Der fremlægges en detaljeret protokol for generering af selv monterede humane protein-mikrosystemer til screening af kinasehæmmere.
Screeningen af kinasehæmmere er afgørende for bedre at forstå egenskaberne af et lægemiddel og for identifikationen af potentielt nye mål med kliniske konsekvenser. Flere metoder er blevet rapporteret til at udføre en sådan screening. Men hver har sine egne begrænsninger (f. eks. screening af kun ATP-analoger, begrænsning til brug af renset kinase domæner, betydelige omkostninger i forbindelse med testning af mere end et par kinaser ad gangen, og manglende fleksibilitet i screening protein kinaser med nye mutationer). Her, en ny protokol, der overvinder nogle af disse begrænsninger og kan anvendes til objektiv screening af kinasehæmmere er præsenteret. En styrke af denne metode er dens evne til at sammenligne aktiviteten af kinasehæmmere på tværs af flere proteiner, enten mellem forskellige kinaser eller forskellige varianter af samme kinase. Selv monterede protein-mikrosystemer, der genereres ved ekspression af proteinkinaser ved hjælp af et human-baseret in vitro-transskriptions-og oversættelsessystem (IVTT), er ansat. De proteiner, der vises på mikrosystemet, er aktive, hvilket gør det muligt at måle virkningerne af kinasehæmmere. Følgende procedure beskriver de protokol trin i detaljer, fra mikroarray generation og screening til dataanalyse.
Protein kinaser er ansvarlige for fosforylering af deres mål og kan moduere komplekse molekylære veje, der styrer mange cellulære funktioner (dvs. celle spredning, differentiering, celledød og overlevelse). Deregulering af kinase aktivitet er forbundet med mere end 400 sygdomme, hvilket gør kinasehæmmere en af de vigtigste klasser af lægemidler til rådighed til behandling af flere sygdomme, herunder kræft, kardiovaskulære og neurologiske lidelser samt inflammatoriske og autoimmune sygdomme1,2,3.
Med fremkomsten af præcision medicin, identifikation af nye terapier, især kinasehæmmere, har stor appel farmaceutisk og klinisk. Flere tilgange kan anvendes til identifikation af mulige nye par kinase/kinasehæmmere, herunder de Novo design af kinasehæmmere og identifikation af nye mål for eksisterende FDA-godkendte lægemidler. Sidstnævnte er særligt attraktivt, da den tid og penge, der kræves for at gennemføre disse lægemidler i klinikker er drastisk reduceret på grund af tilgængeligheden af tidligere kliniske forsøg data. Et kanonisk eksempel på repurat af en kinasehæmmer er Imatinib, der oprindeligt er designet til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML) gennem hæmning af BCR-ABL, som også kan anvendes med succes til behandling af c-kit over-udtrykker gastrointestinale stromale tumorer (gists)4,5,6,7.
Screeningen af kinasehæmmere kan udføres i bindende assays eller enzymatiske analyser. Den første klasse af assays fokuserer på protein-Drug interaktioner og kan give oplysninger såsom ligering sted og affinitet. Da aktiviteten af kinase på tidspunktet for disse assays er ukendt, en række interaktioner kan gå glip eller falsk identificeret på grund af konformationelle ændringer i proteinet. På den anden side kræver enzymatiske analyser, at proteinkinaser er aktive og giver værdifulde oplysninger om inhibitorer virkning på enzymaktivitet, men denne type screening er generelt mere tidskrævende og dyrt. I øjeblikket er begge typer af assays kommercielt tilgængelige fra flere kilder. De udgør en pålidelig mulighed for screening af kinasehæmmere med nogle få begrænsninger, herunder: I) de fleste af metoderne omfatter testning af flere kinaser individuelt, hvilket kan gøre screeningen af et stort sæt af proteiner dyrt; II) det sæt af kinaser, der skal testes, er begrænset til en liste over forudvalgte, vildtype kinaser og flere velkendte muterede versioner af nogle kinaser, der hindrer afprøvning af mange nye muterede isoformer.
I denne sammenhæng er protein mikrosystemer en kraftfuld platform, der er i stand til at overvinde nogle af de begrænsninger, der er præsenteret af kommercielt tilgængelige teknikker. Det er egnet til at udføre enzymatiske-baserede assays i High-gennemløb screening ved hjælp af fuld-længde, aktive proteiner af enhver sekvens af interesse. Mikromatricer kan genereres af en selvstændig samlet tilgang som NAPPA (nukleinsyre programmerbare protein array), hvor proteiner udtrykkes lige i tide til assays, øge sandsynligheden for, at dem, der vises på array er faktisk aktive. De proteiner, der vises på NAPPA produceres ved hjælp af menneske afledte ribosomer og chaperone proteiner for at forbedre sandsynligheden for naturlig foldning og aktivitet.
Proteinerne er oprindeligt programmeret ved at udskrive cDNAs kodning for gener af interesse smeltet med en Capture tag, sammen med en Capture agent, på mikromatrixens overflade. Proteinerne produceres derefter på mikromatricer ved hjælp af et in vitro transkriptionsog oversættelses (IVTT) system, og de frisk udtrykte proteiner er immobiliseret på mikromatrixens overflade af opsamlings agenten. Udtrykte Nappa arrays kan bruges til studiet af de proteiner, der vises på arrayet i en objektiv, høj gennemløb måde8,9.
Tidligere viste det sig, at proteiner, der vises på NAPPA-matricer, er foldet korrekt for at interagere med kendte partnere10; Desuden blev deres enzymatiske aktivitet først udnyttet i 2018, hvor det blev påvist, at protein kinaser vist på microarray autophosphorylat11. Nappa-metodologien er til dato blevet anvendt til mange forskellige anvendelser, herunder biomarkør opdagelse12,13,14,15,16,17, protein-protein interaktioner10,18, substrat identifikation19, og Drug screening11. Dens fleksibilitet er en af platformens vigtigste egenskaber, der giver mulighed for tilpasning til hver applikation.
Her præsenteres en protokol til screening af tyrosinkinasehæmmere i selv monterede NAPPA-arrays. Platformen er optimeret til visning af aktive humane proteinkinaser og til analyse af proteinkinaseaktivitet med lav baggrund og højt dynamikområde. Blandt de ændringer, der er implementeret for at bruge NAPPA til screening af kinasehæmmere, omfatter: I) ændringer i Tryk Kemi, II) de-fosforylering af protein mikrosystemet før kinasehæmmer screeningen, og III) optimering af påvisning af fosforylerede proteiner på arrayet. Denne protokol er den første af sin art og giver unikke oplysninger om kinase-studiet i NAPPA-mikroarrays.
Ændringer og fejlfinding
I optimeringsfasen af studiet af kinaseaktivitet på NAPPA-matricer var en af de vigtigste kilder til baggrund og lavt dynamisk område observeret den BSA, der blev anvendt på udskrifts blandingen. BSA var at levere de primære aminer nødvendige for binding med aminosilan overflade og var fældefangst DNA og Capture antistof på stedet. BSA er imidlertid meget fosforyleret, hvilket gør det vanskeligt for påvisning af autophosphorylations signalet på matrixen over baggrundsstøjen. For at løse dette problem, flere alternativer til BSA i trykning mix blev testet, og poly-lysin blev identificeret som god erstatning. Poly-lysin mangler nogen fosforylering site; Derfor er baggrunden fra ikke-udtrykte arrays meget minimal. Desuden er mikroarrays trykt med poly-lysin reproducerbare og vise gode niveauer af proteiner (figur 2).
Den næste kritiske modifikation, der blev udført på standard NAPPA-analysen, var tilføjelsen af et phosphatase/DNase-behandlingstrin. Behandlingen af mikroarrays med fosfatase gør det muligt at fjerne enhver fosforylering, der forekom i IVTT-blandingen under proteinsyntese og-opsamling (figur 3). Kilden til denne fosforylering kan være fra iboende autophosphorylering aktivitet eller fra aktiviteten af kinaser til stede i IVTT mix. Fjernelsen af al fosforylering efter ekspression gjorde det let at identificere de kinaser, der er aktive og kan gennemgå autophosphorylering (figur 3).
Kritiske trin i protokollen
NAPPA er en robust teknologi, men som forventet er der flere kritiske trin. Den første er erhvervelsen af høj kvalitet DNA i den relevante koncentration. Ved hjælp af DNA af dårlig kvalitet eller i lave koncentrationer vil generere dårlig kvalitet mikroarrays med flere funktioner, der ikke udtrykkes og vises i de relevante niveauer, faldende antallet af proteiner analyseret på array. Det andet kritiske trin er ekspression af proteiner på mikrosystemet. Brugen af et IVTT-system, der vil udtrykke høje niveauer af funktionelt protein er afgørende for at studere kinase aktivitet på array.
Det næste kritiske trin på TKI-screeningen er, hvordan mikrosystemerne håndteres. Mikromatricer bør ikke tørre under et hvilket som helst trin i protokollen, og skånsom håndtering anbefales for at forhindre ridser, der kan øge baggrunds signalet. Da arrays fra hele eksperimentet vil blive sammenlignet med hinanden, er det vigtigt at sikre, at alle inkubations trin er endda på tværs af alle slides. For eksempel skal den tid, der kræves for at udføre et trin i en enkelt matrix, tages i betragtning, når et parti på 20 matricer behandles for at forhindre forskelle i inkubations længden på tværs af matricer.
Endelig er udformningen af eksperimentet og inddragelsen af både positive og negative kontroller afgørende for kvalitetskontrol og dataanalyse. Det første sæt kontrolelementer er dem, der er trykt i hver matrix, og omfatter negative kontrolelementer [dvs. tomme pletter (uden materiale trykt), vand eller tom vektor (kun udtrykke tagget)] samt en positiv kontrol (dvs. renset IgG, som detekteres af sekundært antistof og er inert over for ændringer i fosforylerings niveauerne). Tilsammen måler de baggrundsniveauerne for mikrosystemet, mulig overførsel under udskrivningen og signal intensiteten af detekterings metoden.
Det næste sæt af kontroller er Drug screening kontrol og omfatter defosforylerede og autophosphorylated mikroarrays (i nærværelse af eller fravær af DMSO). Som tidligere nævnt måler det defosforylerede mikroarray niveauet af fosforylering efter fosfatasebehandling og dermed basisniveauet for alle andre eksperimenter. Jo lavere baselineniveau er, jo højere er det dynamiske område af assays. De autophosphorylated arrays præsentere den maksimale fosforylering niveauer af alle arrays og signalet skal være stærk og klar. Det bruges til dataanalyse, men også som et kontrolelement, at alle reaktioner blev udført med succes på arrayet.
Begrænsninger af teknikken
Som i nu, en af begrænsningerne af Drug screening præsenteret her er dens evne til at screene kun protein kinaser, der kan være autophosphorylated. En mulig måde at overvinde dette på er ved at udskrive en kinase og et kendt substrat på samme sted. Co-trykning af DNA for to forskellige proteiner blev gennemført15, hvilket tyder på gennemførligheden af denne fremgangsmåde. Desuden kan det protein, der vises på arrayet, ikke foldes korrekt, hvilket resulterer i et inaktivt protein. Brugen af human-baserede udtryks system gjort en betydelig forbedring i kinase aktivitet målt på array; dog kan nogle proteiner stadig ikke analyseres på arrayet på grund af dets inaktivitet.
En anden begrænsning er målingen af fosforylering ved hjælp af et pan anti-phospho-tyr antistof. På trods af sin ikke-specificitet vedrørende motivet på fosforylerings stedet forekom alle målte fosforyleringer på tyrosinrester og efterlod seriner og threoniner og deres respektive kinaser. Til dato, mere end 10 pan phospho-ser/thr antistoffer er blevet testet uden succes, på trods af flere forsøg på at optimere inkubation og vaske betingelser. Et nyt detekteringssystem, der er uafhængigt af antistoffer, kan være den bedste mulighed for at udvide antallet af proteinkinaser, der kan screenes for narkotika hæmning. I denne sammenhæng er der et par muligheder, herunder radioaktivitet eller kemiske tilgange som Click konjugering. En række optimeringer er nødvendige for at minimere baggrunds signalet og give et godt dynamisk område for assays.
Den tredje begrænsning er erhvervelsen af cDNA-kloner, der skal trykkes på arrayet. CDNA-klonerne kan genereres ved hjælp af enhver klonings teknik, herunder stedspecifikke rekombinationsystemer, såsom Creator eller gateway23. En anden mulighed er at købe klonerne fra DNAsu Library, der findes på , hvor mere end 17.000 cDNAs kloner, herunder hele menneskelige kinome, er let tilgængelige til at blive brugt til opførelse af NAPPA arrays24 .
Den fjerde begrænsning er, at ikke alle laboratorier er udstyret med passende udstyr til at fabrikere og screene deres egne NAPPA arrays. Denne protokol giver alternative metoder til at generere den DNA, der skal udskrives på mikrosystemet, uden behov for højt gennemløb udstyr, og protokoller til manuelt at udføre alle de hybridisering trin. Men, adgang til en Arrayer og microarray scanner er stadig nødvendigt. En mulighed for at løse dette problem er at bruge NAPPA Core-tjenesten og-faciliteten, der findes på , som distribuerer tilpassede NAPPA-mikroarrays til en nonprofit akademisk pris. Endelig er de data, der indhentes på matrixer, som ved enhver screeningmetode modtagelige for artefakter (enten positive eller negative) og bør derfor valideres ved hjælp af ortogonale analyser.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Flere platforme er tilgængelige kommercielt til screening af protein kinaser. En metode rutinemæssigt anvendes, er bindende assays, som kan udføres med proteinfragmenter, kinase domæne, større proteinfragmenter med kinase domæne og nogle regulerende regioner, og selv fuld-længde proteiner. Proteinerne udtrykkes sædvanligvis i bakterie systemer på grund af omkostningerne og enkelheden i udtryks-og rensnings protokollerne. Samspillet mellem det stof af interesse og proteinet måles derefter med nogle type rapport assay som fluorescens eller tilstedeværelsen af Tags, for eksempel. Den vigtigste begrænsning af dette sæt af tilgange er det faktum, at proteinet ikke nødvendigvis er aktiv under interaktionen med lægemidlet, hvilket kan resultere i identifikationen af falsk positive og falsk negative interaktioner. Protein fragmenter er særligt sårbare over for ændringer i kropsbygning og manglende aktivitet, og alle de opnåede data bør valideres ved hjælp af aktive proteiner, fortrinsvis i deres fuld længde form. En anden begrænsning af nogle af platformene er evnen til at screene kun ATP analogerne, begrænse dens samlede brug.
De fleste af de kommercielt tilgængelige tjenester til screening af TKIs ved hjælp af enzymatiske baserede tilgange udnytter kun vilde type versioner af kinase af interesse, og nogle gange kun en udvalgt par mutanter. Vel vidende, at resistens over for lægemidler er meget almindelig hos patienter behandlet med TKI, det er vigtigt at være i stand til at måle narkotika respons i forskellige mutanter, for udvælgelsen af den mest hensigtsmæssige inhibitor. På grund af nappas natur er screeningen af kinasemutanter enkel og let at gennemføres, og det eneste nødvendige værktøj er inkorporering af kinase-mutanten i NAPPA cDNA-samlingen, som f. eks.
Fremtidige ansøgninger
En af de mest almindeligt forekommende former for behandling forløber i kræftbehandling ved hjælp af kinasehæmmere er erhvervelse af mutationer i drug target under et behandlingsforløb. Screeningen af disse mutanter med hensyn til deres respons på kinasehæmmere er af vital betydning for udvælgelsen af anden/tredje generation af TKIs for at opnå en personlig behandling for hver patient. Den Drug screening tilgang præsenteret her, giver en objektiv screening platform, hvor enhver tyrosinkinasehæmmer kan testes mod et panel af tyrosinkinaser til stede i det menneskelige genom. Da de proteiner, der vises på NAPPA-matricer, udtrykkes in vitro fra det cDNA, der er trykt på diaset, kan enhver mutant variant nemt inkorporeres i cDNA-samlingen, der skal vises på arrayet. Det anlæg, hvor kinasemutanterne kan genereres og udtrykkes på arrayet, kombineret med NAPPA-Teknikens høje gennemløbs effekt, giver et unikt miljø til studiet af kinasemutanter og deres respons på stoffer, hvilket gør NAPPA egnet til personlig Drug screening, et af målene for Precision Medicine.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke alle på LaBaer Lab for deres hjælp og kritik under udviklingen af projektet. Dette projekt blev støttet af NIH Grant U01CA117374, U01AI077883 og Virginia G. Piper Foundation.
Reagent/Material | |||
364 well plates (for arraying) | Genetix | x7020 | |
800 µL 96-well collection plate | Abgene | AB-0859 | |
96-pin device | Boekel | 140500 | |
Acetic Acid | Millipore-Sigma | 1.00066 | |
Acetone 99.9% | Millipore Sigma | 650501 | |
Aluminum seal for 96 well plates | VWR | 76004-236 | |
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) | Pierce | 80370 | |
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Millipore Sigma | F3165 | |
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) | Millipore Sigma | F7425 | |
ATP 10 mM | Cell Signaling | 9804S | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Millipore-Sigma | G9422 | |
bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
Blocking Buffer | ThermoFisher/Pierce | 37535 | |
Brij 35 | ThermoFisher/Pierce | BP345-500 | |
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) | ThermoFisher/Pierce | 21580 | |
BSA (bovine serum albumin) | Millipore Sigma | A2153 | |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 48393-106 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | |
DeepWell Block, case of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0661 | |
DEPC water | Ambion | 9906 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Millipore-Sigma | D8418 | |
DNA-intercalating dye | Invitrogen | P11495 | |
DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
DTT | Millipore-Sigma | 43816 | |
EDTA | Millipore-Sigma | EDS | |
Ethanol 200 proof | Millipore-Sigma | E7023 | |
Filter plates | Millipore-Sigma | WHA77002804 | |
Gas Permeable Seals, box of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0718 | |
Glass box | Wheaton | 900201 | |
Glass slides | VWR | 48300-047 | |
Glycerol | Millipore-Sigma | G5516 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Millipore-Sigma | H1758 | |
HEPES Buffer Solution | Millipore-Sigma | 83264 | |
Human-based IVTT system | Thermo Scientific | 88882 | |
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule | ThermoFisher/Pierce | 31202 | |
Isopropanol | Millipore-Sigma | I9516 | |
KCl (Potassium chloride) | Millipore-Sigma | P9333 | |
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) | Millipore-Sigma | P5655 | |
Kinase buffer | Cell Signaling | 9802 | |
KOAc (Potassium acetate) | Millipore-Sigma | P1190 | |
Lambda Protein Phosphatase | new england biolabs | P0753 | |
Lifterslips, 24 x 60 mm | ThermoFisher Scientific | 25X60I24789001LS | |
Metal 30-slide rack with no handles | Wheaton | 900234 | |
MgCL2 (Magnesium chloride) | Millipore-Sigma | M8266 | |
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) | Millipore-Sigma | S6508 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Millipore-Sigma | S3014 | |
NaOAc (Sodium acetate) | Millipore-Sigma | S2889 | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Millipore-Sigma | S8045 | |
NucleoBond Xtra Midi / Maxi | Macherey-Nagel | 740410.10 / 740414.10 | |
Nucleoprep Anion II | Macherey Nagel | 740503.1 | |
Phosphoric Acid | Millipore-Sigma | 79617 | |
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | Millipore-Sigma | A-005-C | |
Protein Phosphatase (Lambda) | New England Biolabs | P0753 | |
RNAse | Invitrogen | 12091021 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | L6026 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | 05030 | |
Sealing gasket | Grace Bio-Labs, Inc | 44904 | |
Silica packets | VWR | 100489-246 | |
Single well plate | ThermoFisher/Nalge Nunc | 242811 | |
Sodium acetate (3M, pH 5.5) | Millipore-Sigma | 71196 | |
TB media (Terrific Broth) | Millipore-Sigma | T0918 | |
Tris | IBI scientific | IB70144 | |
Triton X-100 | Millipore-Sigma | T8787 | |
Tryptone | Millipore-Sigma | T7293 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P9416 | |
Yeast Extract | Millipore-Sigma | Y1625 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipments | Maker/model | ||
Programmable chilling incubator | Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling | ||
Shaker for bacterial growth | ATR Multitron shaker | ||
Vacuum manifold with liquid waste trap | MultiScreenVacuum Manifold 96 well | ||
96 well autopippetor/liquid handler | Genmate or Biomek FX | ||
Liquid dispenser | Wellmate | ||
DNA microarrayer | Genetix QArray2 | ||
Automatic hybridization station | Tecan HS4800 Pro Hybridization Station | ||
Microarray scanner | Tecan PowerScanner | ||
Microarray data quantification | Tecan Array-ProAnalyzer 6.3 |