Præsenteret er en protokol til at producere forskellige typer af median nerve (MN) læsioner og reparation i rotten. Derudover, protokollen viser, hvordan man vurderer den funktionelle genopretning af nerven ved hjælp af flere noninvasive adfærdsmæssige tests og fysiologiske målinger.
Hovedformålet med denne undersøgelse er at vise, hvordan man skaber og reparere forskellige typer af median nerve (MN) læsioner i rotten. Desuden præsenteres forskellige metoder til simulering af postoperativ fysioterapi. Flere standardiserede strategier bruges til at vurdere motoriske og sensoriske opsving ved hjælp af en MN model af perifernervelæsion og reparation, hvilket gør det nemt sammenligning af resultaterne. Flere muligheder er inkluderet for at give en postoperativ fysioterapi-lignende miljø til rotter, der har gennemgået MN skader. Endelig papiret giver en metode til at evaluere inddrivelse af MN ved hjælp af flere noninvasive test (dvs. gribe test, pin prik test, stigen rung walking test, reb klatring test, og vandresti analyse), og fysiologiske målinger (infrarød termografi, elektroneuromyografi, flexion styrke evaluering, og flexor carpi radialis muskel vægt bestemmelse). Derfor forekommer denne model særlig velegnet til at gentage et klinisk scenario, hvilket letter ekstrapolering af resultater til den menneskelige art.
Selv om iskiasnerven er den mest studerede nerve i perifer nerve forskning, analyse af rotte MN præsenterer forskellige fordele. For eksempel er der en reduceret forekomst af fælles kontrakturer og automutilation af de berørte lemmer i MN læsionundersøgelser. Endvidere, MN er ikke omfattet af muskelmasser, hvilket gør dens dissektion lettere end iskiasnerven. Desuden, MN opsving er observeret hurtigere, fordi MN er kortere end iskiasnerven. Også, MN har en parallel vej til ulnar nerve i armen. Derfor kan ulnar nerven let bruges som nervetransplantat til reparation af MN skader. Endelig mn i rotter er placeret i forben, beslægtet med den menneskelige øvre lemmer; hos mennesker, er den øvre del af euforiserstedet stedet for de fleste perifere nervelæsioner.
Perifere nervelæsioner opstår regelmæssigt som følge af traumer, infektion, vaskulitis, autoimmunitet, malignitet og/eller strålebehandling1,2. Desværre, perifernerve reparation fortsætter med at præsentere klinisk uforudsigelige og ofte skuffende resultater3,4. Der er bred enighed om , at der stadig er behov for betydelig grund- og oversættelsesforskning for at forbedre udsigten til de berørte4,5,6,7.
Rotten MN viser store ligheder med mennesker8,9 (Figur 1). Stammer fra brachialplexus i aksillær regionen, denne nerve ned i den mediale aspekt af armen, nå albuen, og forgrening ud til de fleste af musklerne i ventrale rum i underarmen. MN når hånden, hvor den innervates thenar muskler og de første to lumbrical muskler samt til en del af rottens hånd hud9 (Figur 1).
Ved hjælp af rotte MN, er det muligt at tilstrækkeligt replikere perifere nervelæsioner hos mennesker10,,11,12. Denne nerve har flere potentielle forskningsfordele i forhold til den sædvanligvis anvendte iskiasnerven. Fordi MN er placeret i forbenet af rotter (beslægtet med den menneskelige øvre lemmer), kan det blive beskadiget eksperimentelt med en meget mindre indvirkning på rottens velbefindende, sammenlignet med iskiasnerven, som innervates en betydelig del af bækkenbenet13. Desuden forekommer de fleste kliniske læsioner hos mennesker i overekstremiteterne, hvilket svarer til rottens forben10,11,12,14,15,16.
Dette papir viser, hvordan man producerer forskellige typer af MN læsioner i rotten. Desuden præsenteres forskellige måder at simulere postoperativ fysioterapi. Endelig er der beskrevet test til vurdering af den funktionelle genvinding af mn’en. Der er flere standardiserede strategier til rådighed til at vurdere motoriske og sensoriske opsving ved hjælp af en MN model af perifernerve læsion og reparation, hvilket giver mulighed for en nem sammenligning af resultater. MN-modellen er særligt velegnet til at kopiere det kliniske scenario og lette ekstrapolering af resultater til den menneskelige art.
Dette papir præsenterer en protokol til at skabe forskellige typer af MN læsioner og reparation i rotten. Derudover, det illustrerer, hvordan man vurderer den funktionelle genopretning af denne nerve ved hjælp af flere noninvasive adfærdsmæssige tests og fysiologiske målinger.
Især flere af de funktionelle tests, der er beskrevet i dette papir, nemlig Stigen Running Test og Rope Test, er væsentligt afhængige af rottens vilje til at udføre opgaven med forventning om at opnå den mad belønning51,52,53. Det skal bemærkes , at visse rottestammer er mere modtagelige for uddannelse og udfører reproducerbart i denne type test51,52,53. For eksempel, Lewis rotter klarer sig dårligt i disse tests både i uddannelsesfasen og efterfølgende51,52,53.
Rottestald bør give rigelig bevægelsesfrihed i overensstemmelse med deres naturlige sonderende adfærd, ud over at tillade forsøgsdyr at blive fortrolig med nogle af de elementer, der er til stede i de funktionelle test19. Derfor vises forskellige former for boliger, der giver mulighed for større bevægelsesfrihed. De store bure er personlige med berigelseselementer, der senere anvendes i de funktionelle test (f.eks. reb og stiger).
Velsagtens, disse berigende elementer samt bure med indarbejdet løbehjul og de enkelte træningskugler giver en form for postoperativ fysioterapi svarende til den, der tilbydes til menneskelige patienter, der drives på det perifere nervesystem10.
Betydeligt, selv om nogle forfattere går ind dissekere de subkutane væv og muskel fasciae rent eller ved ren skæring med en række 15 skalpel, brugen af thermocautery når dissekere disse strukturer anbefales at minimere risikoen for postoperativ hæmatom.
Det skal bemærkes, at der er udarbejdet talrige test for at teste forskellige aspekter af perifer nervereparation hos rotten, nemlig regenerering af axoner, beskyttelse mod genindstråling og funktionel genopretning, hvoraf nogle ligger uden for denne undersøgelse29,54,55,56. For eksempel er kinematisk analyse29,36,55 og histomorfoometrisk vurdering29,36,57 bredt ansat af flere forfattere. Derudover indebærer flere af disse test variationer for at maksimere effektiviteten og/eller reproducerbarheden54. For eksempel kan mekanisk algisemetri (dvs. evaluering af reaktioner på mekaniske smertefulde stimuli) vurderes kvalitativt ved hjælp af en given von Frey filament, som beskrevet i dette papir, eller semikvantitativt ved hjælp af successivt stærkere von Frey filamenter, eller endda kvantitativt ved hjælp af elektroniske anordninger, der anvender stigende tryk, indtil en tilbagetrækning svar er observeret30,54.
Tilsvarende, selv om flere forfattere bruger walking track analyse til at evaluere forelimb nerve reparation i rotten, andre forfattere hævder, at enkelt MN læsioner ofte undlader at producere reproducerbare ændringer i pawprints10,58,59. Desuden har nogle udtalt, at disse ændringer ikke kan være proportional med muskel opsving10,60. Med dette i tankerne, nogle forskere har slået til lyd for brugen af gangspor analyse i forpoten primært ved vurderingen af inddrivelse efter knusning neve læsioner snarere end efter segmentelle nerve rekonstruktion10,50,61.
Gribetesten anvendes i vid udstrækning til at evaluere motoriske genindvindingaf de muskler , der kontrolleres af MN16,27. For at sikre ensartethed og reproducerbarhed af de data, der er opnået ved denne test, anbefales det at anvende grasping-testen ved hjælp af den veletablerede metode, der er foreslået af Bertelli et al.16. Men den nuværende protokol adskiller sig ved, at det ikke rutinemæssigt immobilisere den kontralaterale pote for at forhindre unødig stress11,27. Det skal også bemærkes, at andre forfattere, efter at have immobiliseret den uskadte pote, kvantitativt vurdere Gribetest ved hjælp af et dynamometer eller en skala27,56. Denne kvantitative evaluering kan dog blive påvirket af den styrke, som forskeren anvender på rottens hale26. Desuden er det vanskeligt at skelne mellem den styrke, der genereres af de digitale flexor muskler (udelukkende innervated af MN i rotten og formålet med Grasping Test9) fra den styrke, der produceres af håndleddet flexors, som omfatter flexor carpi ulnaris, der modtager sin innervation fra ulnar nerve9,10,27. For at forsøge at omgå disse potentielle bias, denne protokol bruger en ordenstal skala svarende til Medical Research Council Scale almindeligt anvendt til lønklasse muskelstyrke hos mennesker10,11,62. Alternativt har andre forfattere beskrevet en detaljeret vurdering af gribearbejde ved hjælp af videoanalyse og et videobaseret pointsystem11,63.
En potentiel ulempe ved at bruge MN i forhold til iskiasnerven er, at en større mængde information er tilgængelig vedrørende sidstnævnte nerve. Dette kan igen gøre det vanskeligere at sammenligne data , der er indhentet med mn, med data fra tidligereforsøgsarbejder46,48,64. Derudover, den mindre størrelse af MN i forhold til iskiasnerven gør kirurgisk manipulation mere udfordrende8,12,,27,56,65.
I modsætning til den metode, der er beskrevet i dette dokument, kan elektroneuromyografievalueringen udføres ved hjælp af transkutane monopolelektroder placeret i armen og thenarregionerne51. Selv om denne metode er mindre invasiv, indebærer den risiko for potentiel forvirring på grund af muligheden for costimulation af ulnarnerven i armregionen9,51.
De fleste forfattere er enige om, at ikke alle tests, der anvendes i rotten giver konkordans resultater, som perifernerve reparation afhænger af en kompleks vifte af faktorer, der omfatter neuron overlevelse, axonal forlængelse og beskæring, synaptogenese, vellykket generobring af denervated sensoriske organer og motoriske enheder, og hjernen plasticitet7,10,50,66,67.
Endelig skal det bemærkes, at en betydelig advarsel af gnavere modeller er, at rotte perifere nerver er meget tættere på deres ende organer og har meget mindre tværsnitsområder end de homologe menneskelige strukturer. Denne størrelsesforskel garanterer imidlertid hurtigere eksperimentelle data hos gnavere, og der kan forventes bedre samlede resultater hos rotter i forhold til mennesker68. Faktisk, flere forfattere advarer om, at pleje skal anvendes, når de forsøger at ekstrapolere eksperimentelle data opnået i perifernerve reparation ved hjælp af gnavere til mennesker7,69. Primatmodeller betragtes som mere sammenlignelige70. Ikke desto mindre er deres anvendelse forbundet med irriterende etiske, logistiske og budgetmæssige begrænsninger71.
Selvom iskiasnerven er den mest almindeligt anvendte nerve i perifer nerve forskning, rotte MN præsenterer flere fordele. For eksempel er MN læsioner forbundet med en mindre forekomst af fælles kontrakturer og automutilation af den berørte pote11,12,16,56. Betydeligt, autotomi efterfølgende til iskiasnerven transection plager 11-70% af rotter. Dette kan gøre aktuelle evalueringer som iskiasindekset umulige14. Dette gør til gengæld skønnet over antallet af dyr, der kræves for at opnå en given statistisk effekt, besværligt15.
Hertil kommer, da MN er kortere end iskiasnerven, nerve opsving er observeret hurtigere58,72,73,74,75,76. Endvidere, MN er ikke omfattet af muskelmasser, hvilket gør dens dissektion teknisk lettere end iskiasnerven16. Derudover har MN en parallel vej til ulnarnerven i armen. Derfor kan ulnar nerven nemt bruges som nervetransplantat til reparation af MN skader. Endelig, hos mennesker, de fleste perifere nervelæsioner forekommer i overekstremiteterne, hvilket yderligere understøtter brugen af denne nerve i rotte77,78.
Velsagtens, gnavere er de eksperimentelle dyr mest almindeligt anvendt i realm af perifere nerve reparation48,79. Som vist, rotte MN er en bekvem model af perifernervelæsion og reparation. Faktisk er der flere standardiserede strategier til rådighed til at vurdere motoriske og sensoriske opsving, der giver en lettere sammenligning af resultaterne36,46,60,80,81,82. Mange af disse metoder er noninvasive, giver mulighed for daglig vurdering.
Desuden er fysioterapi en del af standarden for pleje af patienter, der kommer sig efter perifere nerveskader. Som det fremgår af dette papir, der er flere strategier til at give en postoperativ fysioterapi-lignende miljø til rotter indsendt til MN skader4,5. Denne model er derfor særlig velegnet til at gentage det kliniske scenario og dermed lette ekstrapolering af resultaterne for den menneskelige art12,27,48,56,58,83.
Som det fremgår af dette papir, flere standardiserede strategier er tilgængelige for at vurdere motoriske og sensoriske opsving i MN model af rotten. De fleste af disse er ikke-invasive procedurer, der giver mulighed for hyppig vurdering. Desuden, som de fleste perifere nervelæsioner i den menneskelige art forekommer i den øvre del af eument, de nævnte eksperimentelle fysioterapi indstillinger kan mere rammende efterligne opsving i den kliniske sammenhæng. Velsagtens, dette kan lette ekstrapolering af resultater til den menneskelige art, yderligere validering af brugen af denne nerve i rotten.
The authors have nothing to disclose.
Diogo Casal modtog et tilskud fra The Program for Advanced Medical Education, som er sponsoreret af Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Forfatterne er meget taknemmelige for Mr. Filipe Franco for den illustrative tegning i figur 1. Forfatterne vil gerne takke den tekniske hjælp fra Mr. Alberto Severino i at filme og redigere videoen. Endelig vil forfatterne gerne takke Ms Sara Marques for hendes hjælp i alle de logistiske aspekter vedrørende erhvervelse af dyr og vedligeholdelse.
Acetaminophen | Amazon | https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG | |
Acland clamps | Fine Science Tools | 00398 V | http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf |
Acland Single Clamps B-1V (Pair) | Fine Science Tools | 396 | http://www.merciansurgical.com |
Biogel Surgical Gloves | Medex Supply | 30465 | https://www.medexsupply.com |
BSL Analysis | BIOPAC Systems | https://www.biopac.com/ | |
Castroviejo needle holders | Fine Science Tools | 12565-14 | http://s-and-t.ne |
Clamp applicator | Fine Science Tools | CAF-4 | http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf |
Constante voltage stimulator | BIOPAC Systems | STM200 | https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/ |
Cutasept skin disinfectant | Bode Chemie | http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php | |
Dafilon 10-0 | G1118099 | http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816 | |
Derf Needle Holders 12 cm TC | Fine Science Tools | 703DE12 | http://www.merciansurgical.com |
Dry heat sterilizer | Quirumed | 2432 | http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores |
Dynamometer | SAUTER | FH5 | https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/ |
Electroneuromiography setup | BIOPAC Systems | MP36 | https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/ |
Ethilon 5-0 | W1618 | http://www.farlamedical.co.uk/ | |
FLIR Software | FLIR | ||
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved | Fine Science Tools | 11052-10 | http://www.finescience.de |
Graph paper | Ambar | ||
Heat Lamp HL-1 | Harvard Apparatus | 727562 | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) | Universal Drugstore | http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml | |
High-Temperature Cautery | Fine Science Tools | AA03 | http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp |
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507220F | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Infrared camera | FLIR | E6 | http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/ |
Instrapac – Adson Toothed Forceps (Extra Fine) | Fine Science Tools | 7973 | http://www.millermedicalsupplies.com |
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7613-11 | http://www.merciansurgical.com |
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma- Aldrich | K113 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt®ion=PT |
Lacri-lube Eye Ointment 5g | Express Chemist | LAC101F | http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html |
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7652-14 | http://www.merciansurgical.com |
Meloxicam | Recropharma | Mobic | https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam |
Methylene Blue solution | Sigma- Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product | |
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 | Fine Science Tools | JF-5 | http://www.merciansurgical.com |
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 | Fine Science Tools | JFA-5b | http://www.merciansurgical.com |
Micro retractor | Fine Science Tools | RS-6540 | http://www.finescience.de |
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight | Fine Science Tools | 67 | http://www.merciansurgical.com |
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 | Fine Science Tools | D-5a.2 | http://www.merciansurgical.com |
Monosyn 5-0 | 15423BR | http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php | |
Normal saline for irrigation | Hospira, Inc. | 0409-6138-22 | http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts |
Operating microscope | Leica Surgical Microsystems | http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/ | |
Skin Skribe Surgical Skin Marker | Moore Medical | 31456 | https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1 |
Snacks | Versele-Laga | Complete Crock-Berry | http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry |
Straight mosquito forcep | Fine Science Tools | 91308-12 | http://www.finescience.de |
Surgical drapes | Barrier | 800430 | http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/ |
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml | Veet | http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/ |