängigkeit von der Zielsetzung, und Zellen, Zellen, die mit Antikörpern oder Antikörper allein vor inkubiert worden sind. Dieses System diente auch als Ziele5mit Bakterien.
      1. Wenn die Ziele Zellen (d. h. Zelllinien) teilen sind, bestrahlen sie bei 6.000 rad vor dem Test. Statt 50.000 von den Zielzellen in einem einzigen Brunnen einer 96 Platte (in einem Volumen von 100 µL).
      2. Für Experimente mit Antikörpern und BW-Zellen, die menschliche FcγRs ausdrücken inkubieren der Zielzellen mit einem Antikörper auf dem Eis in einer 96-well-Platte (zum Beispiel, 50 µL der Zielzellen und 50 µL des Antikörpers; verschiedene Antikörper Dosen getestet werden können).
      3. Wenn Antikörper allein als Ziele (Vernetzung Experimente) verwenden, sollten sie die Platte gebunden sein. Zu diesem Zweck zunächst inkubieren Sie die Antikörper in einem kompletten Medium in einer 96F Platte für 1-2 h bei 37 ° C und 5 % CO2 (eine typische Anfangsdosis beträgt 0,5 μg einen spezifischen Antikörper in 50 μL). Waschen Sie die Platte um ungebundenen Antikörper zu entfernen.
        Hinweis: In diesem Fall wird eine 96F Platte Bindung des Antikörpers an der Platte ermöglichen der nach Zugabe von den transfizierten Zellen BW zur Aktivierung des Rezeptors transfizierten führt.
    2. Die BW-Zellen (Effektorzellen) hinzufügen. Platzieren Sie 50.000 BW Zellen in einem einzigen Brunnen einer 96 Platte (in einem Volumen von 100 µL).
    3. Füllen Sie die Lautstärke in jede Vertiefung zu 200 µL bei Bedarf.
    4. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h (dieser Zeitraum kann kalibriert werden).
  3. Nach 48 h, frieren die Platten bei-20 ° C und Tauwetter vor ELISA oder sofort für ELISA (siehe nächsten Schritt).

5. ELISA

  1. Mantel einer ELISA-Platte mit einem Anti-Maus-IL-2-Antikörper (anti-mIL-2). Legen Sie 0,05 µg anti-mIL-2 in einem Volumen von 50 µL 1 X PBS pro Bohrloch. Inkubieren Sie die beschichtete ELISA-Platte mit dem anti-mIL-2-Antikörper bei 4 ° C über Nacht oder bei 37 ° C für 2 h.
    Hinweis: Um ELISA direkt nach der Inkubationsschritt durchzuführen, sollten die ELISA-Platte 24 h vor dem Ende der Inkubationszeit der BW Zellen beschichtet werden.
  2. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in der ELISA-Platte und fügen Sie eine blockierende Lösung (200 µL pro Well), bestehend aus 1 X PBS und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) ist. Inkubieren Sie die ELISA-Platte für 2 h bei Raumtemperatur.
  3. Waschen Sie die ELISA-Platte dreimal mit PBS-Tween Lösung 0,05 % (d. h. 0,5 mL Tween-20 in 1 Liter 1 X PBS).
  4. Nehmen Sie die 96 Platte hat die BW-Zellen, die mit ihren Zielen (4.3) inkubiert wurden. Wenn die Platte gefroren war, tauen Sie es komplett (zB. durch kurze Inkubation bei 37 ° C). Zentrifugieren der 96 Platte (5 min, 515 X g) und 100 µL des Überstands in jede Vertiefung sorgfältig auf vorbeschichtete und blockierte ELISA-Platte übertragen.
    Hinweis: Der Überstand sollten von den Seiten von jedem Bohrloch zu vermeiden, die Zellen gewonnen werden.
  5. Falls gewünscht, fügen Sie rekombinante mIL-2 mit definierten Konzentrationen hinzu, eine der leeren Zeilen der beschichteten ELISA-Platte auf eine Standardkurve von mIL-2 zu generieren. Zum Beispiel eine mIL-2 Konzentration von 2.500 Pg/mL ab und dann in jede anschließende Vertiefung um 50 % zu verringern; Fügen Sie keine mIL-2 bis zum letzten gut.
  6. Inkubieren Sie die ELISA-Platte bei 4 ° C über Nacht oder bei 37 ° C für 2 h.
  7. Waschen Sie die ELISA-Platte viermal mit PBS-Tween.
  8. Der ELISA-Platte Biotin-Anti-Maus-IL-2 hinzufügen. Verwenden Sie eine Konzentration von 1 µg Antikörper in 1 mL 1 X PBS mit 1 % BSA und teilen in 100 µL pro Bohrloch.
  9. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
  10. Waschen Sie die ELISA-Platte sechsmal mit PBS-Tween.
  11. HRP-konjugierten Streptavidin hinzufügen. Verwenden Sie eine Konzentration von 1 µL Streptavidin in 1 mL PBSX1 mit 1 % BSA und teilen Sie es in 100 µL pro Bohrloch.
  12. Bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
  13. Waschen Sie die ELISA-Platte sechsmal mit PBS-Tween.
  14. 100 µL pro Bohrloch TMB-Substrat-Lösung hinzufügen. Füllen Sie diese Bühne schnell um Unterschiede zwischen den Brunnen wegen Verzögerungen beim TMB hinzufügen zu minimieren.
  15. Lesen Sie die ELISA-Platte mit einem ELISA-Platte-Leser bei 650 nm (die Lesung kann wiederholt, wenn das Signal schwach ist).

Representative Results

Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse eines Experiments mit einem BW-Reporter-System. In diesem Experiment wurden CLL-Zellen bereits mit verschiedenen Anti-CD20-Antikörper (Rituximab und Obinutuzumab) inkubiert und dann gemeinsam mit transfizierten BW-Zellen die CD16a CD3ζ ausdrücken inkubiert. In unserer Studie9wurden ähnliche Experimente durchgeführt. Abbildung 3A zeigt ein Bild aus einer rohen ELISA-Platte wo die Farbintensität zu einer Konzentration von mIL-2 entspricht. Der Versuch wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Dieses Experiment enthalten mehrere Steuerelemente: CLL-Zellen inkubiert mit elterlichen untransfected BW Zellen (obere Reihe) und CLL-Zellen inkubiert, mit BW-Zellen die CD16a CD3ζ ausdrücken, aber ohne einen Antikörper oder mit einem Steuerelement Antikörper (sechs Brunnen in der zweiten Zeile auf der linken Seite) . Die Inkubation von BW-Zellen, die CD16 mit CLL-Zellen ausgedrückt, die vorab mit Anti-CD20-Antikörper inkubiert wurden induziert eine bedeutende Sekretion von mIL-2 im Vergleich zu der mIL-2-Ebene die Kontroll-Vertiefungen. Wichtig ist, aktiviert Vorinkubation der CLL-Zellen mit dem Anti-CD20-Obinutuzumab CD16 stärker als Rituximab, ein bekanntes zu finden, die von unserem System zusammengefasst wurde. Die letzte Zeile zeigt absteigend vorab definierte Konzentrationen von rekombinanten mIL-2 (ohne den Zusatz von Zellen). Die Rechte gut in der letzten Zeile keinen mIL-2 und stellt die Hintergrund-Lesung, die ähnlich wie die Kontroll-Vertiefungen erscheint. Abbildung 3 b zeigt die Quantifizierung der Ergebnisse der ELISA-Platte in Abbildung 3Agezeigt. Die optische Dichte (OD) Ebenen wurden in mIL-2 Konzentrationen anhand der Standardkurve mit rekombinanten mIL-2 umgewandelt. Abbildung 3 zeigt eine Dosis-Antwort-Experiment wo verschiedene Dosen von Antikörpern waren bereits mit CLL-Zellen inkubiert und dann mit BW-Zellen mit dem Ausdruck CD16 inkubiert.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der das Reporter-BW. BW5147 Zellen sind stabil transfizierten mit den extrazellulären Teil von verschiedenen Rezeptoren an die transmembranen und cytoplasmatischen Domänen der Maus CD3ζ Kette (Chimäre Recptor-CD3ζ) verschmolzen. Aktivierung von einem spezifischen Rezeptor-CD3ζ durch ein Ligand ergibt eine Sekretion von mIL-2, die durch ELISA nachgewiesen werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: die Struktur der Chimären-Rezeptor-CD3ζ und das Design der PCR Zündkapseln. (A) allgemeine Struktur einer extrazellulären Rezeptor verschmolzen zu den transmembranen und intrazellulären Domänen der Maus CD3ζ. (B) die extrazelluläre Domäne des Rezeptors wurde mit einem 3'-Primer verstärkt die Nukleotide der CD3ζ ebenfalls enthalten. (C) die intrazellulären und transmembranen Domänen CD3ζ wurden 5' Primer verstärkt, die auch Rezeptor Nukleotide enthalten. (D) in der endgültigen PCR-Reaktion wurden beide Segmente, die überlappende Sequenzen, wie die DNA-Vorlage verwendet. In alle Abbildung Platten sind verschiedene Protein Domains farblich gekennzeichnet und verpackt in blauen Rechtecke (CD3ζ Sequenz) und rote Rechtecke (die Rezeptor-Sequenz). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Abbildung des Endproduktes das Reporter-BW. (A, B, C) CLL-Zellen wurden vorab inkubierten mit oder ohne zwei Anti-CD20-Antikörper (Rituximab und Obinutuzumab) oder ein Steuerelement-Antikörper. Danach wurden die Antikörper gebundene Zellen inkubiert, mit elterlichen BW oder BW-Zellen die CD16a CD3ζ ausdrücken. Das Niveau der mIL-2 im Überstand wurde mittels ELISA bestimmt. (A) ein Bild von einem rohen ELISA-Platte. Farbintensität gibt die Konzentration der mIL-2 im Überstand. Der Versuch wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die untere Zeile zeigt das ELISA Auslesen in abnehmender Konzentration von rekombinanten mIL-2 die in der gleichen Platte analysiert wurden. (B) Quantifizierung des ELISA lesen in (A) dargestellt. Die mIL-2 Ebenen wurden mit einer Standardkurve von Mil-2 berechnet. (C) eine Dosis Antwort Experiment, wo verschiedene Dosen von Antikörpern waren bereits mit CLL-Zellen inkubiert und dann mit BW-Zellen mit dem Ausdruck CD16a CD3ζ inkubiert. , P < 0,001; Der Student t -Test (B) oder ANOVA mit Mehrfachvergleiche (C). Das einzige Vergleich (c) das war nicht signifikant unterschiedlich war für Rituximab und die Kontrolle Ab der ersten Konzentration (0,01 µg/mL). Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der Triplicates. Ähnliche Experimente wurden im Rahmen eines unserer jüngsten Studie9durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erzeugung von einem Reporter System um Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen (siehe eine Kurzform dieses Protokolls in1). Das Protokoll besteht aus drei Hauptteilen: Klonen von ein chimäres Protein, das die extrazelluläre Domäne an einen spezifischen Rezeptor enthält verschmolzen mit der intrazellulären Domäne CD3ζ, Transfektion von ein Plasmid, das Schmelzverfahren Protein zu BW Zellen ausdrückt (z.B. , durch Elektroporation), und quantitativen Nachweis der Maus IL-2 von ELISA. Das Endprodukt eines jeden dieser Teile unabhängig überprüft werden: der Klonvorgang sollte überprüft werden, durch die vollständige Sequenzierung des Fusionsproteins in das Ziel-Plasmid, die Transfektion von BW-Zellen überprüft werden, durch die Untersuchung des Ausdrucks der Rezeptor von Interesse in den BW-Zellen (z. B.durch Durchflusszytometrie) und ELISA-Verfahren sollte überprüft werden, durch allgemeine Positivkontrollen (z.B. rekombinante mIL-2) sowie mit bestimmten Steuerelementen für die transfizierten Zellen BW; d. h., Ziele, die Ausdruck ein bekannten Liganden des Rezeptors von Interesse (z.B. Zellen, dass ausdrückliche CD48 als Positivkontrolle verwendet werden kann, für BW-Zellen, die die NK ausdrücken Rezeptor 2B4 Zelle). Zum Beispiel der Klonvorgang erfolgreich sein kann, aber Fusionsproteins wird nicht durch die BW-Zellen ausgedrückt. In diesem Fall sollte die Elektroporation wiederholt werden. Alternativ, wenn kein über die Hintergrundkonzentration der ELISA-Platte Signal (vor allem für die Positivkontrollen) BW transfizierten Zellen können nicht gelungen, den Rezeptor exprimieren (oder der Ausdruck verloren gegangen) oder ein technisches Problem aufgetreten während die ELISA-Verfahren.

Mehrere Änderungen können zu diesem Protokoll erfolgen, unter Wahrung der allgemeinen Grundsätze des Verfahrens. Diese Änderungen umfassen den Vektor verwendet, um auszudrücken Schmelzverfahren Protein, die Methode für transfecting das Plasmid BW Zellen und spezifische Parameter in Bezug auf die Inkubation und ELISA wie z. B. die Art des Ziels (z. B. Zellen, Antikörper usw.) , Anzahl der Zellen oder der Antikörperkonzentration gegebenenfalls (wir verwenden 50.000 Zellen pro Brunnen und eine Anfangsdosis von 0,5 µg/Well Antikörper), Inkubationszeit (wir verwenden eine Inkubationszeit von 48 h) und der Überstand Volumen, der an der ELISA-Platte übertragen wird.

Diese Methode ist empfindlich, spezifische und leicht quantifiziert werden kann. Es ist ideal für das screening auf das Vorhandensein von Liganden für bestimmte Rezeptoren (vor allem, wenn die Liganden selbst nicht erkannt worden ist). Nach der Vorbereitung transfizierten BW-Zellen, die einen spezifischen Rezeptor exprimieren, können diese Zellen eingefroren und bei Bedarf für weitere Experimente verwendet. Wir und andere haben dieses System erfolgreich in früheren Studien eingesetzt, Rezeptor-Ligand-Interaktionen (z. B.2,3,5,12,13,14 zu erkunden 15,16) und die Ergebnisse dieses System durch andere Techniken überprüft worden. Diese Methode kann auch verwendet werden, die Aktivierung der verschiedenen menschlichen FcγR Rezeptoren zu studieren durch Antikörper, wie Anti-Virus-Antikörper im Serum6,7,8 oder mit monoklonalen Antikörpern gegen CD20 9.

Da dies ein Reporter-System in der nur das extrazelluläre Segment des Rezeptors ausgedrückt wird ist, sollten die Erkenntnisse dieses System durch weitere Experimente mit dem endogenen Rezeptor wie Zytotoxizität Assays mit natürlichen ergänzt werden Killerzellen (NK) studieren Interaktionen mit NK Zell-Rezeptoren. Darüber hinaus bestimmte Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen können nicht in einem mIL-2-Sekretion durch das Reporter-System führen, und daher übersehen werden könnten. Darüber hinaus sollte wie eine Versuchsanordnung, die Ergebnisse für verschiedene Parameter überprüft werden, wie oben beschrieben. Dies ist besonders wichtig in Fällen, wo ein Vergleich von zwei Bedingungen erforderlich (z.B.Aktivierung des gleichen Fc-Rezeptors durch verschiedene Antikörper). Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Empfindlichkeit einer bestimmten Ligand-Rezeptor-Interaktion innerhalb des linearen Bereichs des Systems ist. Ansonsten könnte dies zu Sättigungswerte führen, einen gültigen Vergleich über Bedingungen ausschließen kann. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung einer Standardkurve mIL-2 sowie durch die Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve mit dem getesteten Liganden (im Falle von Werten zu sättigen, die experimentellen Parameter geändert werden sollte; z.B.ein kleineres Volumen Überstand sollte durch ELISA analysiert werden). Eine weitere mögliche Einschränkung dieses Systems ist die Verwendung von Zielzellen mit körpereigenen Sekreten von mIL-2 (z. B.Maus-T-Zellen), die die IL-2 Sekretion von BW Zellen verdecken würde. Um diese sehr ungewöhnliche Vorkommnisse zu überwinden, die auf Mauszellen beschränkt sind, könnte dieser Reporter-System verbessert werden, mithilfe von verschiedenen Reporter (z. B.GFP) die nicht zum Ausdruck kommt von den Zielzellen.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Esther Singer für die Bearbeitung von Sprache. Diese Studie wurde unterstützt durch den Europäischen Forschungsrat unter dem siebten Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC-Grant Agreement Nummer 320473-BacNK. Weiterer Unterstützung wurde zur Verfügung gestellt von der I-CORE Programm für die Planung und Budgetierung Ausschuss und Israel Science Foundation und I-Core auf Chromatin und RNA in Genregulation, die GIF-Stiftung, die Lewis-Familienstiftung ICRF Professur Grant, die Helmholtz-Israel Grant und das Rosetrees Vertrauen (alle O.M). Diese Studie wurde auch von der Israel Science Foundation (Grant 502/15), der Kass Medical Research Award und ein Forschungsstipendium aus Israel Gesellschaft für Hämatologie und Transfusionsmedizin (um S.E) unterstützt. O.M(X,Y)"ist ein Krone-Professor für molekulare Immunologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit Bioneer K-3030
Anti-mouse IL-2 BioLegend 503702
Biotin anti-mouse IL-2 BioLegend 503804
ELISA plates De-groot 60-655061
Fetal Bovine Serum Sigma F7524-500ml
G418 Mercury MBS3458105GM
Gene Pulser II Bio-Rad 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-Glutamine Biological industry 03-020-1B
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Biological industry 01-340-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological industry 03-031-1B
peroxidase streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-030-084
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit ThermoFisher Scientific K210016
RPMI-1640 Medium Biological industry 30-2001
Sodium Pyruvate Biological industry 03-042-1B
TMB SouthernBiothech 0410-01

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References

  1. Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
  2. Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409, (6823), 1055-1060 (2001).
  3. Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (42), 17858-17863 (2009).
  4. Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. (2013).
  5. Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42, (2), 344-355 (2015).
  6. Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387, (1-2), 21-35 (2013).
  7. Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205, (5), 409-424 (2016).
  8. Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7, (1), 6054 (2017).
  9. Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7, (6), e1428158 (2018).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  11. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  12. Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91, (19), (2017).
  13. Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195, (8), 3959-3969 (2015).
  14. Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38, (6), 1223-1235 (2013).
  15. Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11, (2), 121-128 (2010).
  16. Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110, (7), 943-953 (2002).
Ein BW-Reporter-System für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
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Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).More

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).

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