इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक रिपोर्टर प्रणाली है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित करने के लिए और रिसेप्टर ligand बातचीत ।
रिसेप्टर्स और लाइगैंडों के बीच बातचीत एक मौलिक जैविक प्रक्रिया का गठन. हालांकि, कोशिकाओं है कि देशी रिसेप्टर और ligand व्यक्त के साथ प्रत्यक्ष प्रयोगों के बाद से एक विशिष्ट रिसेप्टर के ligand को चुनौती दे रहे हैं अज्ञात हो सकता है और देशी ligand के साथ प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं तकनीकी रूप से जटिल हो सकता है. इन बाधाओं को हल करने के लिए, हम एक रिपोर्टर प्रणाली का वर्णन करने के लिए एक ligand के द्वारा एक विशिष्ट रिसेप्टर के बंधन और सक्रियण का पता लगाने के लिए ब्याज । इस रिपोर्टर प्रणाली में, एक विशिष्ट रिसेप्टर के extracellular डोमेन माउस CD3ζ करने के लिए संयुग्मित है और इस chimeric प्रोटीन तो माउस BW कोशिकाओं में व्यक्त की है. इन transfected BW कोशिकाओं को तो अलग लक्ष्य (जैसे, कोशिकाओं या एंटीबॉडी) के साथ मशीन हो सकता है । एक transfected रिसेप्टर के सक्रियकरण माउस interleukin-2 (मिल-2) जो एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पता लगाया जा सकता है के स्राव की ओर जाता है । इस रिपोर्टर प्रणाली के फायदे के लिए किया जा रहा है संवेदनशील और एक एकल रिसेप्टर के लिए विशिष्ट. इसके अलावा, एक विशिष्ट रिसेप्टर के सक्रियकरण स्तर आसानी से quantified जा सकता है और भी मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां रिसेप्टर के ligand अज्ञात है. इस प्रणाली को हमारे अध्ययन के कई में सफलतापूर्वक लागू किया गया है रिसेप्टर ligand बातचीत की विशेषता है । हम हाल ही में नैदानिक उपयोग में विभिन्न मोनोक्लोनल विरोधी CD20 एंटीबॉडी द्वारा मानव Fcγ रिसेप्टर्स (FcγRs) के सक्रियण का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली को नियोजित किया है.
BW रिपोर्टर प्रणाली रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक है-ligand बातचीत1. यह प्रणाली विशेष रूप से लाभप्रद है जब एक विशिष्ट रिसेप्टर के ligand अज्ञात है या अंतर्जात ligand के साथ प्रयोग तकनीकी रूप से मुश्किल हैं. यह भी मानव FcγRs के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बंधन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि माउस BW कोशिकाओं में एक chimeric प्रोटीन व्यक्त करने पर आधारित है । इस chimeric प्रोटीन ब्याज की रिसेप्टर के extracellular डोमेन से बना है transmembrane और माउस ζ श्रृंखला के intracellular डोमेन से जुड़े । उचित लाइगैंडों रिसेप्टर की बाध्यकारी माउस IL-2 के स्राव की ओर जाता है, जो आसानी से एलिसा द्वारा पता लगाया जा सकता है, के रूप में चित्र 1में सचित्र । इस विधि संवेदनशील और एक व्यक्ति रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है, संचालित करने के लिए आसान है, और अत्यधिक reproducible. यह इस प्रकार रिसेप्टर-ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त उपकरण पूरक कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यह एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए एक ligand की उपस्थिति के लिए कई सेल लाइनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (भले ही ligand खुद को पहचान नहीं किया गया है) या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मानव FcγRs के सक्रियण का पता लगाने या एंटी वायरल युक्त मानव सीरम द्वारा एंटीबॉडी. हालांकि प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं अंतर्जात FcγRs एक्सप्रेस, वे आम तौर पर संभालना मुश्किल है और आमतौर पर कई एफसी रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं ।
हम अपने अध्ययन के कई में सफलतापूर्वक इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है रिसेप्टर ligand बातचीत की विशेषता । ये NK सेल रिसेप्टर NKp462के ligand के रूप में haemagglutinin की पहचान, पीवीआर और nectin-2 मानव और माउस लाइगैंडों3,4के लिए TIGIT के रूप में, और दिखा रहा है कि fusobacterium nucleatum जीवाणु बांधों की पहचान शामिल है और सक्रिय करता है मानव TIGIT5. इसके अलावा, BW कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस एफसी रिसेप्टर्स सफलतापूर्वक रोगियों के सीरा6,7,8में विरोधी वायरल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, हम हाल ही में BW कोशिकाओं है कि मानव FcγRs विरोधी CD20 एंटीबॉडी क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL)9के उपचार के लिए इस्तेमाल किया के अंतर FcR सक्रियण का पता लगाने एक्सप्रेस की स्थापना की । महत्वपूर्ण बात यह है कि BW रिपोर्टर प्रणाली के परिणामों को पूरक प्रयोगों में मान्य किया गया है.
यहां हम एक रिपोर्टर प्रणाली के लिए रिसेप्टर ligand बातचीत की जांच पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (1में इस प्रोटोकॉल के एक संक्षिप्त रूप देखें) । प्रोटोकॉल तीन मुख्य भागों से बना है: एक chimeric प्रोटीन की क्लोनिंग, जो CD3ζ के intracellular डोमेन से जुड़े एक विशिष्ट रिसेप्टर के extracellular डोमेन भी शामिल है, एक अभिकर्मक के प्लाज्मिड कि BW कोशिकाओं को फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त (उदा , electroporation द्वारा), और एलिसा द्वारा माउस इल-2 का मात्रात्मक पता लगाना । इन भागों में से प्रत्येक के अंतिम उत्पाद स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए: क्लोनिंग की प्रक्रिया के लक्ष्य प्लाज्मिड में फ्यूजन प्रोटीन का पूरा अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए, BW कोशिकाओं के अभिकर्मक की अभिव्यक्ति की जांच करके सत्यापित किया जाना चाहिए BW कोशिकाओं में रुचि के रिसेप्टर (जैसे, प्रवाह cytometry द्वारा), और एलिसा प्रक्रिया सामांय सकारात्मक नियंत्रण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए (जैसे, रिकॉमबिनेंट मिल-2) के रूप में अच्छी तरह के रूप में transfected BW कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नियंत्रण के साथ; यानी, लक्ष्य है कि ब्याज की रिसेप्टर की एक ज्ञात ligand व्यक्त (जैसे, कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस CD48 BW कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस NK सेल रिसेप्टर 2B4 के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) । उदाहरण के लिए, क्लोनिंग प्रक्रिया सफल हो सकती है, लेकिन फ्यूजन प्रोटीन BW कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं किया जाता है । इस मामले में, electroporation दोहराया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, यदि एलिसा प्लेट की पृष्ठभूमि के स्तर के ऊपर कोई संकेत नहीं है (विशेष रूप से सकारात्मक नियंत्रण के लिए) transfected BW कोशिकाओं रिसेप्टर को व्यक्त करने में विफल हो सकता है (या अभिव्यक्ति खो गया है) या एक तकनीकी समस्या के दौरान हुई हो सकती है एलिसा प्रक्रिया ।
इस प्रक्रिया के सामांय सिद्धांतों के संरक्षण, जबकि कई संशोधनों को इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है । इन संशोधनों में शामिल है वेक्टर फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, transfecting के लिए विधि BW कोशिकाओं और विशिष्ट इस तरह के लक्ष्य के प्रकार के रूप में और एलिसा मशीन से संबंधित मानकों के लिए प्लाज्मिड (जैसे, कोशिकाओं, एंटीबॉडी, आदि) , लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या या एंटीबॉडी एकाग्रता अगर प्रासंगिक (हम अच्छी तरह से प्रति ५०,००० कोशिकाओं का उपयोग करें और ०.५ µ जी की एक एंटीबॉडी शुरू खुराक/अच्छी तरह से), मशीन समय (हम ४८ एच की एक मशीन समय का उपयोग करें) और supernatant मात्रा जो एलिसा थाली को हस्तांतरित कर रहा है ।
यह विधि संवेदनशील है, विशिष्ट है और आसानी से quantified जा सकता है । यह विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए लाइगैंडों की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है (खासकर अगर ligand ही मांयता प्राप्त नहीं किया गया है) । transfected BW कोशिकाओं है कि एक विशिष्ट रिसेप्टर एक्सप्रेस तैयार करने के बाद, इन कोशिकाओं को जमे हुए और उपयोग किया जा सकता है जब अतिरिक्त प्रयोगों के लिए की जरूरत. हम और दूसरों को इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक पिछले अध्ययनों में रिसेप्टर ligand बातचीत का पता लगाने के लिए (उदाहरण के लिए2,3,5,12,13,14 ,15,16) और इस प्रणाली द्वारा प्राप्त परिणामों के अंय तकनीकों द्वारा सत्यापित किया गया है । इस विधि भी एंटीबॉडी द्वारा विभिन्न मानव FcγR रिसेप्टर्स के सक्रियकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में विरोधी वायरल एंटीबॉडी के लिए किया गया है सीरम6,7,8 या CD20 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 9.
चूंकि यह एक रिपोर्टर प्रणाली है जिसमें केवल रिसेप्टर के extracellular खंड व्यक्त किया जाता है, इस प्रणाली द्वारा प्राप्त निष्कर्षों प्राकृतिक साथ cytotoxicity परख के रूप में अंतर्जात रिसेप्टर, के साथ अतिरिक्त प्रयोगों द्वारा पूरित किया जाना चाहिए खूनी (NK) कोशिकाओं NK सेल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, कुछ ligand/रिसेप्टर बातचीत एक लाख-2 रिपोर्टर प्रणाली द्वारा स्राव में परिणाम नहीं हो सकता है, और इसलिए अनदेखी की जा सकती है । इसके अलावा, के रूप में किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप में, परिणाम के रूप में ऊपर वर्णित विभिंन मापदंडों के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए । यह मामलों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां दो शर्तों की तुलना की आवश्यकता है (जैसे, अलग एंटीबॉडी द्वारा ही एफसी रिसेप्टर के सक्रियकरण). यह भी सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक विशिष्ट ligand-रिसेप्टर बातचीत की संवेदनशीलता प्रणाली के रेखीय रेंज के भीतर है । अंयथा यह संतृप्ति मूल्यों के लिए नेतृत्व कर सकते है जो शर्तों के पार एक वैध तुलना बाधा सकता है । यह एक लाख का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है-2 मानक वक्र के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक खुराक उत्पादन द्वारा परीक्षण ligand के साथ प्रतिक्रिया वक्र (मूल्यों संतृप्ति के मामले में, प्रयोगात्मक मापदंडों संशोधित किया जाना चाहिए; उदाहरणके लिए, supernatant की एक छोटी मात्रा एलिसा द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए) । इस प्रणाली की एक और संभव सीमा मिल-2 के अंतर्जात स्राव के साथ लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग है (जैसे, माउस टी कोशिकाओं) जो BW कोशिकाओं के आईएल-2 स्राव मुखौटा होगा । इन अत्यधिक असामांय घटनाओं जो माउस कोशिकाओं तक सीमित है पर काबू पाने के लिए, इस रिपोर्टर प्रणाली एक अलग रिपोर्टर (जैसे, GFP) जो लक्षित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं है का उपयोग करके सुधारा जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक भाषा संपादन के लिए एस्तेर गायक धंयवाद । यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP/2007-2013)/ईआरसी अनुदान समझौते संख्या ३२०४७३-BacNK के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद् द्वारा इस अध्ययन का समर्थन किया गया । इसके अलावा समर्थन योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन के i-कोर कार्यक्रम द्वारा प्रदान की गई थी और जीन विनियमन में क्रोमेटिन और आरएनए पर मैं कोर द्वारा, GIF फाउंडेशन, लुईस परिवार फाउंडेशन, ICRF प्रोफेसरों अनुदान, Helmholtz इज़राइल अनुदान और Rosetrees ट्रस्ट (सभी ओएम के लिए) । यह अध्ययन भी इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 502/15), Kass चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार और रुधिर और चढ़ाए चिकित्सा के इसराइल सोसायटी से एक अनुसंधान अनुदान (एस. ई.) द्वारा समर्थित किया गया था । ओ. एम आणविक इम्यूनोलॉजी के एक क्राउन प्रोफेसर है ।
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |