Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos

doi: 10.3791/59638 Published: May 14, 2019

Summary

Descrevemos um protocolo para a precipitação e caracterização de cristais de carbonato de cálcio que se formam na presença de biopolímeros.

Abstract

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. É um processo complexo e, portanto, um sistema simples, in vitro, é necessário para compreender o efeito de moléculas isoladas no processo de biomineralização. Em muitos casos, a biomineralização é dirigida por biopolímeros na matriz extracelular. Para avaliar o efeito de biopolímeros isolados na morfologia e estrutura da calcita in vitro, utilizou-se o método de difusão de vapor para a precipitação de carbonato de cálcio, microscopia eletrônica de varredura e micro Raman para a caracterização, e absorvância ultravioleta-visível (UV/VIS) para medir a quantidade de um biopolímero nos cristais. Neste método, expõem-se os biopolímeros isolados, dissolvidos em solução de cloreto de cálcio, a amônia gasosa e dióxido de carbono que se originam da decomposição de carbonato de amônio sólido. Nas condições em que o produto de solubilidade do carbonato de cálcio é atingido, os precipitados de carbonato de cálcio e os cristais são formados. O carbonato de cálcio tem diferentes polimorfos que diferem em sua estabilidade termodinâmico: carbonato de cálcio amorfo, vaterita, aragonita e calcita. Na ausência de biopolímeros, em condições limpas, o carbonato de cálcio está principalmente presente na forma de calcita, que é o polimorfo mais termodinògica estável do carbonato de cálcio. Este método examina o efeito dos aditivos biopoliméricas na morfologia e na estrutura de cristais do carbonato de cálcio. Aqui, demonstramos o protocolo através do estudo de uma proteína bacteriana extracelular, TapA, sobre a formação de cristais de carbonato de cálcio. Especificamente, focamos no conjunto experimental, e métodos de caracterização, tais como microscopia óptica e eletrônica, bem como Espectroscopia Raman.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. A biomineralização pode ser intracelular, como na formação de magnetita dentro de bactérias magnetotáticas1, ou extracelular, como na formação de carbonato de cálcio em picos de ouriço-do-mar2, de hidroxiapatita que está relacionada com colágeno em ossos3 e do esmalte que está associado com amelogenina nos dentes4. A biomineralização é um processo complexo que depende de muitos parâmetros no organismo vivo. Portanto, a fim de simplificar o sistema em estudo, é necessário avaliar o efeito de componentes separados no processo. Em muitos casos, a biomineralização é induzida pela presença de biopolímeros extracelulares. O objetivo do método aqui apresentado é o seguinte: (1) formar cristais de carbonato de cálcio na presença de biopolímeros isolados in vitro, utilizando um método de difusão de vapor. (2) estudar o efeito dos biopolímeros na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio.

São utilizados três métodos principais para precipitar o carbonato de cálcio in vitro na presença de aditivos orgânicos5,6. O primeiro método, que vamos referir como o método de solução, é baseado na mistura de um sal solúvel de cálcio (por exemplo, CaCl2) com um sal solúvel de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio). O processo de mistura pode ser realizado de várias maneiras: dentro de um reator com três células separadas por membranas porosas7. Aqui, cada uma das células exteriores contém um sal solúvel e a célula central contém uma solução com o aditivo a ser testado. O cálcio e o carbonato difuso do exterior à pilha média, tendo por resultado a precipitação do carbonato de cálcio menos solúvel quando as concentrações de cálcio e de carbonato excedem seu produto da solubilidade, KSP = [Ca2 +] [co3 2-]. Um método de mistura adicional é o procedimento de jato duplo8. Neste método, cada sal solúvel é injetado a partir de uma seringa separada para uma solução agitada contendo o aditivo, onde o carbonato de cálcio precipita. Aqui, a injeção e, portanto, a taxa de mistura é bem controlada, em contraste com o método anterior, onde a mistura é controlada pela difusão.

O segundo método usado para cristalizar CaCO3 é o método Kitano9. Este método baseia-se no equilíbrio carbonato/carbonato de hidrogênio (2HCO3- (AQ) + CA2 +(AQ) Image 1 caco3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Aqui, o CO2 é borbulhado em uma solução contendo caco3 em uma forma sólida, deslocando o equilíbrio para a esquerda e, portanto, dissolvendo o carbonato de cálcio. O carbonato de cálcio não dissolvido é filtrado e os aditivos desejados são adicionados à solução rica em bicarbonato. O CO2 é então autorizado a evacir, deslocando assim a reacção à direita, formando carbonato de cálcio na presença dos aditivos.

O terceiro método de cristalização do carbonato de cálcio, que descreveremos aqui, é o método de difusão de vapor10. Nesta set-up, o aditivo orgânico, dissolvido em uma solução de cloreto de cálcio, é colocado em uma câmara fechada perto de carbonato de amônio em forma de pó. Quando o pó de carbonato de amônio se decompõe em dióxido de carbono e amônia, eles se difusas na solução contendo íons de cálcio (por exemplo, CaCl2), e o carbonato de cálcio é precipitado (ver Figura 1 para ilustração). Os cristais do carbonato de cálcio podem crescer pela precipitação lenta ou pela precipitação rápida. Para a precipitação lenta, uma solução que contenha o aditivo na solução de CAcl2 é coloc em um exsicador ao lado do pó do carbonato de amónio. Na precipitação rápida, descrita de comprimento no protocolo, tanto a solução aditiva quanto o carbonato de amônio são colocados mais próximos em uma placa de múltiplos poços. O método de precipitação lenta produzirá menos centros de nucleação e cristais maiores, e a precipitação rápida resultará em mais centros de nucleação e cristais menores.

Os métodos descritos acima diferem em sua complexidade técnica, no nível de controle e na taxa do processo de precipitação. O método de mistura requer uma set-up especial6 para o jato duplo e o sistema de três células. No método de mistura, a presença de outros íons contrários solúveis (por exemplo, na+, CL-)6 é inevitável, enquanto que no método Kitano, o cálcio e (BI) carbonato são os únicos íons em solução e não envolve a presença de adicionais contra íons (por exemplo, na+, CL-). Além disso, o método de mistura requer volumes relativamente grandes e, portanto, não é adequado para trabalhar com biopolímeros caros. A vantagem do jato dobro é que é possível controlar a taxa de injeção da solução e que é um processo rápido em comparação com outros métodos.

A vantagem do método de Kitano e o método de difusão de vapor é que a formação de carbonato de cálcio é controlada pela difusão de CO2 em/fora de uma solução CAcl2 , permitindo assim a sonda de nucleação mais lenta e processos de precipitação 11 anos de , 12. Além disso, a formação de carbonato de cálcio por difusão de co2 pode assemelhar-se a processosde calcificação in vivo13,14,15. Neste método, os cristais bem definidos e separados são formados16. Por último, o efeito de biopolímeros únicos ou múltiplos na formação de carbonato de cálcio pode ser testado. Isto permite um estudo sistemático do efeito de uma série de concentrações aditivas na formação de carbonato de cálcio, bem como um estudo de misturas de biopolímeros-todos realizados de forma controlada. Este método é adequado para uso com uma grande variedade de concentrações e volumes de aditivos. O volume mínimo utilizado é de aproximadamente 50 μL e, portanto, este método é vantajoso quando há uma quantidade limitada de biopolímeros disponíveis. O volume máximo depende da acessibilidade de uma placa de poço maior, ou do dessecador em que a placa ou taça contendo CaCl2 devem ser inseridos. O método descrito abaixo foi otimizado para trabalhar em uma placa 96-well com um biopolímero escolhido para ser a proteína TapA17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. cristalização do carbonato de cálcio

  1. Preparação e otimização de controle
    1. Prepare peças de vidro limpas. Use o mesmo procedimento de limpeza para limpar os copos.
      1. Use uma pena do diamante para cortar partes de uma corrediça de vidro do microscópio de modo que caiam em um poço de uma placa 96-well.
        Nota: 5 mm x 5 mm peças devem caber em grande parte.
      2. Coloc as partes de vidro em um copo com água destilada tripla (TDW) de modo que a água cubra as corrediças de vidro e proceda em um sonicador do banho por 10 minutos.
      3. Decantar a água, adicionar etanol para cobrir as lâminas de vidro, e proceda em um banho sonicador por 10 min.
      4. Seque as lâminas e os copos com um fluxo de gás nitrogênio e coloque-os em um limpador de plasma de ar por 10 min a 130 W.
    2. Otimize a concentração do CAcl2 usado nos experimentos de calcificação realizados as condições experimentais desejadas para atingir uma amostra rica com cristais de calcita liso-facetados (sem ou pelo menos com um número escasso de vaterita cristais).
      1. Encha os poços nos cantos de uma placa 96-well com o pó do carbonato do amónio e sele a placa usando a folha de alumínio; Cubra a folha com película de parafina. Limpe qualquer carbonato de amónio residual com gás nitrogénio.
        PRECAUÇÃO: o carbonato de amónio irrita o nariz e os pulmões; Use somente dentro da capa das emanações.
      2. Prepare uma solução de estoque de 0,5 M CaCl2. Esta solução de ações será usada para preparar um gradiente de concentrações de CaCl2 soluções na placa de multi-bem.
        Nota: uma solução de 10 mL é suficiente para todo o experimento.
      3. Coloque as peças de vidro previamente cortadas e limpas em cinco poços diferentes. Use os poços mais próximos para o centro.
      4. Encha cada poço com uma peça de vidro com 100 μL de uma solução de CaCl2 16. Misture TDW e 0,5 M CaCl2 (estoque) para alcançar um gradiente de concentração crescente de CAcl2 nos diferentes poços. Se um bem-placa de tamanho diferente é usado, ajuste a concentração de CAcl2 para conseguir cristais separados da calcita (etapa 1.1.2.10, e veja seção da discussão).
        Nota: um gradiente crescente de CaCl2 de 10, 20, 30, 40, 50 mm concentrações em poços separados é usado neste protocolo. Para aumentar o intervalo de concentração ou o número de concentrações testadas, use poços adicionais.
      5. Perfure a tampa de cada um dos poços contendo carbonato de amónio 3x com uma agulha.
      6. Põr para trás a tampa, sele as beiras com película de parafina e mantenha-a em 18 ° c em uma incubadora por 20 h.
      7. Após a incubação, abra a tampa cuidadosamente dentro de uma capa de fumaça e retire os cristais formados na interface água/ar com um loop.
      8. Use um pinça para transferir as partes de vidro em um copo que contem a água destilada dobro (DDW). Retire as amostras do copo e use uma fita dupla face para fixar as peças de vidro na parte inferior da placa de Petri.
      9. Seque a água excessiva tocando nas bordas da corrediça com lenços de tecido. Cubra a placa de Petri e colocá-lo em um dessecador para 24 h.
      10. Observe os cristais formados nas peças de vidro com um estereoscópio (ampliação de 3,5 x) e/ou um microscópio óptico vertical (ampliação de 10x-40x). Se as soluções de controle estiverem limpas, cristais romboédricos (provavelmente calcita) serão observados com um microscópio óptico (Figura 2a).
      11. Se, além dos cristais romboédricos, o controle contiver cristais esféricos (provavelmente vaterita, Figura 2B), ou se as imagens de microscópio eletrônico de varredura (MEV) mostrarem cristais romboédricos com faces ásperas em vez de suaves ( Figura 3 A , B), repita o protocolo de cristalização certificando-se de que a etapa de limpeza (1.1.1) é executada corretamente. Além disso, fazer melhor cuidado que não há carbonato de amônia em áreas na placa que não sejam os poços dedicados. Caso contrário, avance para o passo seguinte.
  2. Cristalização na presença dos aditivos
    1. Para estudar o efeito dos aditivos na cristalização do CaCO3, configurar uma placa multipoços que contenha (em diferentes poços), uma solução de controle CAcl2 sem os aditivos, e soluções CAcl2 com os aditivos. Use a concentração óptima de CaCl2 encontrada na seção 1.1.2 para o experimento.
      Observação: o protocolo abaixo usa condições ideais como as relatadas em um estudo anterior16.
    2. Repita a etapa 1.1.2.2.
    3. Coloque o pó de carbonato de amónio nos cantos da chapa, conforme descrito no passo 1.1.2.1.
    4. Em cada poço onde a precipitação ocorrerá, coloc uma parte de vidro que seja cortada e limpada como descrito na seção 1.1.1.
    5. Para preparar poços de controle, pipete 90 μL de TDW nos poços de controle. Prepare pelo menos uma réplica de cada poço, incluindo o controle. Se o aditivo utilizado estiver em uma solução tampão, em seguida, pipetar 90 μL de tampão em vez de água TDW.
    6. Prepare os poços contendo aditivos. Repita o passo 1.2.5 adicionando 90 μL da solução aditiva em água. Se o aditivo estiver em buffer (em vez de TDW), pré-ajuste a concentração do aditivo com tampão para atender a concentração final desejada. Manter um volume total de 90 μL; pipeta primeiro o aditivo, em seguida, o tampão.
      Nota: uma concentração final de 10 μM da proteína TapA em 100 mM NaCl, 25 mM TRIS pH 8,0 buffer16 é utilizado neste protocolo.
    7. Adicionar 10 μL da solução de 0,5 M CaCl2 (preparada na etapa 1.2.2) para ambos os controles e os poços contendo aditivos para atingir uma concentração final de 50 mm CAcl2.
    8. Repita os passos 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. caracterização de cristais de carbonato de cálcio

  1. Com um microscópio eletrônico de varredura, observar os cristais de carbonato de cálcio formados na presença dos aditivos em uma resolução maior do que o obtido por microcopia óptica (ver passo 1.1.2.10).
    1. Monte as peças de vidro contendo os cristais em um topo de alumínio com fita dupla face de carbono.
    2. Casaco com uma camada de au/PD para 40-50 s.
    3. Adquira as imagens em tensão de aceleração de 5 kV.
      Nota: a Figura 3a mostra uma imagem sem representante de cristais de carbonato de cálcio formado em um experimento de controle adequado, enquanto a Figura 4 mostra imagens representativas de cristais de carbonato de cálcio formados na presença da proteína TapA .
  2. Realize micro Espectroscopia Raman para determinar os polimoros de carbonato de cálcio formados. O micro Raman permite a coleção de um espectro de Raman dos únicos cristais um pouco do que de um pó inteiro.
    1. Use um objetivo 20x do microscópio para escolher o cristal do interesse.
    2. Colete o espectro Raman em uma escala de 100 − 3200 cm-1 usando um laser do argônio de 514 nanômetro.
      Nota: A Figura 5 mostra espectros representativos de calcita (A) e vaterita (B). Para o espectro de aragonite, refira a referência18.
  3. Quantificação da percentagem de massa dos aditivos nos precipitados do CaCO3
    1. Verificar/medir o coeficiente de extinção (ε) do aditivo utilizado. O coeficiente de extinção de uma proteína pode ser administrado por servidores online19. Se o coeficiente de extinção for desconhecido, meça a absorvência do aditivo em diferentes concentrações, plotar a absorvência versus a concentração e calcular o coeficiente de extinção a partir da inclinação da curva.
    2. Pesar as peças de vidro onde os cristais formados, de preferência usar um microbalance.
    3. Sucata de cristais fora do vidro em 1,2 ml de 0,1 M solução de ácido acético, vortex e proceda a amostra. Guarde a amostra à temperatura ambiente durante 24 h.
      PRECAUÇÃO: o ácido acético é muito perigoso em caso de contacto com a pele ou os olhos; Manuseie com cautela e descarte seguindo os regulamentos.
    4. Pesar a corrediça de vidro após a raspagem fora dos cristais.
    5. Medir o espectro de absorvância UV/VIS (a) da solução. Se o aditivo for uma proteína, meça a absorvância a 280 nm e calcule a sua concentração (C), utilizando a equação de Beer-Lambert:
      Equation 1
      onde l é o caminho óptico dentro da cubeta.
    6. Use a concentração (C) encontrada em 2.3.5 e o volume utilizado (V = 1,2 ml) para calcular a massa (m) dos aditivos em/sobre os cristais. Se a concentração estiver em mg/ml, use a equação CV = m.
      1. Se a concentração estiver em mol/L, então Calcule as moles (n) aplicando CV = n. Em seguida, use o peso molecular (MW) para calcular a massa (m) dos aditivos(m = nMW).
    7. Calcule a percentagem de peso dos aditivos em/sobre os cristais usando a equação: Equation 2 , onde m é a massa dos aditivos, e δms é a massa dos cristais de carbonato de cálcio que foram desmantelados fora do vidro Pedaço.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Um esquema do conjunto experimental é mostrado na Figura 1. Resumidamente, o método de difusão é utilizado para formar cristais de carbonato de cálcio em placas de 96 poços e testar o efeito de biopolímeros na morfologia e estrutura dos cristais de carbonato de cálcio. Nesses experimentos, o carbonato de amônio é decomposto em amônia e CO2, que se difunde em soluções de carbonato de cálcio, resultando na formação de cristais de carbonato de cálcio (Figura 1 e Figura 2).

O efeito dos biopolímeros é avaliado por comparação dos cristais de carbonato de cálcio formados com e sem (controle) os aditivos. Antes da adição dos aditivos, a concentração otimizada do carbonato de cálcio é escolhida e a limpeza das soluções e dos produtos vidreiros é testada. Figura 2 A mostra uma imagem representativa de uma experimentação do controle, onde os cristais romboédrica distintos do carbonato de cálcio são dados forma. Estes cristais são mais prováveis calcita (ver Figura 5). Se as soluções ou o plástico ou os produtos vidreiros não foram limpos corretamente então os cristais esféricos formarão (Figura 2B, marcado com círculos vermelhos), além do que os cristais romboédrica da calcita. Os cristais esféricos são mais prováveis vaterita (ver Figura 5). Uma indicação adicional para o uso de condições apropriadas, é a lisura das faces da calcita no experimento de controle. Isso pode ser observado com SEM, como mostrado na Figura 3. Figura 3 A mostra um controle adequado com faces de calcita lisas, enquanto a Figura 3B mostra cristais de calcita com faces compostas de degraus. Os cristais esféricos aqui são vaterite. Os cristais do controle precisam de ser separados e liso-facetados de modo que o efeito dos aditivos na morfologia de cristal seja desobstruído.

Para demonstrar o efeito de um biopolímero na morfologia do carbonato de cálcio, temos usado aqui a proteína TapA. A Figura 4 mostra os cristais de carbonato de cálcio formados na presença de TapA na solução. Os cristais são distintos dos cristais de controle. Formam um conjunto esférico complexo do carbonato de cálcio, compor dos microcristais múltiplos da calcita (Veja o espectro de Raman em Figura 5). Um método para caracterizar a estrutura dos cristais é a Espectroscopia Raman. A Figura 5 mostra os espectros típicos de calcita (Figura 5a) e vaterita (Figura 5b), retirados de experimentos de controle bem-sucedidos (a) e sem sucesso (b). Os picos típicos20 da absorvência estão na escala de 100 − 400 cm-1 (modalidades da estrutura), um pico em ~ 710 cm-1 (dobra simétrica do co32-) e em ~ 1090 cm-1 (esticamento simétrico do co3 2-). Note a divisão do deslocamento Raman em ~ 1080 cm-1 que é a característica mais evidente de vaterita21. Refira a referência22 para um espectro cheio do aragonite. O espectro Raman dos cristais formados na presença de TapA é semelhante ao espectro da calcita (Figura 5a). Nos casos em que aparecem picos adicionais que não correspondem a um único espectro de um único polimorfo de carbonato de cálcio, ou uma combinação desses, eles podem ser atribuídos a um excesso de cloreto de cálcio que não foi lavado completamente na etapa 1.1.2.8.

Na seção final do protocolo, medimos a porcentagem (peso/peso) do conteúdo orgânico dentro ou sobre os cristais de carbonato de cálcio. Os cristais foram dissolvidos em ácido acético e o biopolímero foi liberado na solução. Nos casos em que o biopolímero tem um espectro característico da absorvência, sua concentração na solução pode ser determinada. No caso das proteínas que contêm grupos laterais aromáticos, como no estudo de caso aqui de TapA, a absorvância em 280 nanômetro é usada. O espectro da absorvência do TapA, medido depois da dissolução dos cristais no ácido, é mostrado na Figura 6 (verde) junto com o espectro do controle (cristais ácido-dissolvidos do carbonato de cálcio sem o aditivo; preto). Usando a lei de Beer-Lambert (ver passo 2.3.5) e usando um coeficiente de extinção de 29.700 M-1 cm-1, descobrimos que o percentual de massa de TapA foi 1,8% ± 0,2%. A medição da absorvência da solução após a dissolução cristalina em ácido é possível quando os biopolímeros não agregam a pH baixo. Um sinal nulo da absorvância da solução que contém o aditivo é indicativo de sua agregação. Neste caso, diferentes métodos de análise, como a análise gravitacional térmica (TGA) podem ser usados para estimar a massa de aditivos presentes dentro/sobre os cristais.

Figure 1
Figura 1 : Descrição esquemática do método rápido da difusão do vapor para a formação de cristais do carbonato de cálcio. Um sal solúvel contendo cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio) é colocado perto de um pó de carbonato de amônio. Aqui nós mostramos dois poços em uma placa 96-well. A placa é então selada, e o carbonato de amônio decomposto em amônia e dióxido de carbono que se difunde no poço contendo cálcio, resultando na precipitação de cristais de carbonato de cálcio (mostrado aqui pela imagem de SEM de um cristal de calcita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imagens do microscópio ótico dos cristais do carbonato de cálcio. Um controle limpo contem na maior parte a calcite, que é caracterizada por cristais romboédrica (A). Quando a amostra de controle inclui cristais esféricos (como aqueles marcados por um círculo vermelho) (B), repita o protocolo de limpeza como sugerido na seção 1.1.1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Micrografias de elétrons de varredura de cristais de carbonato de cálcio formados em dois experimentos de controle. (A) uma imagem de uma amostra que contenha na maior parte cristais romboédrica (calcite). (B) um Micrografia de uma amostra com facetas quebradas da calcita e os cristais esféricos que são o mais provavelmente vaterite. Neste caso, os experimentos de controle precisam ser repetidos. Este número foi modificado de Azulay et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Imagens de MeV de cristais de calcita formados na presença da proteína TapA. As barras de escala representam 50 μm (A) e 10 μm (B), respectivamente. Este número foi modificado de Azulay et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Espectros de Raman de dois polimorfos do carbonato de cálcio. (A) calcita. (B) vaterite. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Espectros de absorvância UV/VIS de TapA (verde) e uma solução tampão (100 mm NaCl, 25 mm Tris pH 8,0; preto). A absorbância foi utilizada para calcular a concentração de TapA nos cristais de carbonato de cálcio, após sua dissolução em ácido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O método aqui descrito destina-se a formar cristais de carbonato de cálcio na presença de aditivos orgânicos e avaliar o efeito de biopolímeros orgânicos na morfologia e estrutura de cristais de carbonato de cálcio in vitro. O método é baseado na comparação dos cristais formados na presença dos aditivos orgânicos aos cristais de calcita formados no experimento de controle. Nós mostramos como usar o método de difusão para formar os cristais de carbonato de cálcio, como caracterizar sua morfologia usando microscopia óptica e eletrônica, como caracterizar sua estrutura usando Espectroscopia Raman, e como determinar o conteúdo orgânico (percentagem de peso/peso) dos cristais.

Nós descrevemos o protocolo que nós usamos para avaliar o efeito de uma proteína extracelular bacteriana, TapA, na morfologia e na estrutura do carbonato de cálcio, mas o protocolo pode ser gasto a todo o outro polímero que é purificado ou sintetizado biologicamente. Além do efeito de um único biopolímero, este método pode ser utilizado com misturas de biopolímeros, a fim de avaliar qualquer mutualidade entre diferentes polímeros em seu efeito sobre a precipitação do carbonato de cálcio. Limitamos o conjunto experimental a uma placa de 96 poços; no entanto, qualquer outra set-up onde as soluções de carbonato de cálcio são posicionadas e fisicamente separadas da fonte de carbonato de amônio (ou seja, as soluções e pó são colocadas em um vaso selado), é possível. As embarcações típicas usadas são placas do multi-poço e uma escala de concentração típica de 10-50 milímetros é usada para um set-up experimental com 96-placas do poço10,16,23. Um copo selado ou um dessecador também podem ser usados.

Este método é fácil de usar e é compatível com baixas concentrações e baixos volumes dos aditivos biopoliméricas. Trabalhar em uma placa do multi-poço permite a seleção de parâmetros múltiplos ao mesmo tempo em uma experiência da placa do multi-poço. Este método pode ser sensível à posição relativa dos poços de carbonato de cálcio em relação à posição do pó de carbonato de amónio. Portanto, o cuidado deve ser tomado para sempre usar poços na mesma posição na placa de multipoços e também para verificar se a mudança da localização dos poços não afeta os resultados. Normalmente, usando uma distância grande o suficiente entre os poços onde os experimentos acontecem e o pó de carbonato de amônio, assegura que os resultados sejam reprodutíveis. Além, é crítico ajustar a concentração da solução de CaCl2 de modo que os cristais separados estejam formados no experimento de controle, como descrito na seção 1.1.2. A concentração dos aditivos também deve ser otimizada para exceder uma concentração mínima abaixo da qual nenhum efeito é observado. Note-se que o método é altamente sensível à concentração dos aditivos; diferentes concentrações aditivas podem induzir um efeito diferente na morfologia e estrutura dos cristais de carbonato de cálcio24.

Uma das principais limitações deste método é que a amônia e a CO2 se difusas nas soluções de teste de cloreto de cálcio e, portanto, há um mau controle do pH durante todo o experimento. Como resultado da difusão da amônia, o pH na solução aumenta (quando a amônia se torna amônio), como mostrado nas equações de equilíbrio5,6 ((NH4)2co3 (s) → 2NH3 (g) + co2 (g) + H 2. º O(l), NH3 (AQ) + H2O(l) → NH4+(AQ) + Oh-(AQ), CA2 +(AQ) + co2 (AQ) + 2oh-(AQ) Image 1 Caco3 (s) + H2o (l)) e favorece a formação de carbonato de cálcio. 

Comparado aos métodos adicionais descritos na introdução, este método é tecnicamente simples. Devido ao processo de precipitação lenta, o crescimento do cristal pode ser seguido em tempo real, usando técnicas de absorvância ou espalhamento da técnica transparente de vários poços. Além disso, a fim de seguir a cinética do crescimento do cristal, pode-se também sondar a morfologia e a estrutura cristalina em diferentes pontos temporais, em vez de 20 horas, conforme realizado em nosso estudo. Este método pode ser expandido para estudar a precipitação de outros sais do carbonato que carregam um KSP pequeno bastante, tal como o magnésio, o bário e os carbonatos do cádmio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Prof. lia Addadi, Prof. Jonathan Erez, e ao Dr. Yael Politi por discussões frutíferas. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de ciência israelense (ISF), conceder 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, (4212), 377-379 (1975).
  2. Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306, (5699), 1161-1164 (2004).
  3. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183, (2), 258-269 (2013).
  4. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
  5. Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
  6. Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6, (8), 1915-1920 (2006).
  7. Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11, (3), 301-308 (2013).
  8. Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199, (2), 247-254 (1998).
  9. Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67, (12), 4873-4874 (1962).
  10. Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9, (12), 1171-1177 (2007).
  11. Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5, (4), 1317-1319 (2005).
  12. Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203, (4), 627-635 (2002).
  13. Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
  14. Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54, (1), 151-187 (2003).
  15. Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
  16. Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18, (9), 5582-5591 (2018).
  17. Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. (2018).
  18. Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118, (3), 753-757 (1997).
  19. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. Springer. 571-607 (2005).
  20. Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37, (9), 892-899 (2006).
  21. Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
  22. Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293, (5), 478-491 (2002).
  23. Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
  24. Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20, (30), 4221-4224 (2018).
Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).More

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter