Kalciumkarbonatbildning i närvaro av Biopolymera tillsatser

Summary

Vi beskriver ett protokoll för utfällning och karakterisering av kalciumkarbonatkristaller som bildas i närvaro av biopolymerer.

Abstract

Biomineralization är bildandet av mineraler i närvaro av organiska molekyler, ofta relaterade till funktionella och/eller strukturella roller i levande organismer. Det är en komplicerad process och därför ett enkelt, in vitro-system krävs för att förstå effekten av isolerade molekyler på biomineralisering processen. I många fall styrs biomineralisering av biopolymerer i den extracellulära matrisen. För att utvärdera effekten av isolerade biopolymerer på morfologin och strukturen av kalcit in vitro, har vi använt ång diffusions metoden för utfällning av kalciumkarbonat, scanning elektronmikroskopi och Micro Raman för karakterisering, och ultraviolett-synligt (UV/VIS) absorbans för att mäta antalet av en Biopolymer i kristallerna. I denna metod utsätter vi isolerade biopolymerer, lösta i en kalciumkloridlösning, till gasformig ammoniak och koldioxid som härstammar från nedbrytningen av fast ammoniumkarbonat. Under de förhållanden där löslighets produkten av kalciumkarbonat är nådd bildas kalciumkarbonatutfällningarna och kristallerna. Kalciumkarbonat har olika polymorfer som skiljer sig i deras termodynamiska stabilitet: amorft kalciumkarbonat, vaterite, aragonite, och kalcit. I avsaknad av biopolymerer, under rena förhållanden, är kalciumkarbonat mestadels närvarande i kalcit form, som är den mest termodynamiskt stabila polymorph av kalciumkarbonat. Denna metod undersöker effekten av de biopolymera tillsatser på Morfologi och struktur av kalciumkarbonat kristaller. Här demonstrerar vi protokollet genom studiet av ett extracellulärt bakterie protein, TapA, om bildandet av kalciumkarbonatkristaller. Specifikt fokuserar vi på de experimentella metoderna för att skapa och karakterisera, såsom optisk och elektronmikroskopi samt Raman-spektroskopi.

Introduction

Biomineralization är bildandet av mineraler i närvaro av organiska molekyler, ofta relaterade till funktionella och/eller strukturella roller i levande organismer. Biomineralization kan vara intracellulär, som i bildandet av magnetit inuti magnetotaktiska bakterier¹, eller extracellulära, som i bildandet av kalciumkarbonat i havet urchin spikes², av hydroxyapatit som är relaterad med kollagen i Ben³ och emalj som är associerad med amelogenin i tänderna⁴. Biomineralization är en komplicerad process som beror på många parametrar i den levande organismen. Därför, för att förenkla det system som studeras, är det nödvändigt att utvärdera effekten av separata komponenter på processen. I många fall induceras biomineralisering av närvaron av extracellulära biopolymerer. Syftet med den metod som presenteras här är följande: (1) för att bilda kalciumkarbonatkristaller i närvaro av isolerade biopolymerer in vitro, med hjälp av en ång diffusions metod. (2) att studera effekten av biopolymerer på Morfologi och struktur av kalciumkarbonat.

Tre huvudsakliga metoder för att fälla ut kalciumkarbonat in vitro i närvaro av organiska tillsatser används^5,6. Den första metoden, som vi kommer att hänvisa till som lösningsmetod, är baserad på blandning av ett lösligt salt av kalcium (t. ex., CaCl₂) med ett lösligt salt av karbonat (t. ex. natriumkarbonat). Blandningsprocessen kan utföras på flera sätt: inuti en reaktor med tre celler som skiljs åt av porösa membran⁷. Här innehåller var och en av de yttre cellerna ett lösligt salt och den centrala cellen innehåller en lösning med den tillsats som ska testas. Kalcium och karbonat diffus från den yttre till mellersta cellen, vilket resulterar i utfällning av mindre lösliga kalciumkarbonat när koncentrationerna av kalcium och karbonat överstiga deras löslighet produkt, K_SP = [ca^{2 +}] [co₃ ^2-]. En ytterligare Blandningsmetod är dubbel-Jet förfarande⁸. I denna metod injiceras varje lösligt salt från en separat spruta till en omrörd lösning som innehåller tillsatsen, där kalciumkarbonat fälls ut. Här, injektionen och därför blandnings hastigheten är väl kontrollerad, i motsats till den tidigare metoden där blandningen styrs av diffusion.

Den andra metoden som används för att kristallisera CaCO₃ är Kitano metod⁹. Denna metod är baserad på balansen mellan karbonat och vätekarbonat (2hco₃^– _(AQ) + ca^{2 +}_(AQ) Caco_{3 (s)} + Co_{2 (g)} + H₂O _(l)). Här är CO₂ bubblade in i en lösning som innehåller Caco₃ i en solid form, flytta balansen till vänster och därför upplösning av kalciumkarbonat. Det oupplösta kalciumkarbonat filtreras och de önskade tillsatser läggs till bikarbonat-rik lösning. CO₂ får sedan avdunta, och därmed flytta reaktionen till höger, bildar kalciumkarbonat i närvaro av tillsatser.

Den tredje metoden för kalciumkarbonat kristallisation, som vi kommer att beskriva här, är ångdiffusions metoden¹⁰. I denna uppsättning, den organiska tillsatsen, upplöst i en lösning av kalciumklorid, placeras i en sluten kammare nära ammoniumkarbonat i en pulverform. När ammoniumkarbonatpulver bryts ned till koldioxid och ammoniak, diffunderar de in i lösningen som innehåller kalciumjoner (t. ex. CaCl₂), och kalciumkarbonat fälls ut (se figur 1 för illustration). Calciumkarbonatkristaller kan växa vid långsam nederbörd eller vid fastar nederbörd. För den långsamma nederbörden placeras en lösning som innehåller tillsatsen i CaCl₂ -lösning i en exsickator bredvid ammoniumkarbonatpulvret. I den snabba nederbörden, som beskrivs utförligt i protokollet, placeras både additiv lösningen och ammoniumkarbonat närmare varandra i en multi-well-platta. Den långsamma nederbörden metoden kommer att producera färre nukleation centra och större kristaller, och den snabba nederbörden kommer att resultera i fler nukleation centra och mindre kristaller.

De metoder som beskrivs ovan skiljer sig i deras tekniska komplexitet, i nivån av kontroll och i takt med nederbörden processen. Blandnings metoden kräver en särskild uppsättning⁶ för både dubbel stråle och trecellssystem. I blandnings metoden är närvaron av andra lösliga Counter-joner (t. ex., na⁺, cl-)⁶ oundviklig, medan i Kitano^–metoden är kalcium och (BI) karbonat de enda joner i lösning och det innebär inte förekomst av ytterligare (t. ex., na⁺, cl^–). Dessutom kräver blandnings metoden relativt stora volymer och därför är den inte lämplig för arbete med dyra biopolymerer. Fördelen med dubbel stråle är att det är möjligt att kontrollera graden av lösning injektion och att det är en snabb process i jämförelse med andra metoder.

Fördelen med Kitano-metoden och ång diffusions metoden är att bildandet av kalciumkarbonat styrs genom diffusion av CO₂ till/från en CaCl₂ -lösning, vilket gör det möjligt att söka långsammare kärnbildning och nederbörd processer ^{elva , 12}. Dessutom kan kalciumkarbonatbildningen genom diffusion av co₂ likna förkalkning processer in vivo^13,14,15. I denna metod bildas väldefinierade och separerade kristaller¹⁶. Slutligen kan effekten av enstaka eller flera biopolymerer på kalciumkarbonatbildning testas. Detta möjliggör en systematisk studie av effekten av en serie additiva koncentrationer på kalciumkarbonatbildningen samt en studie av blandningar av biopolymerer-allt utfört på ett kontrollerat sätt. Denna metod är lämplig för användning med ett stort utbud av koncentrationer och volymer av tillsatser. Den minimala volym som används är ungefär 50 μL och därför är denna metod fördelaktig när det finns en begränsad mängd av de tillgängliga Biopolymererna. Den maximala volymen beror på tillgängligheten för en större brunn-platta eller exsickatorn i vilken plattan eller bägaren som innehåller CaCl₂ skall sättas in. Den metod som beskrivs nedan har optimerats för att arbeta i en 96-brunn tallrik med en Biopolymer valt att vara proteinet TapA¹⁷.

Protocol

1. kristallisation av kalciumkarbonat Kontroll beredning och optimering Förbered rena glasbitar. Använd samma rengöringsprocedur för att rengöra glas. Använd en diamantpenna för att skära bitar av ett glas Mikroskop Slide så att de passar i en brunn på en 96-bra tallrik.Obs: 5 mm x 5 mm bitar bör i hög grad passa. Placera glasbitarna i en bägare med Triple destillerat vatten (TDW) så att vattnet täcker glas rutschbanorna och Sonikera i ett bad son…

Representative Results

En schematisk av den experimentella uppsättningen visas i figur 1. Kortfattat används diffusions metoden för att bilda kalciumkarbonatkristaller i 96-well-plattor och testa effekten av biopolymerer på morfologin och strukturen av kalciumkarbonatkristaller. I dessa experiment bryts ammoniumkarbonat till ammoniak och CO2, som sprids till kalciumkarbonatlösningar, vilket resulterar i bildandet av kalciumkarbonatkristaller (figur 1 och <strong class=…

Discussion

Den metod som beskrivs här syftar till att bilda kalciumkarbonat kristaller i närvaro av organiska tillsatser och utvärdera effekten av organiska biopolymerer på Morfologi och struktur av kalciumkarbonat kristaller in vitro-. Metoden baseras på jämförelsen av kristallerna som bildas i närvaron av de organiska tillsatserna till de kalcit kristaller som bildas i kontroll experimentet. Vi har visat hur man använder diffusions metoden för att bilda kalciumkarbonatkristaller, hur man karakteriserar deras morfologi m…

Materials

Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model