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Biology

Un sistema reportero BW para el estudio de las interacciones Receptor-ligando

doi: 10.3791/58685 Published: January 7, 2019

Summary

Este protocolo describe cómo establecer un sistema de reportero que puede utilizarse para identificar y cuantificar las interacciones receptor-ligando.

Abstract

Interacciones entre receptores y ligandos constituyen un proceso biológico fundamental. Sin embargo, dirigir experimentos con las células que expresan el receptor nativo y el ligando son difíciles ya que el ligando de un receptor específico puede ser desconocido y procedimientos experimentales con el ligando natural pueden ser técnicamente complicados. Para hacer frente a estos obstáculos, describimos un sistema reportero para detectar la Unión y activación de un receptor específico por un ligando de interés. En este sistema de reportero, se conjuga el dominio extracelular de un receptor específico al ratón de CD3ζ y esta proteína quimérica entonces se expresa en células de ratón BW. Estas células transfected BW pueden entonces incubarse con diferentes objetivos (p. ej., células o anticuerpos). Activación de un receptor transfected conduce a la secreción de interleucina 2 de ratón (mIL-2) que puede ser detectada por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Este sistema reportero tiene las ventajas de ser sensible y específico para un solo receptor. Además, el nivel de activación de un receptor específico puede cuantificarse fácilmente y puede utilizarse incluso en casos donde el ligando del receptor es desconocido. Este sistema ha sido implementado con éxito en muchos de nuestros estudios para caracterizar las interacciones receptor-ligando. Recientemente hemos utilizado este sistema para estudiar la activación de los receptores de Fcγ humanas (FcγRs) por anticuerpos anti-CD20 monoclonal diferentes en uso clínico.

Introduction

El sistema de BW reportero es una técnica para el estudio de las interacciones ligando-receptor1. Este sistema es especialmente ventajoso cuando el ligando de un receptor específico es desconocido o experimentos con el ligando endógeno son técnicamente difíciles. También puede ser utilizado para el estudio de la Unión de anticuerpos monoclonales humanos FcγRs. El método se basa en expresar una proteína quimérica en células de ratón BW. Esta proteína quimérica está compuesto por el dominio extracelular del receptor de interés sobre los dominios transmembranales e intracelulares de la cadena ζ de ratón. Unión de ligandos apropiados del receptor conduce a la secreción de IL-2 de ratón, que puede ser fácilmente detectada por ELISA, como se ilustra en la figura 1. Este método es sensible y específico a un receptor individual, fácil de operar y altamente reproducibles. Así pueden complementar herramientas adicionales para el estudio de las interacciones receptor-ligando. Por ejemplo, puede ser utilizado para varias líneas de celulares por la presencia de un ligando de un receptor específico de la pantalla (aunque no se ha identificado el ligando sí mismo) o para detectar la activación de la FcγRs humana por anticuerpos monoclonales o por suero humano que contengan antiviral anticuerpos. Aunque las células inmunes primarias expresan FcγRs endógena, son generalmente difíciles de manejar y generalmente expresan varios receptores de Fc.

Hemos utilizado este sistema con éxito en muchos de nuestros estudios para caracterizar las interacciones receptor-ligando. Se trata de identificar la hemaglutinina como el ligand del receptor de la célula NK NKp462, identificación de PVR y 2 de la molécula como ligandos para el ser humano y el ratón TIGIT3,4, y demostrando que el fusobacterium nucleatum se une la bacteria y activa humana TIGIT5. Además, han utilizado con éxito células de BW que expresan receptores Fc para detectar anticuerpos antivirales en suero6,7,8 pacientes. En concreto, recientemente establecido células de BW que expresan FcγRs humano para detectar la activación diferencial de FcR de anticuerpos anti-CD20 utilizado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL)9. Lo importante, los resultados del sistema BW reportero han sido validados en experimentos complementarios.

Protocol

1. generación de un plásmido que expresa la construcción quimérica

Nota: El objetivo es generar un plásmido que expresa el dominio extracelular del receptor de interés fusionado a los dominios transmembranales e intracelulares del ratón cadena CD3ζ (figura 2A).

  1. Recuperar la secuencia del dominio extracelular del receptor de interés, incluyendo el péptido señal. Obtener material de ADN que se espera que expresan este receptor (por ejemplo, cDNA o un plásmido).
  2. Obtener material de ADN que expresa la transmembrana y dominios intracelulares del ratón cadena CD3ζ (e.g., cDNA o un plásmido).
  3. Diseño de la secuencia de la proteína de fusión basada en la estructura general que se muestra en la figura 2A. Asegúrese de que toda la secuencia es en el mismo marco de lectura del codón. Esta secuencia se utiliza para diseñar adecuados primers y verificar el producto final.
  4. Diseño de dos reacciones de PCR para amplificar cada uno de los fragmentos de las proteínas de la fusión por separado (figura 2B, 2C)10.
    Nota: Las condiciones específicas para las reacciones de PCR (por ej., tiempo de elongación y recocido temperatura) dependen de la naturaleza de los iniciadores, que se diseñan para un receptor específico.
    1. Ampliar el segmento extracelular del receptor.
      1. Diseño de un primer 5' que incluye parte del péptido de señal de receptor, una secuencia de consenso de Kozak y un sitio de restricción apropiado (figura 2B).
      2. Diseño de una cartilla 3' que flanquea ambas partes de la proteína de fusión (figura 2B). Por ejemplo, para el diseño inicial esta cartilla 3' puede incluir los últimos 20 pares de bases el segmento extracelular del receptor y los primeros 9 pares de bases del segmento de CD3ζ.
        Nota: No hay para agregar un sitio de restricción para lo primer 3' ya que esta imprimación se utilizará para generar la secuencia fundida y no se utiliza para ligadura.
    2. Ampliar el segmento de CD3ζ.
      1. Diseño de un primer 5' que bordea ambas partes de la proteína de fusión (figura 2). Por ejemplo, para el diseño inicial el primer 5' puede incluir los últimos 9 pares de bases el segmento extracelular del receptor y los primeros 20 pares de bases del segmento de CD3ζ.
        Nota: No hay para agregar un sitio de restricción para la cartilla 5' ya que esta imprimación se utilizará para generar la secuencia fundida y no se utiliza para ligadura.
      2. Diseño de una cartilla 3' que incluye el final de la secuencia de CD3ζ, así como un sitio de restricción apropiado (figura 2).
    3. Corregir las secuencias de la cartilla en cada una de estas dos reacciones para que la temperatura de recocido es similar en cada par (tenga en cuenta que la cartilla, que incluye secuencias de las dos partes de la proteína de fusión, se recuece sólo con parte de la secuencia en cada reacción).
  5. Realizar una PCR adicional en el que se utiliza una mezcla de los productos PCR de las dos primeras reacciones como la plantilla de la DNA con la cartilla 5' del segmento extracelular del receptor (paso 1.4.1.1) y los 3' del segmento de CD3ζ (paso 1.4.2.2) (Figura 2D)10 . Esta reacción debe generar la secuencia fundida final.
  6. Proceda como de costumbre para la clonación.
    1. Ligar el producto final de PCR en el destino del corte de vector (vector objetivo suele pcDNA3 que expresa resistencia a G418 y ampicilina).
    2. Transformar el vector ligado en bacterias competentes11.
      1. Descongelar 50 μl de las bacterias competentes en el hielo.
      2. Añadir vectores ligados a las bacterias e incubar en hielo por 20 min.
      3. Incubar a 42 ° C por 45 s.
      4. Añadir 200 μL de LB sin antibióticos.
      5. Incubar durante 1 h a 37 ° C con agitación continua.
      6. Semillas en una placa LB con los antibióticos apropiados (p. ej., ampicilina solución con una concentración final de 0,1 mg/mL).
    3. Recoger y cultivar varias colonias bacterianas en 5 mL de LB (en tubos de 15 mL).
    4. Al día siguiente, extraer plásmidos con un mini kit de preparación.
    5. Analizar la inserción de genes con enzimas de restricción.
    6. La secuencia de las colonias correspondientes y verificar que la secuencia y el marco de lectura son correctas (como se indica en el paso 1.3).
  7. Transformar el plásmido verificado en bacterias competentes11.
    1. Descongelar 20 μl de las bacterias competentes en el hielo.
    2. Añadir 1 μl del plásmido en la bacteria e incubar en hielo por 20 min.
    3. Incubar a 42 ° C por 45 s.
    4. Añadir 200 μL de LB sin antibióticos.
    5. Incubar durante 1 h a 37 ° C con agitación continua.
    6. Semillas en una placa de crecimiento de bacterias con los antibióticos apropiados (p. ej., ampicilina solución con una concentración final de 0,1 mg/mL).
  8. Al día siguiente, crece una colonia de bacterias en un gran contenedor LB con ampicilina de 0,1 mg/mL (250 mL).
  9. Al día siguiente, realizar maxi preparación según las instrucciones específicas por el kit.
    Nota: Para el procedimiento de la electroporación, una gran cantidad de plásmido se requiere, como se detalla a continuación.

2. transfección del plásmido que expresa la proteína quimérica en células de BW

Nota: También se pueden emplear diferentes métodos de transfección (e.g., por infección lentivirales). Antes de la electroporación, realizar la precipitación del etanol de la DNA como se describe a continuación. Los siguientes pasos requieren condiciones estériles.

  1. El día anterior, preparar las BW5147 (células "BW") para la electroporación. Placa de 10 placas (de 10 cm) con 10 mL de 100.000 BW5147 células / (es decir, un total de 10 x 106 células) con RPMI suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), piruvato de sodio 1%, 1% L-glutamina, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% penicilina-estreptomicina ("medio completo").
  2. 100 μg de plásmido pcDNA3 que expresa la proteína de fusión en un tubo de 1.5-2 mL y agregue acetato de sodio de 3 M pH 5.3-5.5. El volumen del acetato de sodio debe corresponder a 0.1 (10%) del volumen del 100 μg plásmido; valorar el pH del acetato de sodio con un medidor de pH mediante la adición de NaOH o HCl.
  3. Añadir 2,5 volúmenes de etanol al 100% a la mezcla de plásmido y el acetato de sodio como se describe en el paso 2.2 (2.5 x el volumen total de plásmido y sodio acetato). Incubar durante una noche a-20 ° C o 2 h a 70 ° C.
  4. 2.4. 24 horas después de que las células de BW han sido plateadas, recoge todas las BW células (~ 100 mL) en tubos de 2 50 mL. Centrifugar las células durante 5 min a 515 x g y descartar el sobrenadante.
  5. Resuspenda el sedimento de los tubos en 25 mL de RPMI - en un tubo único 50 mL. Por ejemplo, vuelva a suspender el sedimento de un tubo con 25 mL de RPMI - y luego usar este líquido para volver a suspender el líquido en otro tubo de 50 mL para que el sedimento total de las células de BW se resuspendió en 25 mL de medio en un solo tubo.
    Nota: El medio debe ser sin adiciones, puesto que el suero puede interferir con la electroporación.
  6. Centrifugar las células nuevamente por 5min a 515 x g. Vuelva a suspender el sedimento en 1 mL de RPMI y transferir el contenido a una cubeta de 0.4 cm en el hielo.
  7. Centrifugue el plásmido que experimentó la precipitación del etanol (paso 2.3) durante 30 min a 16.000 x g a 4 ° C.
  8. Lavar una vez con 1 mL de etanol al 70% y centrifugar durante otros 20 minutos en 16.000 x g y 4 ° C (para lavar la sal).
  9. Eliminar el etanol y dejar el sedimento seco ligeramente (es decir, en un tubo abierto en la campana de cultivo de tejidos). Resuspenda el precipitado con 100 μl de RPMI-previamente calentado a 60 ° C.
  10. Añadir el plásmido suspende de nuevo (paso 2.8) a las células en la cubeta e incubar durante 5 minutos en hielo.
  11. Electroporate las células en 0.23 kV, 250 capacitación. Esto debe tomar ms ~ 4.
  12. Las células electroporated de la transferencia a un tubo de 50 mL, añadir 50 mL de medio completo y centrifugar durante 5 min en 515 x g.
  13. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con 50 mL de medio completo.
  14. Las células electroporated en platos de cultivo de 24 pozos (1 mL por pozo, para un total de ~ 50 pozos) de la placa e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante 48 h.
  15. Seleccionar las células transfected con los antibióticos. Después de 48 h Añadir 1 mL de medio completo suplementado con 10 mg/mL G418 a cada pocillo (en esta etapa el volumen final en cada bien es 2 mL y la concentración final de G418 en cada bien es 5 mg/mL).
    Nota: Si el plásmido contiene una diferente resistencia a los antibióticos, determinar la concentración de antibiótica necesaria para matar las células de BW untransfected antes de este paso.
  16. Cada 48 h, descartar cuidadosamente 1 mL del volumen superior de cada pozo sin agitación el medio en el pozo (las células BW tienden a ser en el fondo del pozo). Añadir completo suplementado con 5 mg/mL G418 a cada pocillo, por lo que el volumen final en cada pozo es otra vez 2 mL.
  17. Examinar regularmente las placas de cultivo para el crecimiento celular en todos los pocillos.
    Nota: Un cambio en el color del medio a amarillo puede ayudar a identificar las células cada vez mayores; sin embargo, al principio el medio estará en amarillo debido a la G418 sí mismo. Identificar positivo pozos (pozos con el crecimiento de las células). Estos pozos son G418 resistente y por lo tanto se espera que para expresar la proteína de fusión. Este proceso generalmente toma aproximadamente 3 semanas.

3. verificación de la expresión del Receptor Transfected en las células en los pozos positivos.

  1. Se tiñen las células transfected BW con un anticuerpo específico contra el receptor que fue transfectado.
  2. Comparar el nivel de expresión del receptor de la citometría de flujo la expresión de las células control (células de BW untransfected).
  3. Después de la verificación de uno o más pozos, utilizar células de inmediato para los propósitos experimentales, crecer en cultura o congelar para futuras aplicaciones.
  4. Verificar la expresión de los receptores transfected antes de realizar un nuevo experimento. Después de unas semanas de crecimiento, las células con G418 con una expresión estable del receptor, puede omitirse G418 desde el medio de cultivo.

4. incubación de las células Transfected BW con objetivos

Nota: Al utilizar las células transfected de BW por primera vez, es preferible a prueba en objetivos que expresan un ligando conocido del receptor de interés o en la placa-límite anticuerpos específicamente dirigidos contra el receptor de interés (cross-linking experimentos; ver abajo, sección 4.2.1.3).

  1. Es preferible dividir las células BW 24 h antes del experimento (por ejemplo, añadiendo 10 mL de medio completo a 2 mL de células en cultivo en una placa de cultivo nuevo de 10 cm).
  2. Incube las células transfected BW con sus objetivos. Realizar el experimento simultáneamente en las células control BW que expresan un vector vacío (o las células parentales de BW). 96F placas son preferibles (pero también se pueden utilizar placas 96U). Realizar el experimento por triplicado. Suspender todas las células en el medio completo.
    1. Preparar los objetivos. El tipo de objetivo varía en función del objetivo y puede ser células, las células que han sido previamente incubadas con anticuerpos o anticuerpos solo. Este sistema también se ha utilizado con bacterias como objetivos5.
      1. Si los objetivos están dividiendo las células (es decir, las líneas celulares), les irradian en 6.000 rad antes del ensayo. Lugar de 50.000 de las células de la blanco en un único pozo de una placa de 96 (en un volumen de 100 μL).
      2. Para experimentos con anticuerpos y células de BW que expresan FcγRs humano, incubar las células diana con un anticuerpo en el hielo en un plato bien 96 (por ejemplo, 50 μl de las células diana y 50 μl del anticuerpo; dosis diferentes de anticuerpos pueden ser probados).
      3. Si utiliza anticuerpos sólo como objetivos (cross-linking experimentos), deben ser enlazados a la placa. Para ello, primero Incube los anticuerpos en un medio completo en una placa 96F para 1-2 h a 37 ° C y 5% CO2 (una dosis inicial típica es de 0,5 μg de un anticuerpo específico en 50 μL). Lavar la placa para eliminar los anticuerpos no Unidos.
        Nota: en este caso, una placa 96F permitirá a Unión de anticuerpo a la placa, que después de la adición de las células transfected BW conducirá a la activación del receptor transfected.
    2. Añadir el BW (células efectoras). Colocar 50.000 células de BW en un único pozo de una placa de 96 (en un volumen de 100 μL).
    3. Completar el volumen en cada pocillo 200 μL si es necesario.
    4. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO2 durante 48 h (este período puede ser calibrada).
  3. Después de 48 h, congelar las placas a-20 ° C y descongelar antes de ELISA, o utilizar de inmediato para ELISA (ver pasos).

5. ELISA

  1. Cubrir una placa de ELISA con un anticuerpo IL-2 de anti-ratón (anti-mIL-2). Coloque 0.05 μg de anti-mIL-2 en un volumen de 50 μl de PBS 1 x por pozo. Incubar la placa de ELISA recubierta con el anticuerpo anti-mIL-2 a 4 ° C durante la noche o a 37 ° C por 2 h.
    Nota: Para realizar ELISA directamente después de la etapa de incubación, la placa de ELISA debe ser cubierta 24 h antes de finalizar el período de incubación de las células de BW.
  2. Deseche el líquido de la placa de ELISA y añadir una solución de bloqueo (200 μL por pozo) que se compone de 1 x PBS y 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar la placa de ELISA por 2 h a temperatura ambiente.
  3. Lave la placa de ELISA tres veces con solución PBS Tween al 0,05% (es decir, 0,5 mL de Tween-20 en 1 litro de PBS 1 x).
  4. Quite la placa 96 que tiene las células de BW que se incubaron con sus objetivos (4.3). Si la placa estaba congelada, totalmente deshielo (por ej., por breve incubación a 37 ° C). Centrifugar la placa 96 (5 min, 515 x g) y cuidadosamente transfiera 100 μl del sobrenadante de cada pozo a la placa de ELISA prelacada y bloqueada.
    Nota: Se debe recoger el sobrenadante de los lados de cada bien para evitar tomar las células.
  5. Si se desea, añadir mIL-2 recombinante con concentraciones definidas a una de las filas vacías de la placa de ELISA revestida para generar una curva estándar de mIL-2. Por ejemplo, desde una concentración de 2 mIL de 2.500 pg/mL y luego disminuir en un 50% en cada pozo posterior; no agregue 2 mIL el último bien.
  6. Incubar la placa de ELISA, a 4 ° C durante la noche o a 37 ° C por 2 h.
  7. Lave la placa de ELISA cuatro veces con PBS Tween.
  8. Añadir IL-2 de anti-ratón biotina a la placa de ELISA. Utilizar una concentración de 1 anticuerpo μg en 1 mL de PBS 1 x con 1% BSA y dividir en 100 μl por pocillo.
  9. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  10. Lavar la placa seis veces con PBS Tween de ELISA.
  11. Añadir streptavidin HRP conjugada. Utilizar una concentración de 1 μl estreptavidina en 1 mL de PBSX1 con 1% BSA y dividirla en 100 μl por pocillo.
  12. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  13. Lavar la placa seis veces con PBS Tween de ELISA.
  14. Añada 100 μl por pocillo de la solución substrato con TMB. Completa esta etapa rápidamente para reducir al mínimo las diferencias entre los pocillos por intervalos cuando se agrega el OST.
  15. Lea la placa de ELISA con un lector de ELISA a 650 nm (la lectura puede ser repetido si la señal es débil).

Representative Results

La figura 3 ilustra los resultados de un experimento con un sistema de reportero de BW. En este experimento, las células CLL fueron incubadas previamente con anticuerpos diferentes anti-CD20 (rituximab y obinutuzumab) y luego Co se incubaron con células transfected de BW que expresan CD16a CD3ζ. Experimentos similares se realizaron en nuestro estudio9. Figura 3A presenta una imagen de una placa de ELISA cruda donde la intensidad del color corresponde a una concentración de mIL-2. El experimento se realizó por triplicado. Este experimento incluye varios controles: las células CLL se incubaron con células parentales de BW untransfected (fila superior) y las células CLL se incubaron con células de BW que expresan CD16a CD3ζ pero sin un anticuerpo o un anticuerpo de control (seis pozos en la segunda fila de la izquierda) . La incubación de células de BW que expresan CD16 con las células CLL que previamente fueron incubadas con anticuerpos anti-CD20 induce una secreción significativa de mIL-2 en comparación con el nivel de 2 mIL de los pozos de control. Preincubación de las células CLL con el anti-CD20 obinutuzumab activa importante, CD16 más fuertemente que el rituximab, un conocido que fue recapitulado por nuestro sistema de búsqueda. La última fila muestra descendente previamente definida concentración de mIL-2 recombinante (sin la adición de las células). El pozo derecho de la última fila no tiene 2 mIL y representa la lectura de fondo, que parece similar a los pozos de control. Figura 3B presenta la cuantificación de los resultados de la placa de ELISA que se muestra en la Figura 3A. Los niveles de densidad óptica (OD) fueron convertidos en concentración de mIL-2 basado en la curva estándar con mIL-2 recombinante. Figura 3 presenta un experimento de respuesta de dosis donde diferentes dosis de anticuerpos fueron incubadas previamente con células de CLL y luego se incubaron con células BW expresan CD16.

Figure 1
Figura 1: representación esquemática del sistema reportero BW. Las células BW5147 son estable transfected con la porción extracelular de diferentes receptores fusionados a los dominios transmembranales y citoplasmáticos del cadena CD3ζ (quimérico recptor-CD3ζ) del ratón. Activación de un receptor-CD3ζ específica por un ligando se traduce en una secreción de mIL-2 que puede ser detectados por ELISA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: la estructura de la quimérica CD3ζ de receptor y el diseño de los primers PCR. (A) general estructura de un receptor extracelular fusionados a los dominios transmembranales e intracelulares del ratón CD3ζ. (B) el dominio extracelular del receptor se amplificó con un iniciador 3' que también incluye nucleótidos de CD3ζ. (C) los dominios intracelulares y transmembranales de CD3ζ fueron amplificados con un primer 5' que también incluye nucleótidos del receptor. (D) en la reacción de PCR final, ambos segmentos, que tienen superposición de secuencias, fueron utilizados como la plantilla de la DNA. En todos los paneles de figura, dominios diferentes de proteínas son codificadas por colores y encajonados en rectángulos azules (secuencia de CD3ζ) y rectángulos rojos (la secuencia del receptor). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: ilustración del producto final del sistema reportero BW. (A, B, C) Células de CLL fueron previamente incubadas con o sin dos anticuerpos anti-CD20 (rituximab y obinutuzumab) o un anticuerpo de control. Luego, las células anticuerpo se incubaron con células parentales de BW o BW que expresan CD16a CD3ζ. El nivel de mIL-2 en el sobrenadante se determinó por ELISA. (A) una imagen de una placa de ELISA cruda. Intensidad del color indica la concentración de mIL-2 en el sobrenadante. El experimento se realizó por triplicado. La fila inferior muestra la lectura de ELISA en la disminución de las concentraciones de mIL-2 recombinante que se analizaron en el mismo plato. (B) cuantificación de la ELISA se muestra en (A) de lectura. Los niveles de 2 mIL fueron calculados usando una curva estándar de mil-2. (C) A dosis respuesta el experimento donde fueron incubados previamente con células de CLL y luego se incubaron con BW las células CD3ζ CD16a diferentes dosis de anticuerpos. , P < 0.001; Prueba de t de Student (B) o ANOVA con comparaciones múltiples (C). La única comparación en (C) que no fue significativamente diferente fue para rituximab y el control Ab en la primera concentración (0,01 μg/mL). Barras de error representan el desvío estándar de los triplicados. Experimentos similares se llevaron a cabo como parte de uno de nuestro reciente estudio9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí presentamos un protocolo para la generación de un sistema de reportero para investigar las interacciones receptor-ligando (ver una forma abreviada de este protocolo en1). El protocolo se compone de tres partes principales: la clonación de una proteína quimérica, que incluye el dominio extracelular de un receptor específico fusionado al dominio intracelular de CD3ζ, transfección de un plásmido que expresa la proteína de fusión a las células de BW (p. ej. , por electroporación) y detección cuantitativa de ratón IL-2 por ELISA. El producto final de cada una de estas partes debe ser verificado independientemente: el proceso de clonación debe ser verificado por secuenciación completa de la proteína de fusión en el plásmido de destino, la transfección de las células de BW debe verificarse examinando la expresión de la receptores de interés en las células de BW (por ejemplo, mediante citometría de flujo) y el proceso de ELISA deben ser verificada por general controles positivos (p. ej., mIL-2 recombinante), así como con controles específicos para las células transfected BW; es decir, objetivos que expresan un ligando conocido del receptor de interés (por ejemplo, las células que expresa CD48 puede usarse como un control positivo para células de BW que expresan las NK célula receptor 2B4). Por ejemplo, el proceso de clonación puede ser acertado, pero la proteína de fusión no es expresada por las células de BW. En este caso, debe repetirse la electroporación. Alternativamente, si no hay señal por encima del nivel de fondo de la placa de ELISA (especialmente para los controles positivos) las células transfected BW pueden no han podido expresar el receptor (o la expresión se ha perdido) o puede haber ocurrido un problema técnico durante el el proceso de ELISA.

Varias modificaciones pueden hacerse en el presente Protocolo preservando los principios generales del procedimiento. Estas modificaciones incluyen el vector utilizado para expresar la proteína de la fusión, el método de transferencia del plásmido a las células de BW y parámetros específicos relacionados con la incubación y ELISA como el tipo de objetivo (p. ej., células, anticuerpos, etc.) , número de las células diana o la concentración de anticuerpos si es relevante (usamos 50.000 células por pozo y un anticuerpo a partir de dosis de 0,5 μg/pocillo), tiempo de incubación (nosotros usamos un tiempo de incubación de 48 h) y el volumen de sobrenadante que se transfiere a la placa de ELISA.

Este método es sensible, específico y puede cuantificarse fácilmente. Es ideal para la detección de la presencia de ligandos para receptores específicos (especialmente si el ligando en sí mismo no ha sido reconocido). Después de preparar células transfected de BW que expresan un receptor específico, estas células pueden ser congeladas y utilizadas cuando sea necesario para experimentos adicionales. Nosotros y otros han utilizado este sistema con éxito en estudios anteriores para explorar las interacciones receptor-ligando (por ejemplo2,3,5,12,13,14 15,16) y los resultados obtenidos por este sistema han sido verificados por otras técnicas. Este método puede utilizarse también para estudiar la activación de distintos receptores FcγR humanos por anticuerpos, como se ha hecho para anticuerpos antivirales en el suero6,7,8 o con anticuerpos monoclonales contra el CD20 9.

Ya que este es un sistema de reportero en el que se expresa solamente el segmento extracelular del receptor, los resultados obtenidos por este sistema deberán complementarse con experimentos adicionales con el receptor endógeno, como ensayos de citotoxicidad con natural las células asesinas (NK) para el estudio de las interacciones con NK célula receptores. Por otra parte, ciertas interacciones ligando receptor podrán no resultar en la secreción de una 2 mIL por el sistema de reportero y por lo tanto pueden pasar por alto. Además, como en cualquier instalación experimental, los resultados deben ser verificados para diversos parámetros como se describió anteriormente. Esto es especialmente importante en caso de que una comparación de dos condiciones necesarias (p. ej., activación del mismo receptor de Fc de anticuerpos diferentes). También es importante verificar que la sensibilidad de una interacción ligando-receptor específico está dentro del rango lineal del sistema. De lo contrario esto podría conducir a valores de saturación que pueden impedir una comparación válida en condiciones. Esto puede lograrse usando una curva estándar de mIL-2, así como generar una curva de dosis-respuesta con el ligando probado (en el caso de saturar los valores, los parámetros experimentales deben ser modificados; por ejemplo, un menor volumen de sobrenadante debe ser analizada por ELISA). Otra posible limitación de este sistema es el uso de las células blanco con las secreciones endógenas de mIL-2 (por ejemplo, las células T de ratón) que sería enmascarar la secreción IL-2 de células de BW. Para superar estos acontecimientos altamente inusuales que están confinados a las células de ratón, este sistema reportero podría mejorarse mediante el uso de un reportero diferente (por ejemplo, GFP) que no se expresa por las células diana.

Disclosures

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Esther Singer para la edición de la lengua. Este estudio fue apoyado por el Consejo Europeo de investigación de la Unión Europea en el séptimo programa marco (FP/2007-2013) / acuerdo de subvención del CEI número 320473-BacNK. Apoyo adicional fue proporcionado por el principal programa del Comité de presupuestación y la planificación y la Fundación de Ciencias de Israel y por el I-Core en la cromatina y el ARN en la regulación génica, la Fundación de GIF, la Fundación de la familia de Lewis, la beca de la Cátedra ICRF, el Concesión de Israel de Helmholtz y la confianza de Rosetrees (todos a la O.M.). Este estudio también fue apoyado por Israel Science Foundation (grant 502/15), el Premio de investigación médica de Kass y una beca de investigación de Israel sociedad de Hematología y medicina transfusional (a S.E). O.M es corona profesor de Inmunología Molecular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit Bioneer K-3030
Anti-mouse IL-2 BioLegend 503702
Biotin anti-mouse IL-2 BioLegend 503804
ELISA plates De-groot 60-655061
Fetal Bovine Serum Sigma F7524-500ml
G418 Mercury MBS3458105GM
Gene Pulser II Bio-Rad 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-Glutamine Biological industry 03-020-1B
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Biological industry 01-340-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological industry 03-031-1B
peroxidase streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-030-084
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit ThermoFisher Scientific K210016
RPMI-1640 Medium Biological industry 30-2001
Sodium Pyruvate Biological industry 03-042-1B
TMB SouthernBiothech 0410-01

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References

  1. Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
  2. Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409, (6823), 1055-1060 (2001).
  3. Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (42), 17858-17863 (2009).
  4. Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. (2013).
  5. Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42, (2), 344-355 (2015).
  6. Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387, (1-2), 21-35 (2013).
  7. Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205, (5), 409-424 (2016).
  8. Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7, (1), 6054 (2017).
  9. Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7, (6), e1428158 (2018).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  11. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  12. Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91, (19), (2017).
  13. Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195, (8), 3959-3969 (2015).
  14. Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38, (6), 1223-1235 (2013).
  15. Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11, (2), 121-128 (2010).
  16. Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110, (7), 943-953 (2002).
Un sistema reportero BW para el estudio de las interacciones Receptor-ligando
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Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).More

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).

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