Apresenta-se um protocolo para produzir diferentes tipos de lesões nervosas medianas (MN) e reparar no rato. Além disso, o protocolo mostra como avaliar a recuperação funcional do nervo utilizando vários testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas.
O principal objetivo desta investigação é mostrar como criar e reparar diferentes tipos de lesões nervosas medianas (MN) no rato. Além disso, são apresentados diferentes métodos de simulação da fisioterapia pós-operatória. Múltiplas estratégias padronizadas são utilizadas para avaliar a recuperação motora e sensorial utilizando um modelo MN de lesão e reparação do nervo periférico, permitindo assim fácil comparação dos resultados. Várias opções estão incluídas para fornecer um ambiente de fisioterapia pós-operatória para ratos que sofreram lesões de MN. Por fim, o artigo fornece um método para avaliar a recuperação do MN utilizando vários testes não invasivos (ou seja, teste de apreensão, teste de picada de pino, teste de caminhada de escada, teste de subida de corda e análise de pista de caminhada) e medidas fisiológicas (termografia infravermelha, eletroeuromiografia, avaliação de força de flexão e determinação do peso muscular flexor carpi radialis). Assim, esse modelo parece particularmente apropriado para replicar um cenário clínico, facilitando a extrapolação dos resultados para a espécie humana.
Embora o nervo ciático seja o nervo mais estudado na pesquisa do nervo periférico, a análise do rato MN apresenta várias vantagens. Por exemplo, há uma incidência reduzida de contraturas articulares e automutilação do membro afetado em estudos de lesão de MN. Além disso, o MN não é coberto por massas musculares, tornando sua dissecção mais fácil do que a do nervo ciático. Além disso, a recuperação de MN é observada mais cedo, porque o MN é mais curto que o nervo ciático. Além disso, o MN tem um caminho paralelo para o nervo ulnar no braço. Assim, o nervo ulnar pode ser facilmente usado como enxerto nervoso para reparar lesões de MN. Finalmente, o MN em ratos está localizado no membro dianteiro, semelhante ao membro superior humano; em humanos, o membro superior é o local da maioria das lesões nervosas periféricas.
Lesões nervosas periféricas ocorrem regularmente como resultado de trauma, infecção, vasculite, autoimunidade, malignidade e/ou radioterapia1,2. Infelizmente, o reparo do nervo periférico continua a apresentar resultados clinicamente imprevisíveis e frequentemente decepcionantes3,4. Há um consenso generalizado de que ainda é necessária uma pesquisa básica e translacional considerável para melhorar a perspectiva dos afetados4,5,6,7.
O rato MN apresenta grandes semelhanças com o dos seres humanos8,9 (Figura 1). Originário do plexo braquial na região axilar, este nervo desce para o aspecto medial do braço, atingindo o cotovelo, e ramificando-se para a maioria dos músculos no compartimento ventral do antebraço. O MN alcança a mão, onde inerva os músculos tenar e os dois primeiros músculos lumbrical, bem como parte da pele da mão do rato9 (Figura 1).
Utilizando o rato MN, é possível replicar adequadamente lesões nervosas periféricas em humanos10,,11,12. Este nervo tem várias vantagens potenciais de pesquisa em relação ao nervo ciático habitualmente usado. Como o MN está localizado no membro dianteiro dos ratos (semelhante aos membros superiores humanos), ele pode ser danificado experimentalmente com um impacto muito menor no bem-estar do rato, em comparação com o nervo ciático, que inerva uma porção substancial do membro pélvico13. Além disso, em humanos a maioria das lesões clínicas ocorre no membro superior, que corresponde ao membro dianteiro do rato10,,11,12,14,15,16.
Este artigo mostra como produzir diferentes tipos de lesões de MN no rato. Além disso, são apresentadas diferentes formas de simular fisioterapia pós-operatória. Por fim, são descritos testes para avaliar a recuperação funcional do MN. Existem múltiplas estratégias padronizadas disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial utilizando um modelo MN de lesão e reparação do nervo periférico, permitindo assim uma fácil comparação dos resultados. O modelo MN é particularmente adequado para replicar o cenário clínico, facilitando a extrapolação dos resultados para a espécie humana.
Este artigo apresenta um protocolo para criar diferentes tipos de lesões de MN e reparar no rato. Além disso, ilustra como avaliar a recuperação funcional desse nervo utilizando vários testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas.
Notavelmente, vários dos testes funcionais descritos neste artigo, ou seja, o Teste de Corrida de Escada e o Teste da Corda, dependem significativamente da disposição do rato para realizar a tarefa com a expectativa de obter a recompensa alimentar51,52,53. Deve-se notar que certas cepas de ratos são mais passíveis de treinamento e realização reprodutivelmente neste tipo de testes51,52,53. Por exemplo, os ratos de Lewis têm um desempenho ruim nestes testes tanto na fase de treinamento quanto,posteriormente,51,52,53.
A habitação de ratos deve permitir ampla liberdade de movimento de acordo com seu comportamento exploratório natural, além de permitir que os animais experimentais se familiarizem com alguns dos elementos presentes nos testes funcionais19. Portanto, diferentes formas de moradia que permitem maior liberdade de movimento são mostradas. As gaiolas grandes são personalizadas com elementos de enriquecimento que são posteriormente utilizados nos testes funcionais (por exemplo, cordas e escadas).
Indiscutivelmente, esses elementos enriquecedores, bem como as gaiolas com rodas de corrida incorporadas e as esferas de treinamento individuais fornecem uma forma de fisioterapia pós-operatória semelhante à oferecida aos pacientes humanos operados no sistema nervoso periférico10.
Significativamente, embora alguns autores defendam dissecar os tecidos subcutâneos e as fáscias musculares sem rodeios ou por corte limpo com um bisturi número 15, recomenda-se o uso de termocauterismo ao dissecar essas estruturas para minimizar o risco de hematoma pós-operatório.
Deve-se notar que inúmeros testes foram elaborados para testar diferentes aspectos da reparação do nervo periférico no rato, ou seja, regeneração axonal, reinervação de alvo e recuperação funcional, alguns dos quais estão além do escopo deste estudo29,54,55,56. Por exemplo, a análise cinemática29,36,55 e avaliação histomorfométrica29,36,57 são amplamente empregadas por múltiplos autores. Além disso, vários desses testes envolvem variações para maximizar a eficiência e/ou reprodutibilidade54. Por exemplo, a algisemetria mecânica (ou seja, avaliação de respostas a estímulos mecânicos dolorosos) pode ser avaliada qualitativamente usando um dado filamento von Frey, como descrito no presente artigo, ou semiquantitativamente usando filamentos von Frey sucessivamente mais fortes, ou mesmo quantitativamente usando dispositivos eletrônicos que aplicam pressões crescentes até que uma resposta de retirada seja observada30,54.
Da mesma forma, embora vários autores utilizem a análise de pista de caminhada para avaliar o reparo do nervo de membros dianteiros no rato, outros autores argumentam que lesões únicas de MN frequentemente não produzem alterações reprodutíveis nas patas10,58,59. Além disso, alguns afirmaram que essas alterações podem não ser proporcionais à recuperação muscular10,60. Tendo isso em mente, alguns pesquisadores têm defendido o uso da análise de pista de caminhada na pata dianteira principalmente na avaliação da recuperação após esmagamento das lesões de neve e não após reconstrução do nervo segmental10,50,61.
O Teste de Apreensão é amplamente utilizado para avaliar a recuperação motora dos músculos controlados pelo MN16,27. Para garantir a uniformidade e a reprodutibilidade dos dados obtidos com este teste, recomenda-se a aplicação do Teste de Apreensão utilizando a metodologia bem estabelecida proposta por Bertelli et al.16. No entanto, o protocolo atual difere na forma de não imobilizar rotineiramente a pata contralateral para evitar estresse indevido11,27. Deve-se notar também que outros autores, após imobilizar a pata ilesa, avaliam quantitativamente o Teste de Apreensão utilizando um dinamômetro ou uma escala27,56. No entanto, essa avaliação quantitativa pode ser afetada pela força que o pesquisador aplica à cauda do rato26. Além disso, é difícil distinguir entre a força gerada pelos músculos flexores digitais (unicamente inervados pelo MN no rato e o objeto do Teste de Apreensão9) da força produzida pelos flexores de pulso, que incluem o flexor carpi ulnaris que recebe sua inervação do nervo ulnar9,10,27. Para tentar contornar esses vieses potenciais, este protocolo utiliza uma escala ordinal semelhante à Escala do Conselho de Pesquisa Médica comumente usada para classificar a força muscular em humanos10,11,62. Alternativamente, outros autores descreveram uma avaliação detalhada da apreensão usando análise de vídeo e um sistema de pontuação baseado em vídeo11,63.
Uma desvantagem potencial do uso do MN em comparação com o nervo ciático é que uma maior quantidade de informação está disponível em relação ao último nervo. Isso, por sua vez, pode fazer comque os dados obtidos com o MN com os de trabalhos experimentais anteriores mais difíceis46,48,64. Além disso, o tamanho menor do MN em relação ao nervo ciático torna a manipulação cirúrgica mais desafiadora8,12,27,56,65.
Ao contrário da metodologia descrita neste artigo, a avaliação da eletroneuromiografia pode ser realizada utilizando eletrodos monopolares transcutâneos colocados no braço e nas regiões ternar51. Apesar de menos invasivo, este método apresenta o risco de confusão potencial devido à possibilidade de coestimulação do nervo ulnar na região do braço9,51.
A maioria dos autores concorda que nem todos os testes utilizados no rato fornecem resultados concordantes, pois a reparação do nervo periférico depende de uma complexa gama de fatores, compreendendo a sobrevivência dos neurônios, alongamento e poda axonal, sinaptogênese, recaptura bem sucedida dos órgãos sensoriais e unidades motoras denervadas, e plasticidade cerebral7,10,50,66,67.
Finalmente, deve-se notar que uma ressalva significativa dos modelos de roedores é que os nervos periféricos de ratos estão muito mais próximos de seus órgãos finais e têm áreas transversais muito menores do que as estruturas humanas homólogas. No entanto, essa diferença de tamanho garante dados experimentais mais rápidos em roedores, e melhores resultados gerais em ratos em comparação com humanos são esperados68. De fato, vários autores alertam que o cuidado deve ser utilizado ao tentar extrapolar dados experimentais obtidos na reparação de nervos periféricos usando roedores para humanos7,69. Modelos primatas são considerados mais comparáveis70. No entanto, seu uso está associado a restrições éticas, logísticas e orçamentárias vexatórias71.
Embora o nervo ciático seja o nervo mais comumente usado na pesquisa do nervo periférico, o rato MN apresenta múltiplas vantagens. Por exemplo, as lesões de MN estão associadas a uma menor incidência de contraturas articulares e automutilação da pata afetada11,,12,,16,56. Significativamente, a autotomia subseqüente à transsecção do nervo ciático aflige 11-70% dos ratos. Isso pode tornar as avaliações atuais como o índice ciático impossível14. Isso, por sua vez, faz com que a estimativa do número de animais necessários para obter um determinado poder estatístico seja complicada15.
Além disso, como o MN é mais curto que o nervo ciático, a recuperação nervosa é observada mais cedo58,72,73,74,75,76. Além disso, o MN não é coberto por massas musculares, tornando sua dissecção tecnicamente mais fácil do que a do nervo ciático16. Além disso, o MN tem um caminho paralelo para o nervo ulnar no braço. Assim, o nervo ulnar pode ser facilmente usado como enxerto nervoso para reparar lesões de MN. Finalmente, em humanos, a maioria das lesões nervosas periféricas ocorrem no membro superior, o que suporta ainda mais o uso desse nervo no rato77,78.
Indiscutivelmente, os roedores são os animais experimentais mais comumente utilizados no reino da reparação do nervo periférico48,79. Como mostrado, o rato MN é um modelo conveniente de lesão e reparação do nervo periférico. De fato, existem múltiplas estratégias padronizadas disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial, permitindo uma comparação mais fácil dos resultados36,,46,,60,,80,,81,,82. Muitos desses métodos são não invasivos, permitindo uma avaliação diária.
Além disso, a fisioterapia faz parte do padrão de atendimento dos pacientes que se recuperam de lesões nervosas periféricas. Como demonstrado neste artigo, existem múltiplas estratégias para fornecer um ambiente pós-operatório de fisioterapia a ratos submetidos às lesões de MN4,5. Assim, este modelo é particularmente adequado para replicar o cenário clínico, facilitando a extrapolação dos resultados para a espécie humana12,27,48,56,58,83.
Como mostrado neste artigo, várias estratégias padronizadas estão disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial no modelo MN do rato. A maioria deles são procedimentos não invasivos, permitindo avaliação frequente. Além disso, como a maioria das lesões nervosas periféricas na espécie humana ocorre no membro superior, as configurações de fisioterapia experimental mencionadas podem imitar mais adequadamente a recuperação no contexto clínico. Indiscutivelmente, isso pode facilitar a extrapolação de resultados para a espécie humana, validando ainda mais o uso deste nervo no rato.
The authors have nothing to disclose.
Diogo Casal recebeu uma bolsa do Programa de Educação Médica Avançada, que tem o patrocínio da Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Os autores são muito gratos ao Sr. Filipe Franco pelo desenho ilustrativo na Figura 1. Os autores agradecem a ajuda técnica do Sr. Alberto Severino na filmagem e edição do vídeo. Por fim, os autores agradecem à sra. Sara Marques pela ajuda em todos os aspectos logísticos relativos à aquisição e manutenção dos animais.
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