Bu iletişim kuralı tanımlamak ve reseptör-ligand etkileşimleri ölçmek için kullanılan bir muhabir sistem kurmak açıklar.
Reseptörleri ve ligandlar arasındaki etkileşimler bir temel biyolojik süreç oluşturmaktadır. Ancak, doğrudan hızlı yerel reseptör hücreleri ile deneyler ve ligand zorlu beri belirli bir reseptör ligand bilinmeyen olabilir ve deneysel yordamlar yerel ligand ile teknik karmaşık olabilir. Bu engelleri gidermek için bağlama ve belirli bir reseptör aktivasyonu faiz bir ligand tarafından tespit etmek için bir muhabir sistemi açıklanmaktadır. Bu muhabir sisteminde, ekstrasellüler etki alanı belirli bir reseptör fare CD3ζ Birleşik ve bu chimeric protein sonra fare BW hücrelerde ifade edilir. Bu transfected BW hücreler daha sonra farklı hedefler (Örneğin, hücreleri veya antikorlar) ile inkübe. Transfected reseptör aktivasyonu enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından tespit edilebilir fare interleukin-2 (MIL-2) salgılanmasını yol açar. Bu muhabir sistem hassas ve belirli bir tek takımı olmanın avantajı vardır. Buna ek olarak, belirli bir reseptör aktivasyon düzeyini kolayca sayılabilir ve reseptör ligand bilinmeyen nerede durumlarda bile kullanılabilir. Bu sistem birçok reseptör-ligand etkileşimleri karakterize etmek için çalışmalarımız başarıyla uygulanmıştır. Biz son zamanlarda insan Fcγ reseptörleri (FcγRs) etkinleştirme klinik kullanımda farklı monoklonal anti CD20 antikorları tarafından çalışma için bu sistemi istihdam.
BW muhabir reseptör-ligand etkileşimleri1için bir yüntem sistemidir. Bu sistem belirli bir reseptör ligand bilinmiyor veya endojen ligand ile deneyler Teknik olarak zor özellikle avantajlıdır. Ayrıca insan FcγRs monoklonal antikorlar bağlama eğitimi için kullanılabilir. Bu yöntem chimeric bir proteinin fare BW hücrelerdeki ifade üzerinde dayanır. Bu chimeric proteinin fare ζ zinciri transmembran ve hücre içi etki erimiş faiz reseptör ekstrasellüler etki alanı oluşur. Bağlama uygun ligandlar reseptör, ELISA, Şekil 1‘ de gösterildiği gibi kolayca algılanabilir fare IL-2 salgılanmasını yol açar. Bu yöntem duyarlı ve özel bireysel bir reseptör, kullanımı kolay ve son derece tekrarlanabilir. Böylece reseptör-ligand etkileşimleri çalışmak için ek araçlar tamamlayabilir. Örneğin, (ligand kendisi değil tespit edilmiş olsa bile) bir ligand için belirli bir reseptör varlığı için birden fazla hücre satır ekran veya monoklonal antikorlar veya insan serumu anti-viral içeren insan FcγRs aktivasyonu algılamak için kullanılabilir antikorlar. Birincil bağışıklık hücrelerinin endojen FcγRs hızlı ve genellikle birkaç Fc reseptörü hızlı işlemek genellikle zor olmakla birlikte.
Biz bu sistemi başarıyla çalışmalarımız çoğunda reseptör-ligand etkileşimleri karakterize etmek için kullandık. Bu haemagglutinin PVR ve nectin-2 ligandlar insan ve fare TIGIT3,4, tanımlayan NK hücre reseptör NKp462, ligand olarak tanımlayan içerir ve bu fusobacterium nucleatum gösterilen bakteri bağlar ve insan TIGIT5etkinleştirir. Buna ek olarak, Fc reseptör hızlı BW hücreleri hastaların sera6,7,8‘ Anti-yayılmacı antikorlar algılamaya başarıyla kullanılmıştır. Özellikle, son zamanlarda fark FcR harekete geçirmek anti CD20 antikor kronik lenfositik lösemi (CLL)9tedavisinde kullanılan algılamaya insan FcγRs hızlı BW hücreleri kurulmuş. Önemlisi, BW muhabir sistemi sonuçlarını tamamlayıcı deneylerde doğrulanmış.
(Bkz: Bu protokol1için kısaltılmış bir şeklinde) reseptör-ligand etkileşimleri araştırmak için bir muhabir sistemi oluşturmak için bir iletişim kuralı mevcut burada. Protokol üç ana bölümden oluşur: belirli bir reseptör ekstrasellüler etki alanı içeren bir chimeric protein, klonlama erimiş CD3ζ, transfection füzyon protein BW hücrelere ifade eder bir plazmid, hücre içi etki alanına (Örneğin , Elektroporasyon tarafından), fare IL-2 tarafından ELISA ve nicel tespit. Nihai ürün bölümleri, bağımsız doğrulanması gerekir: klonlama işlemini tam sıralama hedef plazmid füzyon proteinin tarafından doğrulanması gerekir, BW hücre transfection ifadesi inceleyerek doğrulanması gerekir reseptör BW hücreleri (Örneğin, akış sitometresi tarafından) ve ELISA işleminin ilgi genel olumlu denetimleri (Örneğin, rekombinant MIL-2) yanı sıra transfected BW hücreler için belirli denetimleri ile doğrulanması gerekir; Yani, faiz (Örneğin, hücreler NK hızlı BW hücre reseptör 2B4 hücre için hızlı CD48 olumlu bir denetim kullanılabilir) reseptör bilinen bir ligand hızlı hedefler. Örneğin, klonlama işlemini başarılı olabilir, ancak füzyon protein BW hücreleri tarafından ifade değil. Bu durumda, adım yinelenmelidir. Alternatif olarak, ELISA plaka arka plan seviyesinin üzerinde sinyal yok ise (özellikle olumlu denetimleri için) transfected BW hücre reseptör ifade etmek başarısız olmuş olabilir (veya ifade kayboldu) veya teknik bir sorun sırasında oluşmuş olabilir ELISA işlemi.
Yordamı genel prensipleri koruyarak bu iletişim kuralı için birkaç değişiklik yapılabilir. Bu değişiklikler füzyon protein, plazmid BW hücreleri ve kuluçka ve hedef (Örneğin, hücreleri, antikor, vb), türü gibi ELISA ile ilgili belirli parametreleri için transfecting yöntemini ifade etmek için kullanılan vektör içerir , hedef hücreleri veya antikor konsantrasyon ilgili olması durumunda (iyi ve 0,5 µg/iyi doz başlayan bir antikor başına 50.000 hücreleri kullanın), kuluçka süresi (kullandığımız bir kuluçka süresi 48 saat) ve ELISA plakasına transfer süpernatant birim.
Bu yöntem duyarlıdır belirli ve kolayca sayılabilir. Ligandlar belirli reseptörleri için varlığı için (özellikle ligand kendisi değil kabul edilmiştir eğer) eleme için idealdir. Belirli bir reseptör hızlı transfected BW hücreleri hazırladıktan sonra bu hücreler donmuş ve ek deneyler için gerektiğinde kullanılır. Biz ve diğerleri bu sistem başarıyla önceki çalışmalarda reseptör-ligand etkileşimleri (örneğin2,3,5,12,13,14 keşfetmek için kullanılır 15,16) ve bu sistem tarafından elde edilen sonuçlar diğer teknikleri tarafından doğrulanmıştır. Bu yöntem de farklı insan FcγR reseptörlerinin aktivasyonu çalışmaya anti-viral karşı antikorlar serum6,7,8 veya monoklonal antikorlar karşı CD20 ile yaptığı gibi antikorlar tarafından kullanılabilir 9.
Bu, yalnızca hücre dışı segment reseptör ifade edileceği bir muhabir sistemi olduğundan, bu sistem tarafından elde edilen bulgular sitotoksisite deneyleri doğal gibi endojen reseptör ile ek deneyler tarafından tamamlanmalıdır NK ile etkileşimleri çalışmaya katil (NK) hücre reseptörleri hücre. Ayrıca, belirli ligand/reseptör etkileşim bir MIL-2 salgı muhabir sistem tarafından neden olabilir değil ve bu nedenle gözden. Buna ek olarak, herhangi bir deneysel Kur olduğu gibi sonuçlar için çeşitli parametreler yukarıda açıklandığı gibi doğrulanması gerekir. Bu iki koşul karşılaştırılması gereken (Örneğin, farklı antikor tarafından aynı Fc reseptör aktivasyonu) olduğu durumlarda özellikle önemlidir. Bir belirli ligand-reseptör etkileşimini duyarlılığını sisteminin doğrusal aralığı içinde olduğunu doğrulamak önemlidir. Aksi takdirde bu geçerli bir karşılaştırma koşulları engel doygunluk değerleri neden olabilir. Bu bir MIL-2 Standart eğri kullanarak yanı sıra bir doz-yanıt eğrisi ile test edilmiş ligand oluşturarak elde edilebilir (değerleri doyurarak söz konusu olduğunda, deneysel parametreleri olarak buna olmalıdır; Örneğin, daha küçük bir hacim süpernatant ELISA tarafından analiz edilmelidir). Bu sistemin başka bir olası sınırlama MIL-BW hücreleri IL-2 salgılanmasını maskeleyeceği 2 (Örneğin, fare T hücreleri) endojen salgıları ile hedef hücreleri kullanmaktır. Fare hücrelere sınırlı olan bu son derece sıra dışı olaylar üstesinden gelmek için bu muhabir sistem değil ifade edilir (Örneğin, GFP) farklı bir muhabir tarafından hedef hücreleri kullanılarak geliştirilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Esther Singer dil düzenleme için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenen / ERC Hibe Sözleşmesi numarası 320473-BacNK. Daha fazla destek ben-çekirdek kromatin ve RNA gen düzenlemesi, GIF Vakfı, Lewis Aile Vakfı, ICRF profesörlük grant ve ben-çekirdek Program planlama ve bütçeleme Komitesi ve İsrail Bilim Vakfı tarafından sağlanan Helmholtz İsrail grant ve Rosetrees güven (tüm O.M.). Bu çalışmada ayrıca İsrail Bilim Vakfı (grant 502/15), Kass tıbbi araştırma Ödülü ve İsrail toplum Hematoloji ve transfüzyon tıbbı araştırma hibe (S.E için) desteklenen bir durumdu. O.M moleküler İmmünoloji Crown profesörüdür.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |