פרוטוקול לסינתזה ומדידה של המאפיינים הפוטוכימיים של תרכובות בכלוב מודולרי עם moieties לחיץ מוצג.
תרכובות בכלוב לאפשר את הטיפול בתיווך התמונה של הפיזיולוגיה התא עם רזולוציה גבוהה הזמני. עם זאת, מגוון מבניים מוגבל של קבוצות כולאת זמין כעת ואת הקשיים בשינוי סינתטי מבלי להקריב את היעילות פוטוליזה שלהם הם מכשולים כדי להרחיב את הרפרטואר של תרכובות בכלוב עבור תאים חיים יישומים. כאשר השינוי הכימי של הקבוצה מסוג coumarin רין-התמונה היא גישה מבטיחה להכנת תרכובות בכלוב עם תכונות פיזיות וכימיות מגוונות, אנו מדווחים על שיטה לסינתזה של תרכובות בכלוב לחיץ שניתן לשנות בקלות עם יחידות פונקציונליות שונות באמצעות מחזוריות הנחושת (I)-מזרז הויסיזציה. המולקולה פלטפורמה מודולרית מכיל (6-bromo-7-הידרוקסיקוארין-4-yl) מתיל (bhc) הקבוצה כקבוצה צילום-caging, אשר מציג יעילות פוטוליזה גבוהה לעומת אלה של 2-ניטרובנזים קונבנציונאלי. הליכים כלליים להכנת תרכובות בכלוב לחיצים המכילים amines, אלכוהול, ו carboxylates מוצגים. מאפיינים נוספים כגון מסיסות המים ויכולת המיקוד התאים ניתן לשלב בקלות לתוך תרכובות בכלוב לחיץ. יתר על כן, התכונות הפיזיות והפוטוכימיות, כולל התשואה הקוונטית של פוטוליזיס, נמדדות ונמצאו מעולים לאלה של תרכובות הכלוב המקבילות של Bhc. לפיכך, הפרוטוקול המתואר יכול להיחשב לפתרון פוטנציאלי לחוסר גיוון מבני בתרכובות הכלוב הזמינות.
תרכובות בכלוב מתוכננים מולקולות סינטתיים, אשר הפונקציות המקוריות שלהם הן מסיכה באופן זמני על ידי קבוצות מחוברות הגנה באמצעות שמירה על התמונה. מעניין, תרכובות בכלוב של מולקולות רלוונטיות ביולוגית לספק שיטה הכרחית עבור השליטה זמן טמפורלית של הפיזיולוגיה התאית1,2,3,4,5 ,6. ב-1977, אנגלס ושלגר דיווחו על מחנה ה-2-ניטרולוקסיל של קמפ, כחומר לחדירות הקרום והנגזרת של מחנה7. בשנה הבאה דיווח קפלן על 1-(2-ניטרופניל) אתיל אסטר של ATP (NPE-ATP) וקרא למתחם זה “כלוב” ATP8. מאז, מגוון של קבוצות מגינים נשלפים כימית כגון 2-ניטרוגליצרין benzyls, p-הידרוקסיפנאס9, 2-(2-ניטרוגליצרין פניקסיל)10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, ו (coumarin-4-yl) מתושלח14,15,16 שימשו להכנת תרכובות בכלוב.
סינתזה של תרכובות בכלוב עם מאפיינים נוספים רצוי כגון חדירות הממברנה, מסיסות המים, ואת יכולת המיקוד הסלולר צפוי להקל על יישומים ביולוגיים התא. מאחר והתכונות הפיזיות והפוטוכימיות של מולקולות אלה תלויות בעיקר במבנה הכימי של קבוצות ההגנה הנשלפת של פוטוכימיקלים ששימשו להכנת המכונות, רפרטואר מגוון של קבוצות צילום-caging נדרש. עם זאת, מגוון מבניים של קבוצות כולאת זמין כרגע כי התצוגה יעילות פוטוליזה גבוהה היא מוגבלת. זה יכול להיות מכשול כדי להגדיל את השימוש בתרכובות בכלוב.
כדי לטפל בבעיה זו, הרפרטואר של קבוצות צילום-caging הורחב על ידי שינוי כימי של הקבוצה הקיימת הגנה מפני התמונות או עיצוב של photoremovable חדש כרומטוגרפי עם תכונות פוטופיסיים ופוטוכימיות מעולה. דוגמאות כוללות: נירורואכרופאריאן (ndbf)17, [3-(4, 5-דימוקסי-2-ניטרופניל) -2-בוטיל]18,19, מדגם 2-בנזיל-כלוב הפוטו20, התחליפי מתכות (DEAC45021 , דקסס22, 7-אזיטידיקסיל-4-מתילקוארין23, וסטיריל קומרנס24), cyanine נגזרות (cטרם-פאן)25, ונגזרים בודיפיה26,27.
בנוסף, פיתחנו בעבר (6-bromo-7-הידרוקסיקוארין-4-yl) מתיל (bhc) הקבוצה בהצלחה מסונתז תרכובות בכלובים שונים של נוירוטרנסמיטורים28, שליחים שני29,30, ו מ32,33 מציגאת החלקים הגדולים והשני של הפוטון. אם מאפיינים נוספים ניתן להתקין בקלות לתוך קבוצות כולאת מבלי להתפשר על רגישות התמונה שלהם, אז הרפרטואר של תרכובות בכלוב ניתן להרחיב34,35,36, 37,38,39. לפיכך עיצבנו תרכובות בכלוב מודולרי המרכיבות שלושה חלקים, כלומר הקבוצה Bhc כמו הליבה תגובה לתמונה, ידיות כימיות להתקנה של פונקציות נוספות, ואת המולקולות כי הם להיות רעולי פנים40, 41.
לפיכך, מאמר זה מספק שיטה מעשית להכנת תרכובות בכלוב של מולקולות רלוונטיות ביולוגית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להכנת פלטפורמה ללחיצה לקבוצות צילום, הכנסת פונקציות נוספות להרחבת הרפרטואר של תרכובות בכלובים, המדידה הפיזית והפוטוכימית ומיקוד התאים הסלקטיבי של מתחם כלוב לחיץ לצורך יישום סלולארי נוסף.
בעבר פיתחנו תרכובות בכלוב bhc של מולקולות פעיל ביולוגית שונים המוצגים יעילות photolytic גבוהה28,45,46,47. במטרה להרחיב את הרפרטואר של קבוצות bhc הזדקנות, אנו דיווחו גם על פלטפורמות של תרכובות בכלוב מודולרי שניתן לשנות בקלות על ידי המבוא של יחידות פונקציונליות שונות32,40,41. הפרוטוקול הנוכחי, לפיכך, מייצג שיטה לסינתזה של מבשר בלייזר של קבוצות Bhc הזדקנות שניתן לשנות באמצעות מחזוריות הנחושת (I). הסינתזה של הראשון לחיץ, פאבכצ2הו (2), הושג באמצעות רצף התגובה ארבעה צעדים החל מסחרית הזמין 4-ברומorcinol (איור 1a). היתרון של הפרוטוקול הנוכחי הוא שאין שלבי טיהור מפרך (לדוגמה, הפרדות כרומטוגרפיות של עמודות) נדרשות.
כפי שניתן ללחוץ עלהספר הראשון (2) בכדי להסוות קבוצות פונקציונליות שונות, תרכובות בכלוב לחיצים של amines, אלכוהול, ו-חומצות קרבוקסילית ו-מסונתז באמצעות 2 כקודמן (איור 1b). בעוד האלכוהול שונו. בתור הקרבונטים שלהם בהליכים כלליים 1 ו-2, CDI שימש להכנת carbamates הניתנים ללחיצה, בעוד שימוש ב-4 ניטרוגליצרין בכלורוקקסיל המשמש להכנת קרבונטים. כפי שמצוין על-ידי מנגנון התגובה, ניתן להשתמש בשני הריאגנטים להכנת כרמי וקרבונטים. יש לציין כי התשואה של תרכובת הכלוב הרצויה תלויה במבנה הכימי של המולקולה כדי להיות כלואה. דוגמאות אחרות ניתן לראות בדוחות הקודמים שלנו28,30,33,48.
השינוי בקליק התבצע לאחר מכן באמצעות שינוי קל של הפרוצדורה המדווחת49. התוספת של tris (triazolylmethyl תיל) אמין מבוססי ליגנדס הוא הכרחי כדי להשיג את המוצרים הרצויים בטוב לתשואות גבוהות. כיוון שמגוון רחב של אזימוט זמין הן ממקורות מסחריים והן מהליכי ספרות, אנו יכולים להכין תרכובות כליות מודולריות שונים עם מאפיינים נוספים כגון מסיסות מים ויכולת מיקוד הסלולר (איור 2).
התשואה הקוונטית של פוטטולזיס נמדדה על פי הליך מדווח28,50. איור 3 מראה כי הצריכה photolytic של 2 ʹ-GLC-ptx-פטק ושחרורו של ptx הוטלו על ידי ריקבון יחיד מעריכי ועלייה, בהתאמה, מציע לא סינון פנימי של הקרינה או תופעות משניות רצויות. משופר פוטוליזה התשואות הקוונטים (Φ) ו פוטוליזה יעילות (εΦ) נצפו על התרכובות בכלוב הלחיץ למדי לעומת אלה של תרכובות בכלוב שדווחו בעבר (שולחן 1)41, 43. מאחר והיעילות של הפוטטולוזיס (εΦ) של תרכובות בכלוב בכלובים גבוהה מ-100 פי שניים מאלה של48תרכובות בכלובים מסוג 2-ניטרווליקסיל, השיפור המסומן בשל נוכחותם של קבוצות פאבhc כולאת בבירור יתרון עבור מערכת זו.
כניסוי של הוכחת רעיון, הmoiety הידרופיפילית הוכנס לתוך 2 ʹ-פאבלודק-פאקס (4) והוכנס לתוך מתחם 3 (איור 2). מסיסות המים של 2 ʹ-glc-פמוקסיק-PTX היה 650 פעמים יותר גבוה מזו של ההורה PTX (שולחן 1). המיקוד הסלולר סלקטיבי הושג באמצעות מערכת תג-בדיקה, ופאבכצ-hex-הקס-FITC/Halo (8) הנושאת את הלוטאג ‘ ליגאג ‘ והייתה מכוונת בהצלחה לקרום התא של תאי היונקים המתורבתים המבטאים את חלבון ההיתוך של ההלותג/egfr ( איור 4). אפנון מתווכת התמונה של הלוקליזציה התת-תאית של קינאז הושג גם באמצעות מתחם כלוב לחיץ 5 (איור 5).
לסיכום, הדגמנו בהצלחה שיטה להכנת פלטפורמות לחיצים עבור תרכובות צילום בכלוב של מולקולות מעניינות ביולוגית, כי ניתן לשנות בקלות עם תכונות נוספות, כגון מסיסות המים הסלולר יכולת המיקוד. מאחר שקבוצת פאבhc כולאת יכולה לשמש להכנת כל מולקולות עם קבוצות פונקציונליות מסוימות, יישום הפרוטוקול הנוכחי אינו מוגבל למולקולות המתוארות להלן. באמצעות פלטפורמה מודולרית, כלומר הקבוצה פאבhc כולאת, תרכובות בכלוב הרצוי ניתן להכין בקלות, ואת התכונות הפיזיות והכימיות שלהם יכול להיות מאופנן באמצעות שינוי לחץ.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16H01282 (TF), מענק סיוע למחקר מדעי על אזורים חדשניים “הזיכרון דינמיות,” ו JP19H05778 (TF), “מולסרטים.”
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
chloroform | Kanto | 07278-71 | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% | FUJIFILM Wako | 032-12511 | |
dichloromethane, dehydrated | Kanto | 11338-05 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) | TCI Chemicals | D0254 | |
4-dimethylaminopyridine | TCI Chemicals | D1450 | |
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- | Kanto | 10380-05 | |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma | D6046-500ML | |
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW | Olympus | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako | 054-07225 | |
Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
hydrochloric acid | FUJIFILM Wako | 087-01076 | |
inverted fluorescent microscope IX-71 | Olympus | ||
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL | Biotage | 120-1906-D | |
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | FUJIFILM Wako | 196-01252 | |
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 | Olympus | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | 11668027 | lipofection reagent |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Dojindo | 345-01804 | MOPS |
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) | TCI Chemicals | C1400 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Thermo Fisher | 11058021 | reduced serum medium contains no phenol red |
1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate | FUJIFILM Wako | W01SRM19-5000 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Nacalai | 31115-05 | |
Sodium Bicarbonate | FUJIFILM Wako | 199-05985 | |
Sulfuric Acid, 96-98% | FUJIFILM Wako | 190-04675 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | ALDRICH | 762342-100MG | |
tri‐Sodium Citrate Dihydrate | Nacalai | 31404-15 | |
Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |