यहाँ प्रस्तुत HJ संकल्प का अध्ययन करने के लिए एकल अणु एफrster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल है. दो रंग बारी उत्तेजना वियोजन स्थिरांकों का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एकल रंग समय चूक smFRET तो वास्तविक समय दरार assays में लागू किया जाता है रहने के समय वितरण HJ संकल्प से पहले प्राप्त करने के लिए.
थोक तरीके अणुओं की टुकड़ी व्यवहार को मापने, जिसमें अंतर्निहित चरणों के व्यक्तिगत प्रतिक्रिया दरों जनसंख्या भर में औसत रहे हैं. एकल अणु एफजेडर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) वास्तविक समय में अलग-अलग अणुओं द्वारा होने वाले संरचना परिवर्तनों की एक रिकॉर्डिंग प्रदान करता है। इसलिए, बंधन और उत्प्रेरक के दौरान एंजाइम या सब्सट्रेट में संरचनात्मक परिवर्तन को मापने में smFRET शक्तिशाली है। यह काम एक चार तरह Holliday जंक्शन (HJ) और अंतर endonuclease I (GEN1), एक साइटोसोलिक समजात पुनर्संयोजन एंजाइम की बातचीत के एकल अणु इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. इसके अलावा प्रस्तुत कर रहे हैं एकल रंग और दो रंग बारी उत्तेजना (ALEX) smFRET प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल वास्तविक समय में GEN1 द्वारा HJ के संकल्प का पालन करने के लिए. GEN1 dimerization की गतिज HJ, जो एचजे के संकल्प में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है और अब तक मायावी बनी हुई है पर निर्धारित कर रहे हैं. यहाँ वर्णित तकनीक व्यापक रूप से कई एंजाइम-डीएनए प्रणालियों के मूल्यवान मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है.
फ्लोरोसेंट का पता लगाने पर आधारित एकल अणु विधियों उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात1प्रदान करते हैं। FRET एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक है कि 1-10 एनएम की सीमा में दूरी को मापने कर सकते हैं, नैनोमीटर रेंज2में दूरी को मापने के लिए एक आणविक शासक के रूप में इस तकनीक प्रतिपादन2 ,3. स्वीकारकर्ता के अवशोषण स्पेक्ट्रम कम तरंगदैर्ध्य अंत में दाता के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ एक आंशिक वर्णक्रमीय ओवरलैप है. FRET एक दाता और स्वीकारकर्ता जोड़ी के बीच विकिरण-कम ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा मध्यस्थता की है, जबकि ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता की दूरी और स्वीकारकर्ता4के अभिविन्यास पर निर्भर है.
पृष्ठभूमि को कम करने और फ्लोरोसेंस सिग्नल5,6 की पता लगाने की दक्षता में सुधार करने के लिए अनेक दृष्टिकोण लागू किए गएहैं. एक दृष्टिकोण confocal माइक्रोस्कोपी है, जिसमें एक pinhole विवर्तन सीमा7से नीचे एक आकार के लिए उत्तेजना स्थान को प्रतिबंधित करता है. एक अन्य दृष्टिकोण कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) है, जो एक विस्तृत क्षेत्र रोशनी तकनीक है जिसमें प्रकाश एक महत्वपूर्ण कोण8के ऊपर बंद अक्ष निर्देशित है. प्रकाश तो पूरी तरह से आंतरिक कांच और जलीय समाधान के बीच इंटरफेस पर परिलक्षित होता है, एक evancent लहर है कि केवल कांच की सतह से जुड़ी फ्लोरोफोर्स illuminates और बाकी के आराम में फ्लोरोफोर से पृष्ठभूमि से बचाता पैदा समाधान.
confocal माइक्रोस्कोपी में, अणुओं या तो स्वतंत्र रूप से diffusing या सतह स्थिर हो सकता है. प्राप् त लौकिक संकल्प माइक्रोसेंड से कई मिसे9तक हो सकता है . एक एकल अणु के लिए confocal पता लगाने एकल-फोटोन हिमस्खलन डायोड (SPAD) और ब्याज10के क्षेत्र के बिंदु द्वारा बिंदु द्वारा बिंदु स्कैनिंग द्वारा किया जाता है। TIRF में, सतह पर स्थिर अणुओं के कुछ सैकड़ों की एक समय श्रृंखला एक स्थिति के प्रति संवेदनशील दो आयामी प्रभारी युग्मित डिटेक्टर (सीसीडी) द्वारा दर्ज की गई है. सीसीडी तेज फॉस्फोर स्क्रीन और माइक्रोचैनल प्लेट या ऑन-चिप गुणन के फोटोइलेक्ट्रोन (ईएमसीसीडी) द्वारा फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ा देता है। लौकिक संकल्प सीसीडी की पठन गति और क्वांटम दक्षता पर निर्भर करता है और आमतौर पर कुछ दसियों मिलीसेकेंड6के क्रम पर होता है ।
एचजे डी एन ए मरम्मत और पुनर्संयोजन11,12,13,14में एक केंद्रीय मध्यवर्ती है . HJ दो सतत और दो पार किस्में है कि एक दूसरे को एक दूसरे को काटना बिना निरंतर किस्में के बीच कनेक्ट है. एचजे समाधान में एक्स-स्टैक्ड अनुरूपक के रूप में मौजूद है, जो लगातार किस्में पार करते हुए और क्रॉसिंग किस्में अन्य कंटेस्टेंटर15में निरंतर होते जा रहे हैं। एचजे की समीपार्थ वरीयता मुख्य अनुक्रम और आयनी पर्यावरण पर निर्भर है और इसका अध्ययन फ्रेट16, 17,18,19द्वारा किया गया है .
GEN120 समाधान21 में एक एकमेव प्रोटीन है और इसके लिए डिमराइजेशन की आवश्यकता होती है ताकि एचजे को छोड़ दिया जा सके, जिससे पुनः संयुक्त किस्में22,23को उचित रूप से अलग कर दी जा सकीं . एचजे की स्टैकिंग कंपोजर वरीयता एचजे रिसोल्स24द्वारा संकल्प के अभिविन्यास की स्थापना करके आनुवंशिक पुनर्संयोजन के परिणाम को प्रभावित करती है . समझ कैसे GEN1 HJ बांधता है, दो चीरों निर्देशांक , और यह सुनिश्चित करता है कि अपने पूर्ण संकल्प सभी गहन अध्ययन के तहत किया गया है21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
इस अध्ययन में, एक उद्देश्य आधारित TIRF सेट अप के रूप में पहले31वर्णित प्रयोग किया जाता है. दो रंग बारी उत्तेजना (ALEX) fluorophor लेबल HJ के साथ GEN1 की बातचीत पर अनुरूप परिवर्तन निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है. ALEX दो अनुपातमितीय पैरामीटर FRET दक्षता ई के आधार पर 2D हिस्टोग्राम का उत्पादन करता है, जो दाता-ग्राही दूरी-निर्भर है, और स्टोइचीमिट्री पैरामीटर एस, जो दाता-ग्राही मिति32को मापता है। ALEX केवल दाता, स्वीकारकर्ता, और मिश्रित subpopulations सहित फ्लोरोफोरी की स्टोइचिओमेटरी के आधार पर फ्लोरोसेंट प्रजातियों की छँटाई सक्षम बनाता है। ALEX पूरी रेंज के लिए FRET के उपयोग का विस्तार कर सकते हैं और फ्लोरोफोर चमक और ओलिगोमराइजेशन के साथ ही मॉनिटर मैक्रो अणु-लिगन्ड बातचीत33में मतभेद का पता लगा सकते हैं।
यह पाया गया है कि GEN1 लगातार GEN1-HJ परिसर के जीवनकाल के भीतर HJ को हल करने में सफल होता है. समय पर निर्भर अनुरूपता परिवर्तन अलग-अलग अणुओं के समय-अंशों से प्राप्त होते हैं, जबकि हिस्टोग्राम अंतर्निहित आबादी के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। समय चूक एकल रंग FRET का उपयोग करना, तेजी से दर पर और GEN1 dimer के लिए धीमी गति से बंद दर का प्रदर्शन कर रहे हैं, जो पहले चीरा उत्पाद में इकट्ठे GEN1 dimer की समानता में वृद्धि.
इस अध्ययन में, GEN130द्वारा एचजे संकल्प की गतिजता निर्धारित करने के लिए विभिन्न smFRET तकनीकों को लागू किया गया था। इसी प्रकार के स्मफ्रेट दृष्टिकोणों का उपयोग डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत फ्लैप एंडोनकलस 142,43,44द्वारा डबल-फ्लैप डीएनए अनुरूपता की आवश्यकता और दरार का पालन करने के लिए किया गया था . यहाँ, इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा कर रहे हैं. silanization प्रतिक्रिया आर्द्रता के किसी भी निशान से मुक्त होना चाहिए. PEG हाइड्रोलिसिस से बचने के लिए भंग हो जाने के बाद पेगिलेशन समाधान को सिलनाइज्ड ग्लास पर तेजी से लागू किया जाना चाहिए। मल्टी चैनल प्रवाह सेल में, पड़ोसी चैनलों के बीच रिसाव से बचने के लिए चिपकने वाली शीट में किसी भी फंस हवा को हटाया जाना चाहिए। पीसीए समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि यह समय के साथ ऑक्सीकरण करता है। 10 N NaOH के अलावा ड्रॉपवार होना चाहिए, बीच में भंवर के साथ. कवरस्लिप में फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को फ्लोरोसेंट लेबल वाले एचजे को बहने से पहले कम से कम होना चाहिए। प्रवाह कोशिका में इमेजिंग इमेजिंग ब्लीचकिए गए क्षेत्रों से बचने के लिए एक दिशा में किया जाना चाहिए। ALEX प्रयोगों में, लाल लेजर की शक्ति स्वीकारकर्ता की तेजी से विरंजन से बचने के लिए कम किया जाना चाहिए. समय चूक प्रयोगों में, चक्र समय सबसे तेजी से घटना से कम हो गया है.
SmFRET एक संवेदनशील तकनीक है कि जैव आणविक प्रतिक्रियाओं में मूल्यवान वास्तविक समय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है. हालांकि, इस विधि में कई तकनीकी चुनौतियां हैं, जिनमें से जैव रासायनिक प्रतिक्रिया के दौरान FRET में औसत दर्जे का परिवर्तन प्राप्त कर रहा है। यह समय-ट्रैज में हिस्टोग्राम और भेद करने योग्य स्थितियों में अच्छी तरह से अलग विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। कई मामलों में, smFRET substrates के सावधान डिजाइन की आवश्यकता है, फ्लोरोफोर जोड़े और उनकी स्थिति के चयन, और सब्सट्रेट45में थोड़ा संरचनात्मक परिवर्तन की वजह से डीएनए सब्सट्रेट में FRET परिवर्तन के प्रवर्धन . FRET प्रदर्शन करने के लिए एक और दृष्टिकोण लेबल प्रोटीन46का उपयोग करने के लिए है. FRET में अवलोकन खिड़की ऐसे Cy5 या Alexa Fluor 647 जो दाता की तुलना में अधिक तेजी से ब्लीच करने के लिए जाता है के रूप में स्वीकारकर्ता की स्थिरता द्वारा सीमित है (इस मामले में Cy3). इसलिए, FRET के लिए स्थिर फ्लोरोफोर के लिए एक सतत खोज की आवश्यकता है प्रयोग की अवधि का विस्तार करने के लिए और फ्लोरोसेंट संकेत लम्बा और संकेत करने के लिए शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए ऑक्सीजन अपमार्जन प्रणाली विकसित करने के प्रयासों47,48 .
SmFRET में समस्या निवारण के लिए सुझावों में इस तरह के लेजर शक्ति, जोखिम समय, चक्र समय, और चक्र की संख्या के रूप में इमेजिंग में शामिल कई पैरामीटर संतुलन है फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को अधिकतम करने के लिए, प्रयोग की अवधि को लम्बा, और प्राप्त एंजाइम गतिशीलता के लिए उपयुक्त नमूना अंतराल. लंबे समय तक अवलोकन समय और photobleaching से कम से कम प्रभाव उच्च निष्ठा एंजाइम गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं कि समय वितरण निवास प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. ALEX बेहतर हिस्टोग्राम उत्पन्न करता है क्योंकि इस विधि को एकल-रंग FRET की तुलना में photobleached कणों से कम योगदान के अधीन है। हालांकि, ALEX में अस्थायी संकल्प एकल रंग FRET में उस से कम है.
अंत में, वास्तविक समय में अलग-अलग अणुओं में संरचना/संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने पर smFRET का जोर उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक तकनीकों (यानी, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) के बीच का अंतर है। जो स्थिर परिस्थितियों और थोक तरीकों कि एक औसत दर्जे का संपत्ति की टुकड़ी औसत उपज के तहत परमाणु संकल्प संरचनात्मक विवरण प्रदान करता है. कई पहलुओं में, smFRET वास्तविक समय में जैविक प्रणालियों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक साबित हो गया है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के मुख्य वित्त पोषण और प्रतियोगी अनुसंधान पुरस्कार (CRG3) के माध्यम से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के शाह अब्दुल्ला विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था एस एम एच.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |