Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

doi: 10.3791/58685 Published: January 7, 2019

Summary

Bu iletişim kuralı tanımlamak ve reseptör-ligand etkileşimleri ölçmek için kullanılan bir muhabir sistem kurmak açıklar.

Abstract

Reseptörleri ve ligandlar arasındaki etkileşimler bir temel biyolojik süreç oluşturmaktadır. Ancak, doğrudan hızlı yerel reseptör hücreleri ile deneyler ve ligand zorlu beri belirli bir reseptör ligand bilinmeyen olabilir ve deneysel yordamlar yerel ligand ile teknik karmaşık olabilir. Bu engelleri gidermek için bağlama ve belirli bir reseptör aktivasyonu faiz bir ligand tarafından tespit etmek için bir muhabir sistemi açıklanmaktadır. Bu muhabir sisteminde, ekstrasellüler etki alanı belirli bir reseptör fare CD3ζ Birleşik ve bu chimeric protein sonra fare BW hücrelerde ifade edilir. Bu transfected BW hücreler daha sonra farklı hedefler (Örneğin, hücreleri veya antikorlar) ile inkübe. Transfected reseptör aktivasyonu enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından tespit edilebilir fare interleukin-2 (MIL-2) salgılanmasını yol açar. Bu muhabir sistem hassas ve belirli bir tek takımı olmanın avantajı vardır. Buna ek olarak, belirli bir reseptör aktivasyon düzeyini kolayca sayılabilir ve reseptör ligand bilinmeyen nerede durumlarda bile kullanılabilir. Bu sistem birçok reseptör-ligand etkileşimleri karakterize etmek için çalışmalarımız başarıyla uygulanmıştır. Biz son zamanlarda insan Fcγ reseptörleri (FcγRs) etkinleştirme klinik kullanımda farklı monoklonal anti CD20 antikorları tarafından çalışma için bu sistemi istihdam.

Introduction

BW muhabir reseptör-ligand etkileşimleri1için bir yüntem sistemidir. Bu sistem belirli bir reseptör ligand bilinmiyor veya endojen ligand ile deneyler Teknik olarak zor özellikle avantajlıdır. Ayrıca insan FcγRs monoklonal antikorlar bağlama eğitimi için kullanılabilir. Bu yöntem chimeric bir proteinin fare BW hücrelerdeki ifade üzerinde dayanır. Bu chimeric proteinin fare ζ zinciri transmembran ve hücre içi etki erimiş faiz reseptör ekstrasellüler etki alanı oluşur. Bağlama uygun ligandlar reseptör, ELISA, Şekil 1' de gösterildiği gibi kolayca algılanabilir fare IL-2 salgılanmasını yol açar. Bu yöntem duyarlı ve özel bireysel bir reseptör, kullanımı kolay ve son derece tekrarlanabilir. Böylece reseptör-ligand etkileşimleri çalışmak için ek araçlar tamamlayabilir. Örneğin, (ligand kendisi değil tespit edilmiş olsa bile) bir ligand için belirli bir reseptör varlığı için birden fazla hücre satır ekran veya monoklonal antikorlar veya insan serumu anti-viral içeren insan FcγRs aktivasyonu algılamak için kullanılabilir antikorlar. Birincil bağışıklık hücrelerinin endojen FcγRs hızlı ve genellikle birkaç Fc reseptörü hızlı işlemek genellikle zor olmakla birlikte.

Biz bu sistemi başarıyla çalışmalarımız çoğunda reseptör-ligand etkileşimleri karakterize etmek için kullandık. Bu haemagglutinin PVR ve nectin-2 ligandlar insan ve fare TIGIT3,4, tanımlayan NK hücre reseptör NKp462, ligand olarak tanımlayan içerir ve bu fusobacterium nucleatum gösterilen bakteri bağlar ve insan TIGIT5etkinleştirir. Buna ek olarak, Fc reseptör hızlı BW hücreleri hastaların sera6,7,8' Anti-yayılmacı antikorlar algılamaya başarıyla kullanılmıştır. Özellikle, son zamanlarda fark FcR harekete geçirmek anti CD20 antikor kronik lenfositik lösemi (CLL)9tedavisinde kullanılan algılamaya insan FcγRs hızlı BW hücreleri kurulmuş. Önemlisi, BW muhabir sistemi sonuçlarını tamamlayıcı deneylerde doğrulanmış.

Protocol

1. nesil Chimeric oluşturmak ifade eder bir plazmid

Not: Amacı fare CD3ζ zinciri (Şekil 2A) transmembran ve hücre içi etki erimiş faiz reseptör ekstrasellüler etki alanını ifade eder bir plazmid üretmektir.

  1. Ekstrasellüler etki alanı da dahil olmak üzere sinyal peptid reseptör dizisi almak. Bu reseptör (Örneğin, cDNA veya bir plazmid) hızlı beklenen DNA malzemesi elde etmek.
  2. Transmembran ifade DNA malzeme ve fare CD3ζ zinciri hücre içi etki elde edilir (Örn., cDNA veya bir plazmid).
  3. Şekil 2Agösterilen genel yapısına göre füzyon protein dizi tasarlayın. Tüm sıra aynı kodon okuma çerçevesi içinde olduğundan emin olun. Bu sırası uygun astar tasarım ve nihai ürün doğrulamak için kullanılır.
  4. Her bir füzyon protein parçaları ayrı ayrı yükseltmek için iki PCR reaksiyonları tasarım (Şekil 2B, 2 C)10.
    Not: Belirli koşullar için PCR reaksiyonları (Örn., uzama saat ve sıcaklık tavlama) belirli bir reseptör için tasarlanmıştır astar niteliğine bağlıdır.
    1. Reseptör ekstraselüler segment yükseltmek.
      1. Sinyal peptid reseptör, Kozak fikir birliği sıra ve bir uygun kısıtlama sitesi (Şekil 2B) bir bölümü içeren bir 5' astar tasarım.
      2. Füzyon proteini (Şekil 2B) her iki kesiminde yamaçlarında bir 3' astar tasarım. Örneğin, ilk tasarım için bu ilk 3' son 20 baz çifti reseptör ekstraselüler segment ve CD3ζ parçasının ilk 9 baz çifti içerebilir.
        Not: Bu ilk yuvarlak sıra oluşturmak için kullanılan ve ligasyonu için kullanılmaz beri 3' astar için kısıtlama site eklemek için gerek yoktur.
    2. CD3ζ segment yükseltmek.
      1. Hangi füzyon proteini (Şekil 2C) her iki kesiminde yanları 5' astar tasarım. Örneğin, ilk tasarım için 5' astar reseptör ekstraselüler segment ve ilk 20 baz çifti CD3ζ parçasının son 9 baz çifti içerebilir.
        Not: Bu ilk yuvarlak sıra oluşturmak için kullanılan ve ligasyonu için kullanılmaz beri 5' astar için kısıtlama site eklemek için gerek yoktur.
      2. Bir uygun kısıtlama sitesi (Şekil 2C) yanı sıra, CD3ζ sıra sonuna içeren 3' astar tasarım.
    3. Tavlama sıcaklığı her çift (füzyon proteinin iki bölümden sıraları içerir, astar, yalnızca her tepki dizisinin parçası ile anneals Not) benzer olması her iki bu tepkiler bir astar serilerinde düzeltin.
  5. İlk iki reaksiyonlar PCR ürünlerinin karışımından 5' primer hücre dışı reseptör segmentin (adım 1.4.1.1) ve 3' CD3ζ segmentin (adım 1.4.2.2) (Şekil 2B)10 ile DNA şablon olarak kullanıldığı bir ek PCR gerçekleştirmek . Bu reaksiyon son yuvarlak sıra oluştursun.
  6. Her zamanki gibi kopyalamaya devam edin.
    1. Hedef (hedef vektör G418 ve ampisilin direnci ifade pcDNA3 öyledir) vektör kesmek son PCR ürünü ligate.
    2. Ve birleştirilmiş vektör yetkili bakteri11dönüştürmek.
      1. Buz üzerinde yetkili bakterilerin 50 µL çözülme.
      2. Ve birleştirilmiş vektör için bakteri ekleyin ve 20 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
      3. 45 için 42 ° C'de kuluçkaya s.
      4. Antibiyotikler olmadan lb 200 µL ekleyin.
      5. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile 1 h için kuluçkaya.
      6. Tohum (Örneğin, ampisilin çözüm 0.1 mg/mL nihai bir konsantrasyon ile) uygun antibiyotiklerle LB plaka üzerinde.
    3. Toplamak ve çeşitli bakteri koloniler halinde 5 mL lb (15 mL tüpler) büyümek.
    4. Ertesi gün, plazmidleri ile mini bir hazırlık seti ayıklayın.
    5. Gen ekleme enzimleri ile analiz.
    6. İlgili kolonileri serisi ve sırası ve okuma çerçevesi (adım 1. 3'belirtildiği gibi) doğru olduğundan emin olun.
  7. Doğrulanmış plazmid yetkili bakteri11dönüştürmek.
    1. Buz üzerinde yetkili bakterilerin 20 µL çözülme.
    2. Plazmid 1 µL için bakteri ekleyin ve 20 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
    3. 45 için 42 ° C'de kuluçkaya s.
    4. Antibiyotikler olmadan lb 200 µL ekleyin.
    5. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile 1 h için kuluçkaya.
    6. Tohum (Örneğin, ampisilin çözüm 0.1 mg/mL nihai bir konsantrasyon ile) uygun antibiyotik bakteriyel büyüme tabakta.
  8. Ertesi gün, 0.1 mg/mL ampisilin (~ 250 mL) ile büyük bir LB konteyner bakteriyel bir koloni büyümek.
  9. Ertesi gün, maxi hazırlık seti tarafından sağlanan özel yönergelere göre gerçekleştirin.
    Not: Elektroporasyon yordamı için plazmid büyük miktarda, aşağıda ayrıntılı olarak gereklidir.

2. transfection BW hücrelere Chimeric Protein ifade plazmid

Not: Farklı yöntemleri de transfection için istihdam (Örn., lentiviral enfeksiyon tarafından). Elektroporasyon önce aşağıda açıklandığı gibi DNA'ın etanol yağış gerçekleştirin. Sonraki adımlar için steril koşullar gerekir.

  1. Bir gün önce BW5147 hücreler ("BW hücreleri") adım için hazır olun. RPMI % 10 fetal buzağı serum (FCS), % 1 Sodyum pyruvate, %1 L-glutamine, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1 ile takviye ile 100.000 BW5147 hücre/mL (Yani, toplam 10 x 106 hücre) 10 mL ile (10 cm) 10 plakaları plaka penisilin-streptomisin ("tam orta").
  2. Füzyon proteini bir 1,5-2 mL tüp ifade pcDNA3 plazmid 100 µg yerleştirin ve 3 M sodyum asetat 5.3-5,5 pH ekleyin. Sodyum asetat hacmi 100 µg plazmid hacmi 0,1 (% 10) karşılık gelmelidir; ekleyerek NaOH veya HCl pH metre ile pH sodyum asetat titre.
  3. %2.5 100 etanol hacimleri plazmid ve sodyum asetat karışıma adım 2.2 (2. 5 x plazmid ve sodyum asetat hacmi) açıklandığı gibi ekleyin. Gecede-20 ° c veya 70 ° C'de 2 h için kuluçkaya
  4. 2.4. 24 BW hücreleri kaplama sonra h toplamak tüm BW hücrelerde (~ 100 mL) 2 50 mL tüpler. Hücreler için 515 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Her iki tüpler üzerinden Pelet 25 ml RPMI - tek 50 mL tüp içinde yeniden askıya alma. Örneğin, bir tüp Pelet RPMI - 25 mL ile yeniden askıya alma ve böylece toplam Pelet BW hücrelerden ortamda tek bir tüp 25 ml yeniden askıya sıvı diğer 50 mL tüp yeniden askıya almak bu sıvı kullanın.
    Not: serum Elektroporasyon ile etkileşebilir beri orta eklemeler olmalıdır.
  6. Hücreleri vasıl 515 x g5 min için tekrar santrifüj kapasitesi. Pelet 1 mL RPMI yeniden askıya alma ve içeriği 0.4 cm küvet için buza aktarın.
  7. 16.000 x g ve 4 ° c'de 30 dk için etanol yağış (adım 2.3) uygulandı plazmid santrifüj kapasitesi
  8. Bir kez 1 mL % 70 etanol ve santrifüj 16.000 x g ve 4 ° C (tuz yıkamak için), başka bir 20 dakika yıkayın.
  9. Tüm etanol kaldırmak ve biraz kuru Pelet izin (Yani, doku kültürü başlıklı açık bir tüp içinde). RPMI-daha önce 60 ° C'ye ısıtılmış 100 µL ile Pelet yeniden askıya alma
  10. Küvet hücrelerde yeniden askıya alınmış plazmid (adım 2.8) ekleyin ve buz üzerinde 5 min için kuluçkaya.
  11. Electroporate hücreleri 0,23, kV, 250 capacitation. Bu ~ 4 ms almalıdır.
  12. Electroporated hücreleri 50 mL tüp transferi, 515 x g. tam orta ve 5 min için santrifüj 50 mL ekleyin
  13. Süpernatant atın ve tam orta 50 mL içeren hücreleri yeniden askıya alma.
  14. 24-şey kültür yemekleri (Evet, ~ 50 kuyu toplam başına 1 mL) electroporated hücrelerde plaka ve 37 ° C ve % 5 CO2 48 h için kuluçkaya.
  15. Antibiyotik transfected bulunduğu hücreleri seçin. 48 h ekledikten sonra tam orta 10 mg/mL G418 her şey ile takıma 1 mL (Bu aşamada her son hacim de 2 mL ve G418 son konsantrasyonu her şey 5 mg/mL).
    Not: plazmid farklı antibiyotik direnci içeriyorsa, önce bu adımı untransfected BW hücreleri öldürmek için gerekli antibiyotik konsantrasyonu belirlemek.
  16. Her 48 h, dikkatli atmak her şey üst hacminin 1 mL su kuyusunda orta karıştırma olmadan (BW hücreleri kuyunun dibinde olma eğilimi). Her şey son hacim tekrar 2 ml'dir tam orta ile 5 mg/mL G418 her şey, takıma ekleyin.
  17. Kültür plakalar hücre büyümesini bütün Wells için düzenli olarak inceleyin.
    Not: Orta sarı renk değişikliği büyüyen hücreleri tanımlamak yardımcı olabilir; Ancak, başlangıçta orta G418 nedeniyle sarı olacak kendisi. Pozitif wells (hücreleri büyüyen ile kuyu) tanımlayın. Bu kuyu G418 dayanıklı olduğunu ve bu nedenle füzyon protein Hızlı bekleniyor. Bu işlem genellikle ~ 3 hafta sürer.

3. Transfected reseptör pozitif Wells hücrelerdeki ifade doğrulama.

  1. Transfected reseptör karşı spesifik bir antikor transfected BW hücrelerle leke.
  2. Akış Sitometresi kontrol hücreleri (untransfected BW hücreleri) ifade tarafından reseptör ifade düzeyini karşılaştırın.
  3. Doğrulama bir veya daha fazla Wells sonra hücreleri hemen Deneysel amaçlar için kullanmak, kültür içinde büyümek veya gelecekteki uygulamalar için dondur.
  4. Transfected reseptör ifade yeni bir deneme yapmadan önce doğrulayın. Büyüme, G418 hücrelerle istikrarlı reseptör ifade ile birkaç hafta sonra G418 kültür ortamından atlanabilir.

4. kuluçka hedefleri olan Transfected BW hücrelerinin

Not: transfected BW hücreleri ilk kez kullanırken, bu bilinen bir ligand faiz reseptör hızlı hedefler veya özellikle faiz (cross-linking reseptör karşı yönetmen plaka bağlı antikor test etmek için tercih edilir deneyler; aşağıya bakın, 4.2.1.3 Bölüm).

  1. Tercihen, BW hücreleri deneme önce 24 saat (örneğin, 10 mL tam orta hücre kültüründe yeni bir 10 cm kültür plaka 2 mL ekleyerek) bölün.
  2. Hedeflerine transfected BW hücrelerle kuluçkaya. Deney aynı anda boş bir vektör (veya ebeveyn BW hücreleri) hızlı kontrol BW hücreleri üzerinde gerçekleştirin. 96f plakaları tercih edilir (ama 96U tabaklar da kullanılabilir). Deneme nüsha gerçekleştirin. Tam orta tüm hücrelerde askıya alma.
    1. Hedefleri hazırlamak. Hedef türü amacı bir fonksiyonu olarak değişir ve hücreler, antikorlar veya antikor yalnız önceden inkübe hücre olabilir. Bu sistem ayrıca bakteri ile hedefleri5olarak kullanılmıştır.
      1. Hedef hücre (Yani, hücre satır) bölünmesi, onları önce tahlil 6000 rad, ışınlatayım. 96 bir tabak (içinde 100 µL hacmi) tek bir kuyu hedef hücrelerde yer 50.000.
      2. Antikorlar ve insan FcγRs, hızlı BW hücreleri ile deneyler kuluçkaya için buz 96 iyi plaka üzerinde bir antikor içeren hedef hücreleri (örneğin, hedef hücre 50 µL ve antikor; 50 µL için farklı antikor doz test edilebilir).
      3. Antikorlar yalnız (cross-linking deneyler) hedef olarak kullanılıyorsa, plaka bağlı olması. Bu amaçla, ilk 96F plaka (tipik bir başlangıç dozu 50 μL, spesifik bir antikor 0.5 μg) 37 ° C ve % 5 CO2 1-2 h için tam bir ortamda antikorlar kuluçkaya. İlişkisiz antikorlar kaldırmak için plaka yıkayın.
        Not: Bu durumda, ek transfected BW hücre sonra transfected reseptörü harekete geçirmek yol açacak plaka, antikor bağlanması 96F plaka sağlayacaktır.
    2. BW hücreler (efektör hücreleri) ekleyin. 50.000 BW hücreleri 96 bir tabak (içinde 100 µL hacmi) tek bir kuyu yerleştirin.
    3. Her şey için 200 µL gerekirse hacmindeki tamamlayın.
    4. Plakayı 37 ° C ve % 5 CO2 48 h (Bu süre kalibre) için kuluçkaya.
  3. 48 saat sonra plakaları-20 ° C ve tezcan ELISA önce dondurma veya hemen ELISA için kullanın (sonraki adımlara bakın).

5. ELISA

  1. Kat anti-fare IL-2 antikoru (anti-mIL-2) ile bir ELISA plaka. MIL-2 0,05 µg 1 x PBS iyi başına 50 µL hacmi yerleştirin. Gecede 4 ° C'de veya 37 ° c 2 h için mIL-2 antikor kaplı ELISA plakalı kuluçkaya.
    Not: ELISA kuluçka adımdan sonra gerçekleştirmek için ELISA plaka 24 h BW hücreleri kuluçka süresi sona ermeden kaplı olması.
  2. ELISA plaka sıvı atın ve 1 x PBS ve % 1 sığır serum albumin (BSA) oluşan bir engelleme çözüm (iyi başına 200 µL) ekleyin. Oda sıcaklığında 2 h ELISA plaka kuluçkaya.
  3. ELISA plaka üç kez % 0.05 PBS ara çözüm (Yani, ara-20 0.5 mL 1 x PBS 1 litre) ile yıkayın.
  4. Hedeflerine (4.3) ile inkübe BW hücreleri olan 96 plaka almak. Plaka donmuştu, tamamen çözülme (Örn., kısa kuluçka 37 ° c). 96 plaka (5 dk, 515 x g) santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde önceden kaplanmış ve engellenen ELISA plakasına 100 µL süpernatant her iyi bir transfer.
    Not: Süpernatant hücreleri alarak önlemek için her şey iki tarafından toplanmalıdır.
  5. İstenirse, tanımlanmış konsantrasyonları ile rekombinant MIL-2 MIL-2 standart bir eğri oluşturmak için kaplamalı ELISA plaka boş satırlardan birine ekleyin. Örneğin, başlangıç 2.500 pg/mL bir MIL-2 konsantrasyon ve sonraki her şey 50 oranında azaltmak; MIL-2 son şey eklemeyin.
  6. ELISA plaka gecede 4 ° C'de veya 37 ° c 2 h için kuluçkaya.
  7. ELISA plaka dört kez PBS ara doldurma ile yıkama.
  8. Biotin Anti-fare IL-2 ELISA plakasına ekleyin. 1 x PBS % 1 BSA ile 1 ml 1 µg antikor bir konsantrasyon kullanın ve iyi ücret 100 µL bölün.
  9. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  10. ELISA plaka altı kez PBS ara doldurma ile yıkama.
  11. Birleşik HRP streptavidin ekleyin. PBSX1% 1 BSA ile 1 ml 1 µL streptavidin bir konsantrasyon kullanın ve iyi ücret 100 µL bölün.
  12. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  13. ELISA plaka altı kez PBS ara doldurma ile yıkama.
  14. TMB substrat çözeltisi kuyu başına 100 µL ekleyin. Hızlı bir şekilde zaman TMB eklerken gecikme nedeniyle wells arasındaki farklar en aza indirmek için bu adımını tamamlamak.
  15. ELISA plaka 650 bir ELISA plaka okuyucu ile okumak nm (okuma olabilir sinyal zayıf olup olmadığını tekrar).

Representative Results

Şekil 3 BW muhabir sistemi ile bir denemenin sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, CLL hücreler farklı anti-CD20 antikorları (rituximab ve obinutuzumab) önceden inkübe ve CD16a-CD3ζ hızlı transfected BW hücreleri ile birlikte inkübe. Bizim çalışma9' benzer deneyler yapılmıştır. Şekil 3A nerede renk yoğunluğu MIL-2 bir konsantrasyon için karşılık gelen bir ham ELISA plaka görüntüsünü sunar. Deneme nüsha gerçekleştirildi. Bu deney birden çok denetimi dahil: ebeveyn untransfected BW hücreleri (üst satır) ve CLL hücreleri ile inkübe CLL hücreleri inkübe CD16a-CD3ζ hızlı BW hücreleri ile ama bir antikor olmadan veya bir denetim antikor (Soldaki ikinci sırada altı kuyuları) . Kuluçka CD16 anti CD20 antikorları ile önceden inkübe CLL hücreleri ile ifade edilen BW hücre MIL-2 kontrol wells MIL-2 seviyesine göre önemli bir salgısı indüklenen. Önemlisi, anti CD20 obinutuzumab ile CLL hücrelerin ön kuluçka CD16 rituximab, hangi sistemimiz tarafından recapitulated bulma bilinen bir daha güçlü aktif. Son satırı önceden tanımlanmış rekombinant MIL-2 (ek hücre) olmadan konsantrasyonları azalan gösterir. Son satır sağ kuyuda MIL-2 sahip değil ve denetim wells için benzer görünür arka plan okuma temsil eder. Şekil 3B Şekil 3Aiçinde gösterilen ELISA plaka sonuçlarını miktar sunar. Optik yoğunluk (OD) düzeyleri rekombinant MIL-2 Standart eğri dayalı MIL-2 konsantrasyonları içine dönüştürüldü. Şekil 3 c nerede farklı dozda kullanımının antikorlar önceden CLL hücreleri ile inkübe ve CD16 ifade BW hücreleri ile inkübe bir doz yanıt deneme sunar.

Figure 1
Şekil 1: BW muhabir sisteminin şematik Gösterim. BW5147 hücreleri stabil fare CD3ζ zinciri (chimeric recptor-CD3ζ) transmembran ve sitoplazmik etki erimiş farklı reseptörlerinin ekstraselüler kısmı ile transfected. ELISA tarafından tespit edilebilir MIL-2 salgılanmasını ligand sonuçlarında tarafından belirli bir reseptör CD3ζ aktivasyonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: chimeric reseptör CD3ζ ve PCR astar tasarım yapısı. (A) hücre dışı bir reseptör genel yapısını fare CD3ζ transmembran ve hücre içi etki erimiş. (B) reseptör ekstrasellüler etki de dahil CD3ζ nükleotit bir 3' astar ile güçlendirilmiş. (C) CD3ζ hücre içi ve transmembran etki de reseptör nükleotit dahil bir 5' astar ile güçlendirilmiş. (D son PCR reaksiyon) dizileri örtüşen var, her iki kesimli DNA şablon olarak kullanılmıştır. Tüm şekil panellerinde farklı protein etki alanları renk kodlu ve mavi dikdörtgenler (CD3ζ dizisi) ve kırmızı dikdörtgenler (reseptör dizisi) kutulu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: BW muhabir sisteminin nihai ürünün illüstrasyon. (A, B, C) CLL hücreleri veya iki anti-CD20 antikorları (rituximab ve obinutuzumab) veya bir denetim antikor olmadan önceden inkübe edildi. Daha sonra antikor bağlı hücreler ebeveyn BW hücreleri veya CD16a-CD3ζ hızlı BW hücreleri ile inkübe. MIL-2 süpernatant'düzeyini ELISA tarafından tespit edilmiştir. (A) bir ham ELISA plaka görüntüsünü. Renk yoğunluğu MIL-2 süpernatant'konsantrasyon gösterir. Deneme nüsha gerçekleştirildi. Alt satır ELISA okuma hangi aynı plaka analiz edildi rekombinant MIL-2 konsantrasyonları göre azalan düzende gösterir. (B) (A) gösterilen okuma ELISA miktar. MIL-2 düzeyleri MIL-2 standart bir eğri kullanılarak hesaplanır. (C) A doz yanıt deneme nerede farklı dozda kullanımının antikorlar önceden CLL hücreleri ile inkübe ve CD16a-CD3ζ ifade BW hücreleri ile inkübe. , P < 0,001; Öğrenci t testi (B) veya ANOVA ile birden fazla karşılaştırmalar (C). (C) önemli ölçüde farklı değildi tek karşılaştırmada rituximab ve ilk konsantrasyonu (0.01 µg/mL) Ab denetiminde içindi. Hata çubukları triplicates standart sapması temsil eder. Benzer denemeleri parçası bizim son çalışma9biri olarak yapılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

(Bkz: Bu protokol1için kısaltılmış bir şeklinde) reseptör-ligand etkileşimleri araştırmak için bir muhabir sistemi oluşturmak için bir iletişim kuralı mevcut burada. Protokol üç ana bölümden oluşur: belirli bir reseptör ekstrasellüler etki alanı içeren bir chimeric protein, klonlama erimiş CD3ζ, transfection füzyon protein BW hücrelere ifade eder bir plazmid, hücre içi etki alanına (Örneğin , Elektroporasyon tarafından), fare IL-2 tarafından ELISA ve nicel tespit. Nihai ürün bölümleri, bağımsız doğrulanması gerekir: klonlama işlemini tam sıralama hedef plazmid füzyon proteinin tarafından doğrulanması gerekir, BW hücre transfection ifadesi inceleyerek doğrulanması gerekir reseptör BW hücreleri (Örneğin, akış sitometresi tarafından) ve ELISA işleminin ilgi genel olumlu denetimleri (Örneğin, rekombinant MIL-2) yanı sıra transfected BW hücreler için belirli denetimleri ile doğrulanması gerekir; Yani, faiz (Örneğin, hücreler NK hızlı BW hücre reseptör 2B4 hücre için hızlı CD48 olumlu bir denetim kullanılabilir) reseptör bilinen bir ligand hızlı hedefler. Örneğin, klonlama işlemini başarılı olabilir, ancak füzyon protein BW hücreleri tarafından ifade değil. Bu durumda, adım yinelenmelidir. Alternatif olarak, ELISA plaka arka plan seviyesinin üzerinde sinyal yok ise (özellikle olumlu denetimleri için) transfected BW hücre reseptör ifade etmek başarısız olmuş olabilir (veya ifade kayboldu) veya teknik bir sorun sırasında oluşmuş olabilir ELISA işlemi.

Yordamı genel prensipleri koruyarak bu iletişim kuralı için birkaç değişiklik yapılabilir. Bu değişiklikler füzyon protein, plazmid BW hücreleri ve kuluçka ve hedef (Örneğin, hücreleri, antikor, vb), türü gibi ELISA ile ilgili belirli parametreleri için transfecting yöntemini ifade etmek için kullanılan vektör içerir , hedef hücreleri veya antikor konsantrasyon ilgili olması durumunda (iyi ve 0,5 µg/iyi doz başlayan bir antikor başına 50.000 hücreleri kullanın), kuluçka süresi (kullandığımız bir kuluçka süresi 48 saat) ve ELISA plakasına transfer süpernatant birim.

Bu yöntem duyarlıdır belirli ve kolayca sayılabilir. Ligandlar belirli reseptörleri için varlığı için (özellikle ligand kendisi değil kabul edilmiştir eğer) eleme için idealdir. Belirli bir reseptör hızlı transfected BW hücreleri hazırladıktan sonra bu hücreler donmuş ve ek deneyler için gerektiğinde kullanılır. Biz ve diğerleri bu sistem başarıyla önceki çalışmalarda reseptör-ligand etkileşimleri (örneğin2,3,5,12,13,14 keşfetmek için kullanılır 15,16) ve bu sistem tarafından elde edilen sonuçlar diğer teknikleri tarafından doğrulanmıştır. Bu yöntem de farklı insan FcγR reseptörlerinin aktivasyonu çalışmaya anti-viral karşı antikorlar serum6,7,8 veya monoklonal antikorlar karşı CD20 ile yaptığı gibi antikorlar tarafından kullanılabilir 9.

Bu, yalnızca hücre dışı segment reseptör ifade edileceği bir muhabir sistemi olduğundan, bu sistem tarafından elde edilen bulgular sitotoksisite deneyleri doğal gibi endojen reseptör ile ek deneyler tarafından tamamlanmalıdır NK ile etkileşimleri çalışmaya katil (NK) hücre reseptörleri hücre. Ayrıca, belirli ligand/reseptör etkileşim bir MIL-2 salgı muhabir sistem tarafından neden olabilir değil ve bu nedenle gözden. Buna ek olarak, herhangi bir deneysel Kur olduğu gibi sonuçlar için çeşitli parametreler yukarıda açıklandığı gibi doğrulanması gerekir. Bu iki koşul karşılaştırılması gereken (Örneğin, farklı antikor tarafından aynı Fc reseptör aktivasyonu) olduğu durumlarda özellikle önemlidir. Bir belirli ligand-reseptör etkileşimini duyarlılığını sisteminin doğrusal aralığı içinde olduğunu doğrulamak önemlidir. Aksi takdirde bu geçerli bir karşılaştırma koşulları engel doygunluk değerleri neden olabilir. Bu bir MIL-2 Standart eğri kullanarak yanı sıra bir doz-yanıt eğrisi ile test edilmiş ligand oluşturarak elde edilebilir (değerleri doyurarak söz konusu olduğunda, deneysel parametreleri olarak buna olmalıdır; Örneğin, daha küçük bir hacim süpernatant ELISA tarafından analiz edilmelidir). Bu sistemin başka bir olası sınırlama MIL-BW hücreleri IL-2 salgılanmasını maskeleyeceği 2 (Örneğin, fare T hücreleri) endojen salgıları ile hedef hücreleri kullanmaktır. Fare hücrelere sınırlı olan bu son derece sıra dışı olaylar üstesinden gelmek için bu muhabir sistem değil ifade edilir (Örneğin, GFP) farklı bir muhabir tarafından hedef hücreleri kullanılarak geliştirilebilir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar Esther Singer dil düzenleme için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenen / ERC Hibe Sözleşmesi numarası 320473-BacNK. Daha fazla destek ben-çekirdek kromatin ve RNA gen düzenlemesi, GIF Vakfı, Lewis Aile Vakfı, ICRF profesörlük grant ve ben-çekirdek Program planlama ve bütçeleme Komitesi ve İsrail Bilim Vakfı tarafından sağlanan Helmholtz İsrail grant ve Rosetrees güven (tüm O.M.). Bu çalışmada ayrıca İsrail Bilim Vakfı (grant 502/15), Kass tıbbi araştırma Ödülü ve İsrail toplum Hematoloji ve transfüzyon tıbbı araştırma hibe (S.E için) desteklenen bir durumdu. O.M moleküler İmmünoloji Crown profesörüdür.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit Bioneer K-3030
Anti-mouse IL-2 BioLegend 503702
Biotin anti-mouse IL-2 BioLegend 503804
ELISA plates De-groot 60-655061
Fetal Bovine Serum Sigma F7524-500ml
G418 Mercury MBS3458105GM
Gene Pulser II Bio-Rad 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-Glutamine Biological industry 03-020-1B
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Biological industry 01-340-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological industry 03-031-1B
peroxidase streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-030-084
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit ThermoFisher Scientific K210016
RPMI-1640 Medium Biological industry 30-2001
Sodium Pyruvate Biological industry 03-042-1B
TMB SouthernBiothech 0410-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
  2. Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409, (6823), 1055-1060 (2001).
  3. Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (42), 17858-17863 (2009).
  4. Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. (2013).
  5. Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42, (2), 344-355 (2015).
  6. Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387, (1-2), 21-35 (2013).
  7. Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205, (5), 409-424 (2016).
  8. Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7, (1), 6054 (2017).
  9. Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7, (6), e1428158 (2018).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  11. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  12. Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91, (19), (2017).
  13. Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195, (8), 3959-3969 (2015).
  14. Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38, (6), 1223-1235 (2013).
  15. Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11, (2), 121-128 (2010).
  16. Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110, (7), 943-953 (2002).
Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).More

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter