Questo protocollo dimostra la capacità di utilizzare la stampa a getto d’inchiostro reattiva per stampare micro-agitatori biocompatibili e rispettosi dell’ambiente per l’uso in applicazioni biomediche e ambientali.
In questo studio, viene segnalato un protocollo per l’utilizzo della stampa inkjet reattiva per fabbricare nuotatori di seta a propulsione enzimica con forme ben definite. I dispositivi risultanti sono un esempio di oggetti semoventi capaci di generare movimento senza azionamento esterno e hanno potenziali applicazioni in medicina e scienze ambientali per una varietà di scopi che vanno da micro-agitazione, mirato erogazione terapeutica, alla bonifica dell’acqua (ad esempio, pulizia delle fuoriuscite di olio). Questo metodo utilizza la stampa a getto d’inchiostro reattiva per generare strutture di seta solida su piccola scala ben definite convertendo la fibroina di seta rigenerata idrosolubile (seta I) in fibroina di seta insolubile (seta II). Queste strutture sono anche selettivamente drogato in regioni specifiche con la catalasi enzimatica al fine di produrre movimento attraverso la generazione di bolle e distacco. Il numero di strati stampati determina la struttura tridimensionale (3D) del dispositivo, e così qui viene riportato l’effetto di questo parametro sulle traiettorie propulsiva. I risultati dimostrano la capacità di sintonizzare il movimento variando le dimensioni delle strutture stampate.
I micro-agitatori artificiali semoventi (spmss) impiegano una varietà di meccanismi di propulsione per produrre movimento, che può essere classificato come propulsione chimica1,2,3,4, 5 il , 6 o propulsione esterna fisica. Un meccanismo di propulsione chimica comune è quello di utilizzare l’attività catalitica o enzimatica per generare movimento producendo gradienti o generare bolle che impartiscono slancio all’oggetto quando si staccano. Studi precedenti hanno indagato diversi spsm catalitici e chimici, tra cui perle di polistirolo con nanoparticelle di platino e cromo adsorbente sulla superficie1, oro-platino bimetallico Janus nano-aste2, magnesio Janus Micro-agitatori3, micro-agitatori costituiti da un nucleo di magnesio e guscio di biossido di titanio con nanoparticelle d’oro incorporate4, e fibin di seta micro-razzi Janus con catalasi incorporati all’interno dello scaffold5. I meccanismi di propulsione fisica includono i sistemi di propulsione magnetici7,8, Optical9e ultrasonici10 , tutti controllati da una fonte fisica esterna. A seconda dell’applicazione prevista, la dimensione SPMS può variare da pochi nanometri a diverse centinaia di micrometri. Esempi di potenziali applicazioni di questi SPMSs summenzionati e altri sono la diagnosi medica di malattie con dispositivi Lab-on-a-chip11, carico e consegna mirata in vivo di terapie12, risanamento ambientale3 (ad es. pulizia delle fuoriuscite di olio) e degradazione fotocatalitica di agenti di guerra chimici e biologici, come Bacillus antracis e agenti nervosi4. Dipendente dall’applicazione di destinazione, è quindi auspicabile essere in grado di produrre SPMSs che subiscono traiettorie specifiche come traiettorie lineari lunghe per le sfide di trasporto o traiettorie rotazionali per applicazioni di micromiscelazione. Il focus qui è sul movimento rotazionale per le applicazioni di agitazione.
Non esiste un unico metodo consolidato per fabbricare SPMSs, ma per applicazioni mediche e ambientali, è essenziale utilizzare un materiale biocompatibile, biodegradabile, ecologico, prontamente disponibile, economico e consente una facile fabbricazione di SPMSs complessi senza richiedere apparecchiature sofisticate. La fibroina di seta rigenerata (RSF) è uno di questi materiali che soddisfa tutti questi parametri insieme ad essere approvato anche dalla Food and Drug Administration (FDA).
La seta è un termine generico utilizzato per diverse proteine Fibbe naturali, di cui, il più comunemente noto è quello fatto dalle larve di falena di seta, Bombyx mori, prima del suo Pupation. Questi bozzoli sono fatti di fibroina, una proteina FIBUS, bloccato insieme con un’altra proteina chiamata sericina. La fibroina di seta (SF) è stata trovata per avere eccellenti proprietà meccaniche, biocompatibilità e biodegradabilità13, il che lo rende una scelta ideale per la fabbricazione di SPMSS. SF esiste in tre forme polimorfiche, vale a dire, seta I, II e III. Silk I è una forma metastabile solubile in acqua contenente principalmente eliche e bobine casuali; la seta II è una forma insolubile in acqua contenente principalmente fogli β antiparalleli di seta cristallizzata; e la seta III è una triplice struttura elicoidale di poliglicina II che esiste nell’interfaccia acqua-aria della soluzione di seta. Simile ad altre proteine Fibbe, SF ha ripetuto unità di sequenze aminoacidiche. Il SF naturale di un bozzolo è costituito da tre principali domini hexapeptide di tali unità ripetute (GAGAGX), mentre X può essere A, S o Y. Attraverso il legame con l’idrogeno, i motivi (GA) n delle strutture in lamiera β antiparallele si accumulano ulteriormente attraverso le forze di Van der Waals e formano le nano cristallizzazioni idrofobiche14,15.
La biocompatibilità può essere ulteriormente migliorata cercando di guidare la propulsione utilizzando enzimi naturali per generare un gradiente di concentrazione o bolle di gas in un mezzo liquido (combustibile). Di conseguenza, in questo studio, l’enzima catalasi viene utilizzato come “motore” per generare propulsione con perossido di idrogeno utilizzato come mezzo di combustibile acquoso. La catalasi è un enzima presente in quasi tutti gli organismi viventi. Catalizza la decomposizione del perossido di idrogeno (H2O2) in acqua e ossigeno16. Il rilascio di bolle di ossigeno dai siti enzimatici degli SPMSs genera una forza sull’oggetto facendolo subire la propulsione nella direzione opposta del rilascio della bolla5 (Figura 1).
In un SPMS pilotato a livello catalizzato, il posizionamento differente del sito catalitico provoca diversi comportamenti di propulsione e traiettorie1. Al perseguimento della generazione di microagitatori efficienti, è quindi necessario fabbricare agitatori con forme geometriche ben definite e posizioni del motore e confrontare i diversi poteri del motore. Qui, per facilitare queste indagini, è descritto come gli SPMSs della fibroina di seta rigenerata sono fabbricati in scala millimetrica utilizzando la tecnologia di stampa a getto d’inchiostro reattivo (RIJ). La stampa a getto d’inchiostro è un metodo senza contatto per la deposizione dei materiali. Questo rende la fabbricazione di piccole strutture complesse con alta precisione nella generazione di varie forme semplice. RIJ si svolge quando due o più materiali di reazione diversi vengono depositati e reagiscono sul substrato per produrre il materiale desiderato. Pertanto, gli SPMSs stampati con un sito di agitatore catalitico fuori centro danno l’asimmetria dell’oggetto che si traduce in movimento rotazionale. Questo approccio rende anche semplice la produzione di micro-agitatori in una varietà di forme e configurazioni di progettazione definite dal computer-aided design (CAD), permettendo così una controllabilità più facile e più accurata sul movimento desiderato durante la pratica Applicazioni. Infine, è dimostrata la capacità di stampare dispositivi con spessori variabili che presentano proprietà di propulsione diverse.
Questo studio fornisce un progetto per la produzione di SPMSs con RSF da micrometro a scala millimetrica. L’uso della tecnologia RIJ per la produzione di micro-agitatori RSF apre la porta per la produzione altamente versatile di micro-Agitatori da materiali come scaffold prodotti in situ o idrogel, che non sono altrimenti in grado di essere depositati o fabbricati attraverso altri mezzi come l’evaporazione. Dopo un’appropriata ulteriore funzionalizzazione (ad esempio, enzimi), questi SPMSs possono essere adatti per la bonifica ambientale3, come la pulizia di tossine biologiche, inquinanti organici, e agenti di guerra chimici e biologici4.
Una caratteristica chiave di SPMSs prodotto in questo protocollo è la capacità di progettare rapidamente e facilmente diverse forme e strutture tramite RIJ di seta drogato con enzimi come catalasi e raggiungere il movimento chimicamente guidato tramite propulsione a bolle5. Questo insieme all’elevata biocompatibilità18 di questi agitatori li rende altamente desiderabile per le applicazioni future sia per le sfide di risanamento dell’acqua, sia per le applicazioni Lab-on-a-chip per i dispositivi di diagnosi medica.
Qui, la capacità di propulsione è dimostrata utilizzando un design semplice linea con una parte del motore stampata sul lato di esso, come mostrato in Figura 1. I puntini rossi rappresentano le parti del motore catalasi drogato catticamente attivi e i puntini blu rappresentano le parti inattive. Per poter generare forme 3D tramite RIJ, è necessario stampare più livelli per generare un’altezza degli assi z. Qui, i numeri di strati depositati su un si-wafer erano 100 e 200. Variando il numero di strati, si può trovare una differenza nella velocità di propulsione/rotazione paragonabile al deposito del doppio della quantità di materiale. Per avere strutture ben definite durante la stampa a getto d’inchiostro, è importante che i parametri di getto corretti siano selezionati per ottenere una gocciolina ben definita come mostrato nella Figura 2. Questi parametri varieranno a seconda dell’inchiostro utilizzato e dei dispositivi di getto. Se l’inchiostro non produce goccioline stabili, l’inchiostro probabilmente non è più adatto per la stampa ed è probabilmente iniziando a trasformarsi in gel. È importante notare che il limite di risoluzione dipende fortemente dalle dimensioni degli ugelli utilizzati e gli ugelli più piccoli consentono una maggiore risoluzione e piccole strutture/particelle stampate.
Un esempio di agitatore di seta stampato RIJ è mostrato in Figura 4, dove la catalasi drogato parte del motore (come indicato dalla regione contrassegnata rosso) può essere visto attaccato al lato del corpo principale (vedere anche lo schema in Figura 1 per i dettagli). Lo scaffold di seta stampato è un materiale che permette alla soluzione di combustibile di diffondersi in tutta la struttura 3D, e quindi bolle di ossigeno si formano durante la decomposizione del perossido di idrogeno via catalasi. Le bolle di ossigeno rilasciate generano pori in scala di micron nella struttura di scaffold di seta come si può vedere confrontando i micrografi SEM prima dell’esposizione al combustibile H2o2 (Figura 5a) e dopo l’esposizione h2o2 ( Figura 5B). Al fine di garantire che il movimento è dovuto alla decomposizione di H2O2 combustibile ma non tensione superficiale guidata tramite il rilascio di PEG400, è importante che gli agitatori siano inizialmente immersi in acqua per un periodo di almeno 10 min e testati in di acqua per il movimento di tensione superficiale prima della propulsione in soluzione di combustibile.
L’uso di PEG400 permette un migliore rilascio di bolle dalla superficie della seta19 come precedentemente spiegato da Gregory et al.5 ma può anche dare origine alla trazione superficiale Spinta propulsione, che può essere auspicabile a seconda dell’applicazione come precedentemente descritto20. Questo secondo meccanismo dà anche l’opportunità di produrre SPMSs con due meccanismi che dipendono dal tempo e possono essere vantaggiosi per alcune applicazioni che, ad esempio, si aspettano un iniziale vigoroso agitazione all’inizio seguita da una lenta continuazione mescolando per lunghi periodi di tempo20.
In conclusione, utilizzando RIJ per produrre autonomi dispositivi semoventi, una vasta gamma di forme e dimensioni può essere facilmente progettato e stampato. La seta come materiale di base per i dispositivi offre l’opportunità di incapsulare facilmente gli enzimi e altre frazioni nelle strutture dando la possibilità di aggiungere funzioni a questi dispositivi.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto della EPSRC tramite la stampa a getto d’inchiostro reattiva di X. Zhao dei premi Silk Materials (EP/N007174/1 e EP/N023579/1), la Fellowship di accelerazione della carriera di S. J. ebbens e la borsa di impatto sulle tecnologie sanitarie (EP/J002402/ 1 e EP/N033736/1). Gli autori ringraziano anche il dottor Qingyou Xia del laboratorio di stato chiave della biologia del genoma di Silkworm, la Southwest University, Cina per la fornitura di bozzoli di seta.
Sodium Carbonate | Alfa Aesar | 11552 | anhydrous, 99.5%, granular |
Calcium Chloride | Fluka Analytical | C1016 | anhydrous, >93%, granular |
Ethanol | Fisher Scientific | 10542382 | HPLC grade |
PEG-400 | Aldrich Chemistry | 202398 | average Mn 400, tetramer mol wt ~250 kDa |
Catalase | Sigma Life Science | E3289 | >20K units |
Methanol | Acros Organics | 268280025 | HPLC grade |
Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | 31642 | 30% (w/w) |
Silk | Southwest University, China | NA | Raw Cleaned Silk Cocoons, Bombox Mori |
Dialysis Tubes | Sigma Aldrich | D9777 | Cellulose, avg, flat width 25 mm, Typical molecular weight cut-off = 14000 |
Fisherbrand Hoffman Clips | Fisher Scientific | 12744396 | Clips used to close the ends of the dialysis tubes |
Si-Wafer | Sigma Aldrich | 647535 | Used as printing substrate |
Balance | OHAUS Pioneer | PA214C | Analytical Balance |
Conductivity meter | Mettler Toledo | FG3 | Mettler Toledo FiveGo Portable conductivity meter |
Centrifuge | Thermo Scientific | 10355052 | Heraeus Biofuge fresco sold by Thermo Scientific |
Hotplate | Stuart | US152 | Stuart US152 Magnetic Stirrer |
Camera | PixeLink | PL-D732CU-T | High Speed Colour Camera |
Lens | Navitar | Navitar 1-60135 | Macro Zoom Lens |
Jetting Devices | Microfab Technologies Inc. | MJ-AT-01-40-8MX | 80um nozzle diameter Jetting device |
MJ-AT-01-80-8MX | 80um nozzle diameter Jetting device | ||
Lightpad | AGPTEK | UN-HL0245-EUUN | Light for the swimming experiment |
Pipettors | Eppendorf | 3123000063 | single-channel, variable, 100 – 1,000 µL, blue |
3123000055 | single-channel, variable, 20 – 200 µL, yellow | ||
Microscope | Nikon | LV100ND | Manual, upright microscope |
SEM | Fei | F50 | Used for Scanning electron micrographs |