Presenteras är ett protokoll för att producera olika typer av median nerv (MN) skador och reparation i råtta. Dessutom visar protokollet hur man utvärderar den funktionella återhämtningen av nerven med hjälp av flera noninvasive beteendetester och fysiologiska mätningar.
Huvudsyftet med denna undersökning är att visa hur man skapar och reparerar olika typer av mediannervskador (MN) hos råttan. Dessutom presenteras olika metoder för att simulera postoperativ fysioterapi. Flera standardiserade strategier används för att bedöma motor och sensorisk återhämtning med hjälp av en MN-modell av perifera nerv lesion och reparation, vilket möjliggör enkel jämförelse av resultaten. Flera alternativ ingår för att ge en postoperativ sjukgymnastik-liknande miljö till råttor som har genomgått MN skador. Slutligen ger papperet en metod för att utvärdera återhämtningen av MN med hjälp av flera noninvasive tester (dvs. gripa test, pin prick test, stege rung gångtest, rep klättring test, och gångspår analys), och fysiologiska mätningar (infraröd termografi, elektroneuromyography, flexion styrka utvärdering, och flexor carpi radialis muskelvikt bestämning). Därför verkar denna modell särskilt lämpligt att replikera ett kliniskt scenario, underlätta extrapolering av resultaten till den mänskliga arten.
Även om ischiasnerven är den mest studerade nerven i perifer nerv forskning, analys av råtta MN presenterar olika fördelar. Till exempel finns det en minskad incidens av gemensamma kontrakturer och automutilation av den drabbade extremiteten i MN lesion studier. Dessutom är MN inte omfattas av muskelmassor, vilket gör dess dissekering lättare än ischiasnerven. Dessutom observeras MN återhämtning tidigare, eftersom MN är kortare än ischiasnerven. Dessutom har MN en parallell väg till ulnanerven i armen. Därför kan ulna nerv lätt användas som nervtransplantat för att reparera MN skador. Slutligen är MN hos råttor ligger i frambenet, besläktad med den mänskliga övre delen; hos människor är den övre delen platsen för de flesta perifera nervskador.
Perifera nervskador uppträder regelbundet som ett resultat av trauma, infektion, vaskulit, autoimmunitet, malignitet och/eller strålbehandling1,2. Tyvärr fortsätter perifer nerv reparation att presentera kliniskt oförutsägbara och ofta nedslående resultat3,4. Det råder bred enighet om att det fortfarande behövs betydande grundforskning och translationell forskning för att förbättra utsikterna för de drabbade4,,5,,6,,7.
Råttan MN visar stora likheter medmänniskors 8,,9 (figur 1). Med ursprung från brachiala plexus i axillary regionen, denna nerv sjunker ner i den mediala aspekten av armen, når armbågen, och förgrening av till majoriteten av musklerna i ventrala facket i underarmen. MN når handen, där den innerverar thenarmusklerna och de två första lumbriska musklerna samt till en del av råttanshandhud 9 (figur 1).
Med hjälp av råtta MN är det möjligt att på ett tillfredsställande sätt replikera perifera nervskador hos människa10,,11,12. Denna nerv har flera potentiella forskningsfördelar i förhållande till den vanligtvis använda ischiasnerven. Eftersom MN ligger i frambenet av råttor (besläktad med de mänskliga övre extremiteterna), kan det skadas experimentellt med en mycket mindre inverkan på råttans välbefinnande, jämfört med ischiasnerven, som innerverar en betydande del av bäckenbenet13. Dessutom förekommer de flesta kliniska lesioner hos människor i övre extremiteten, vilket motsvarar råttans framben10,11,12,14,15,16.
Detta dokument visar hur man producerar olika typer av MN organskador i råtta. Dessutom presenteras olika sätt att simulera postoperativ sjukgymnastik. Slutligen beskrivs tester för att utvärdera funktionell återställning av MN. Det finns flera standardiserade strategier tillgängliga för att bedöma motor och sensorisk återhämtning med hjälp av en MN-modell av perifera nerv lesion och reparation, vilket möjliggör en enkel jämförelse av resultat. MN-modellen är särskilt lämplig för att replikera det kliniska scenariot, vilket underlättar extrapolering av resultaten till den mänskliga arten.
Detta dokument presenterar ett protokoll för att skapa olika typer av MN skador och reparation i råtta. Dessutom illustrerar det hur man utvärderar den funktionella återhämtningen av denna nerv med hjälp av flera noninvasive beteendemässiga tester och fysiologiska mätningar.
Noterbart är flera av de funktionella tester som beskrivs i detta dokument, nämligen Ladder Running Test och Rope Test, betydligt beroende av råttans vilja att utföra uppgiften med förväntan att få mat belöning51,52,53. Det bör noteras att vissa råttastammar är mer mottagliga för utbildning och utför reproducerbart i denna typ av tester51,,52,53. Till exempel, Lewis råttor prestera dåligt i dessa tester både i träningsfasen och därefter51,52,53.
Råtta bostäder bör tillåta gott om fri rörlighet i samförstånd med deras naturliga undersökande beteende, förutom att tillåta försöksdjur att bekanta sig med några av de delar som finns i funktionella tester19. Därför visas olika former av bostäder som möjliggör högre rörelsefrihet. De stora burarna är personliga med anrikningselement som senare används i funktionstesterna (t.ex. rep och stegar).
Förmodligen dessa berikande element samt burar med inbyggda löphjul och de enskilda utbildningsfärerna ger en form av postoperativ sjukgymnastik liknande den som erbjuds till mänskliga patienter som drivs på det perifera nervsystemet10.
Betydligt, även om vissa författare förespråkar dissekera subkutan vävnader och muskel fasciae rakt på sak eller genom ren skärning med ett antal 15 skalpell, användning av thermocautery vid dissekering av dessa strukturer rekommenderas för att minimera risken för postoperativa hematom.
Det bör noteras att många tester har utarbetats för att testa olika aspekter av perifer nerv reparation hos råtta, nämligen axonal regenerering, mål reinnervation, och funktionell återhämtning, av vilka några ligger utanför ramen för denna studie29,54,55,56. Till exempel kinematiska analys29,36,55 och histomorphometric bedömning29,36,57 är allmänt anställda av flera författare. Dessutom innebär flera av dessa tester variationer för att maximera effektiviteten och/eller reproducerbarheten54. Till exempel kan mekanisk algisemetri (dvs. utvärdering av svar på mekaniska smärtsamma stimuli) bedömas kvalitativt med hjälp av en viss von Frey-glödtråd, som beskrivs i detta dokument, eller semikvantitativt med hjälp av successivt starkare von Frey-glödtrådar, eller till och med kvantitativt använda elektroniska apparater som använder ökande tryck tills ett tillbakadragande svar observeras30,54.
På samma sätt, även om flera författare använder vandringsled analys för att utvärdera framben nerv reparation i råtta, andra författare hävdar att enda MN organskador ofta misslyckas med att producera reproducerbara förändringar i pawprints10,58,59. Dessutom har vissa uppgett att dessa förändringar kanske inte står i proportion till muskelåterhämtning10,,60. Med detta i åtanke, vissa forskare har förespråkat användning av gångspår analys i förutsåg främst vid bedömning av återhämtning efter krossning neve organskador snarare än efter segmental nerv återuppbyggnad10,50,61.
Griptestet används ofta för att utvärdera motorisk återhämtning av de muskler som kontrolleras av MN16,27. För att garantera enhetlighet och reproducerbarhet av de uppgifter som erhållits med detta test rekommenderas tillämpning av förståtttestet med hjälp av den väletablerade metod som föreslagits av Bertelli et al.16. Det nuvarande protokollet skiljer sig dock genom att det inte rutinmässigt immobiliserar den kontralaterala tassen för att förhindra onödig stress11,27. Det bör också noteras att andra författare, efter immobilisering av den oskadade tassen, kvantitativt bedöma gripa testet med hjälp av en dynamometer eller en skala27,56. Denna kvantitativa utvärdering kan dock påverkas av den styrka som forskaren tillämpar på råttans svans26. Dessutom är det svårt att skilja mellan den styrka som genereras av de digitala flexormusklerna (enbart innerveras av MN i råtten och föremålet för Griptest9) från den styrka som produceras av handleden flexor, som inkluderar flexor carpi ulnaris som får sin innervation från ulnanerven9,10,27. För att försöka kringgå dessa potentiella fördomar, detta protokoll använder en ordningsskala som liknar Medical Research Council Scale vanligen används för att gradera muskelstyrka hos människor10,11,62. Alternativt har andra författare beskrivit detaljerad bedömning av att förstå med hjälp av videoanalys och ett videobaserat poängsystem11,63.
En potentiell nackdel med att använda MN jämfört med ischiasnerven är att en större mängd information finns tillgänglig om den senare nerven. Detta kan i sin tur göra det svårare att jämföra data som erhållits med MN och tidigare experimentella arbeten46,48,64. Dessutom, den mindre storleken på MN jämfört med ischiasnerven gör kirurgisk manipulation mer utmanande8,12,27,56,65.
I motsats till den metod som beskrivs i detta dokument kan elektroneuromografiutvärderingen utföras med transkutan monopolelektroder placerade i armen och thenarregionerna51. Trots att mindre invasiv, denna metod medför risk för potentiell förvirring på grund av risken för costimulation av ulna nerv i armregionen9,51.
De flesta författare instämmer i att inte alla tester som används i råttan ger samstämmiga resultat, som perifera nerv reparation beror på ett komplext utbud av faktorer, bestående av neuron överlevnad, axonal töjning och beskärning, synaptogenesis, framgångsrik återerövring av denervated sinnesorgan och motorenheter, och hjärnan plasticitet7,10,50,66,67.
Slutligen bör det noteras att en betydande varning av gnagare modeller är att råtta perifera nerver är mycket närmare sina slutorgan och har mycket mindre tvärsnittsområden än homologa mänskliga strukturer. Denna storleksskillnad garanterar dock snabbare experimentella data hos gnagare, och bättre övergripande resultat hos råttor i jämförelse med människor är att vänta68. Faktum är att flera författare varnar för att försiktighet måste användas när man försöker extrapolera experimentella data som erhållits i perifer nerv reparation med gnagare till människor7,69. Primatmodeller anses vara mer jämförbara70. Ändå är deras användning förknippas med irriterande etiska, logistiska och budgetbegränsningar71.
Även om ischiasnerven är den vanligaste nerven i perifer nerv forskning, råtta MN presenterar flera fördelar. Till exempel är MN-lesioner associerade med en mindre incidens av ledkontrakturer och automutilation av den drabbade tassen11,12,16,56. Signifikant, autotomy efter ischiasnerven transection drabbar 11-70% av råttor. Detta kan göra nuvarande utvärderingar som ischiasindex omöjligt14. Detta gör i sin tur uppskattningen av antalet djur som krävs för att få en viss statistisk effekt besvärlig15.
Dessutom, eftersom MN är kortare än ischiasnerven, nervåterhämtning observeras tidigare58,72,73,74,75,76. Dessutom är MN inte omfattas av muskelmassor, vilket gör dess dissekering tekniskt lättare än ischiasnerven16. Dessutom har MN en parallell väg till ulnanerven i armen. Därför kan ulna nerv lätt användas som nervtransplantat för att reparera MN skador. Slutligen, hos människor, de flesta perifera nervskador förekommer i den övre delen, som ytterligare stöder användningen av denna nerv i råttan77,78.
Förmodligen är gnagare de försöksdjur som oftast används i sfären av perifer nervreparation48,79. Som visas är råttan MN en bekväm modell av perifer nervskada och reparation. I själva verket finns det flera standardiserade strategier för att bedöma motor och sensorisk återhämtning, vilket möjliggör en enklare jämförelse av resultaten36,46,60,,80,81,82. Många av dessa metoder är noninvasive, vilket möjliggör daglig bedömning.
Dessutom är fysioterapi en del av standarden på vården av patienter som återhämtar sig från perifera nervskador. Som framgår av detta dokument, det finns flera strategier för att ge en postoperativ sjukgymnastik-liknande miljö till råttor in till MN skador4,5. Därför är denna modell särskilt lämplig för att replikera det kliniska scenariot, underlätta extrapolering av resultaten till den mänskliga arten12,27,48,56,58,83.
Som visas i detta dokument, flera standardiserade strategier finns tillgängliga för att bedöma motor och sensorisk återhämtning i MN-modellen av råtta. De flesta av dessa är icke-invasiva förfaranden, vilket möjliggör frekvent bedömning. Dessutom, eftersom de flesta perifera nervskador i den mänskliga arten förekommer i den övre delen, kan de nämnda experimentella fysioterapiinställningarna mer träffande efterlikna återhämtning i det kliniska sammanhanget. Förmodligen kan detta underlätta extrapolering av resultat till den mänskliga arten, vilket ytterligare validerar användningen av denna nerv hos råttan.
The authors have nothing to disclose.
Diogo Casal fick ett bidrag från Programmet för avancerad medicinsk utbildning, som sponsras av Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Författarna är mycket tacksamma mot Filipe Franco för den belysande ritningen i figur 1. Författarna vill tacka den tekniska hjälpen av Mr Alberto Severino i filmning och redigering av videon. Slutligen vill författarna tacka Ms Sara Marques för hennes hjälp i alla logistiska aspekter som rör djurförvärv och underhåll.
Acetaminophen | Amazon | https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG | |
Acland clamps | Fine Science Tools | 00398 V | http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf |
Acland Single Clamps B-1V (Pair) | Fine Science Tools | 396 | http://www.merciansurgical.com |
Biogel Surgical Gloves | Medex Supply | 30465 | https://www.medexsupply.com |
BSL Analysis | BIOPAC Systems | https://www.biopac.com/ | |
Castroviejo needle holders | Fine Science Tools | 12565-14 | http://s-and-t.ne |
Clamp applicator | Fine Science Tools | CAF-4 | http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf |
Constante voltage stimulator | BIOPAC Systems | STM200 | https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/ |
Cutasept skin disinfectant | Bode Chemie | http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php | |
Dafilon 10-0 | G1118099 | http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816 | |
Derf Needle Holders 12 cm TC | Fine Science Tools | 703DE12 | http://www.merciansurgical.com |
Dry heat sterilizer | Quirumed | 2432 | http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores |
Dynamometer | SAUTER | FH5 | https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/ |
Electroneuromiography setup | BIOPAC Systems | MP36 | https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/ |
Ethilon 5-0 | W1618 | http://www.farlamedical.co.uk/ | |
FLIR Software | FLIR | ||
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved | Fine Science Tools | 11052-10 | http://www.finescience.de |
Graph paper | Ambar | ||
Heat Lamp HL-1 | Harvard Apparatus | 727562 | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) | Universal Drugstore | http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml | |
High-Temperature Cautery | Fine Science Tools | AA03 | http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp |
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507220F | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Infrared camera | FLIR | E6 | http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/ |
Instrapac – Adson Toothed Forceps (Extra Fine) | Fine Science Tools | 7973 | http://www.millermedicalsupplies.com |
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7613-11 | http://www.merciansurgical.com |
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma- Aldrich | K113 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt®ion=PT |
Lacri-lube Eye Ointment 5g | Express Chemist | LAC101F | http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html |
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7652-14 | http://www.merciansurgical.com |
Meloxicam | Recropharma | Mobic | https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam |
Methylene Blue solution | Sigma- Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product | |
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 | Fine Science Tools | JF-5 | http://www.merciansurgical.com |
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 | Fine Science Tools | JFA-5b | http://www.merciansurgical.com |
Micro retractor | Fine Science Tools | RS-6540 | http://www.finescience.de |
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight | Fine Science Tools | 67 | http://www.merciansurgical.com |
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 | Fine Science Tools | D-5a.2 | http://www.merciansurgical.com |
Monosyn 5-0 | 15423BR | http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php | |
Normal saline for irrigation | Hospira, Inc. | 0409-6138-22 | http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts |
Operating microscope | Leica Surgical Microsystems | http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/ | |
Skin Skribe Surgical Skin Marker | Moore Medical | 31456 | https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1 |
Snacks | Versele-Laga | Complete Crock-Berry | http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry |
Straight mosquito forcep | Fine Science Tools | 91308-12 | http://www.finescience.de |
Surgical drapes | Barrier | 800430 | http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/ |
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml | Veet | http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/ |