En protokoll for syntese og måling av fotokjemisk egenskaper av modulære bur forbindelser med klikkbare andeler presenteres.
Bur forbindelser aktivere Foto-mediert manipulering av cellen fysiologi med høy spatiotemporal oppløsning. Men den begrensede strukturelle mangfoldet av tiden tilgjengelig caging grupper og vanskelighetene i syntetisk modifikasjon uten å ofre sine photolysis effektivitet er hindringer for å utvide repertoaret av bur forbindelser for levende celle Programmer. Som kjemisk modifisering av kumarin-type Foto-caging grupper er en lovende tilnærming for utarbeidelse av bur forbindelser med ulike fysiske og kjemiske egenskaper, rapporterer vi en metode for syntese av klikkbare bur forbindelser som kan endres enkelt med ulike funksjonelle enheter via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering. Den modulære plattform molekylet inneholder en (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metyl (Bhc) gruppe som en foto-caging gruppe, som viser en høy photolysis effektivitet i forhold til de av konvensjonelle 2-nitrobenzyls. Generelle prosedyrer for utarbeidelse av klikkbare bur forbindelser som inneholder aminer, alkoholer, og carboxylates presenteres. Ytterligere egenskaper som vannløselighet og celle målretting evne kan lett innlemmes i klikkbare bur forbindelser. Videre ble den fysiske og fotokjemisk egenskaper, inkludert photolysis Quantum yield, målt og ble funnet å være overlegen de tilsvarende Bhc bur forbindelser. Den beskrevne protokollen kan derfor betraktes som en potensiell løsning for mangelen på strukturell mangfold i de tilgjengelige bur forbindelser.
Bur forbindelser er utformet syntetiske molekyler som opprinnelige funksjoner er timelig maskert av covalently vedlagt Foto-flyttbare beskytte grupper. Interessant, bur forbindelser av biologisk relevante molekyler gir en uunnværlig metode for spatiotemporal kontroll av cellulære fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977 rapporterte Engels og Schlaeger 2-nitrobenzyl Ester fra leiren som en membran gjennomtrengelig og photolabile derivat av cAMP7. Året etter, rapporterte Kaplan 1-(2-nitrophenyl) etanol Ester av ATP (NPE-ATP) og navngitt denne forbindelsen “bur” ATP8. Siden da, en rekke photochemically flyttbare beskytte grupper som 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, og (kumarin-4-YL) methyls14,15,16 har blitt brukt for utarbeidelse av bur forbindelser.
Syntesen av bur forbindelser med ønskelig ekstra egenskaper som membran permeabilitet, vannløselighet, og cellulære målretting evne ville være forventet å lette celle biologiske applikasjoner. Siden de fysiske og fotokjemisk egenskapene til disse molekylene først og fremst avhenger av den kjemiske strukturen til photochemically som er flyttbare, og beskytter grupper som brukes til å forberede dem, kreves det et mangfoldig repertoar av foto caging grupper. Imidlertid er det strukturelle mangfoldet i tiden tilgjengelige caging grupper som utviser høy photolysis effektivitet begrenset. Dette kan være et hinder for å øke bruken av bur forbindelser.
For å løse dette problemet, har repertoaret av foto-caging grupper blitt utvidet ved kjemisk modifisering av eksisterende photoremovable beskytte grupper eller utformingen av nye photolabile chromophores med overlegen photophysical og fotokjemisk egenskaper. Eksempler inkluderer nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4, 5-dimethoxy-2-nitrophenyl) -2-butyl] (DMNPB)18,19, en kalsium-følsom 2-nitrobenzyl photocage20, erstattet coumarinylmethyls (DEAC45021 , DEAdcCM–azetidinyl-4-methylcoumarin23, og styryl kumariner24), cyanine derivater (CyEt-Pan)25, og BODIPY derivater26,27.
I tillegg har vi tidligere utviklet (6-bromo-7-hydroksykumarin-4-YL) metyl (Bhc) gruppe og med hell syntetisert ulike bur forbindelser av nevrotransmittere28, andre Messengers29,30, og oligonukleotider31,32,33 utstilling stor en-og to-Foton eksitasjon tverrsnitt. Hvis flere egenskaper kan installeres lett inn i caging grupper uten å svekke deres foto, så repertoaret av bur forbindelser kan utvides34,35,36, 37,38,39. Vi har derfor designet modulære bur forbindelser som består av tre deler, nemlig Bhc gruppen som en foto-responsive kjerne, kjemiske håndtak for installasjon av ekstra funksjonalitet, og molekyler som skal være maskert40, i 41.
Dermed gir denne artikkelen en praktisk metode for utarbeidelse av bur forbindelser av biologisk relevante molekyler. Den nåværende protokollen beskriver metoder for utarbeidelse av en klikkbar plattform for foto-caging grupper, innføring av ytterligere funksjonalitet for å utvide repertoaret av bur forbindelser, måling av deres fysiske og fotokjemisk egenskaper, og cellen-type selektiv målretting av en klikkbar bur sammensatte for videre mobilnettet programmet.
Vi har tidligere utviklet Bhc bur forbindelser av ulike biologisk aktive molekyler som viser høy photolytic effektivitet28,45,46,47. Med sikte på å utvide repertoaret av Bhc caging grupper, har vi også rapportert plattformer av modulære bur forbindelser som kan endres enkelt ved innføringen av ulike funksjonelle enheter32,40,41. Den nåværende protokollen representerer derfor en metode for syntese av en klikkbar forløper for Bhc caging grupper som kan endres via kobber (I)-katalysert Huisgen syklisering. Syntesen av klikkbare forløper, paBhcCH2Oh (2), ble oppnådd via en fire-trinns reaksjons sekvens som starter fra den kommersielt tilgjengelige 4-bromoresorcinol (figur 1a). Fordelen med denne protokollen er at ingen arbeidskrevende rensing trinn (for eksempel kolonne kromatografiske separasjoner) er nødvendig.
Som klikkbar forløper paBhcCH2Oh (2) kan brukes til å maskere ulike funksjonelle grupper, klikkbare bur forbindelser av aminer, alkoholer, og kar bok syls syrer ble syntetisert med 2 som forløperen (figur 1B). Aminer ble modifisert som deres karbamater mens alkoholer ble modifisert som deres karbonater. I de generelle prosedyrene 1 og 2 ble CDI brukt til utarbeidelse av klikkbare karbamater, mens 4-nitrophenyl chloroformate ble benyttet for utarbeidelse av karbonater. Som indikert av reaksjons mekanismen, kan begge reagensene brukes til fremstilling av karbamater og karbonater. Det bør også bemerkes at avkastningen av ønsket bur sammensatte avhenger av den kjemiske strukturen av molekylet som skal bur. Andre eksempler kan sees i våre tidligere rapporter28,30,33,48.
Klikk modifikasjon ble deretter utført ved hjelp av en liten endring av den rapporterte prosedyren49. Tillegg av Tris (triazolylmethyl) Amin-basert ligander er nødvendig for å oppnå de ønskede produkter i god til høy avkastning. Siden en rekke azider er lett tilgjengelig både fra kommersielle kilder og fra litteratur prosedyrer, kan vi forberede ulike modulære bur forbindelser med flere egenskaper som vannløselighet og cellulære målretting evne (figur 2).
Kvantum utbyttet av photolysis ble deretter målt i henhold til en rapportert prosedyre28,50. Figur 3 viser at photolytic forbruket av 2 gepatotoksičnost-Glc-PABHCMOC-PTX og UTGIVELSEN av PTX ble rundet av enkelt-eksponentiell forfall og vekst, henholdsvis antyder ingen indre filtrering av stråling eller uønskede sekundære effekter. Forbedret photolysis Quantum rentene (Φ) og photolysis effektivitet (εΦ) ble observert for klikkbare paBhc bur forbindelser i forhold til de av tidligere rapporterte Bhc bur forbindelser (tabell 1)41, 43. siden photolysis effektivitet (εΦ) av Bhc bur forbindelser er mer enn 100 ganger høyere enn for 2-nitrobenzyl-type bur forbindelser48, den markerte forbedringen på grunn av tilstedeværelsen av paBhc caging grupper er klart en fordel for dette systemet.
Som et proof-of-Concept eksperiment, en hydrofile moiety ble innført i 2 gepatotoksičnost-paBhcmoc-PTX (4) og en mobil målretting ligand ble innført i sammensatte 3 (figur 2). VANNLØSELIGHET på 2 gepatotoksičnost-glc-paBhcmoc-PTX var 650 ganger høyere enn for den overordnede PTX (tabell 1). Selektiv mobilnettet målretting ble oppnådd ved hjelp av en tag-sonde system, og paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) bærer HaloTag ligand ble vellykket rettet mot cellemembranen av kultivert pattedyrceller uttrykker HALOTAG/EGFR Fusion protein ( Figur 4). Foto-mediert modulering av subcellulære lokalisering av en kinase ble også oppnådd ved hjelp av en klikkbar bur sammensatte 5 (figur 5).
Avslutningsvis har vi med hell demonstrert en metode for utarbeidelse av klikkbare plattformer for foto-bur forbindelser av biologisk interessante molekyler som kan endres enkelt med flere egenskaper, for eksempel vannløselighet og en mobil målretting evne. Siden paBhc caging-gruppen kan brukes til å klargjøre alle molekyler med funksjonsgrupper som kunne endres, er anvendelsen av den foreliggende protokollen ikke begrenset til molekylene som beskrives her. Ved hjelp av en modulær plattform, nemlig paBhc caging gruppen, den ønskede bur forbindelser kan lett forberedt, og deres fysiske og kjemiske egenskaper kan være modulert via Klikk modifikasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder “Memory dynamikk,” og JP19H05778 (TF), “MolMovies.”
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
chloroform | Kanto | 07278-71 | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% | FUJIFILM Wako | 032-12511 | |
dichloromethane, dehydrated | Kanto | 11338-05 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) | TCI Chemicals | D0254 | |
4-dimethylaminopyridine | TCI Chemicals | D1450 | |
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- | Kanto | 10380-05 | |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma | D6046-500ML | |
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW | Olympus | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako | 054-07225 | |
Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
hydrochloric acid | FUJIFILM Wako | 087-01076 | |
inverted fluorescent microscope IX-71 | Olympus | ||
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL | Biotage | 120-1906-D | |
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | FUJIFILM Wako | 196-01252 | |
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 | Olympus | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | 11668027 | lipofection reagent |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Dojindo | 345-01804 | MOPS |
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) | TCI Chemicals | C1400 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Thermo Fisher | 11058021 | reduced serum medium contains no phenol red |
1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate | FUJIFILM Wako | W01SRM19-5000 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Nacalai | 31115-05 | |
Sodium Bicarbonate | FUJIFILM Wako | 199-05985 | |
Sulfuric Acid, 96-98% | FUJIFILM Wako | 190-04675 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | ALDRICH | 762342-100MG | |
tri‐Sodium Citrate Dihydrate | Nacalai | 31404-15 | |
Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |