Presentert her er en protokoll for å utføre enkelt-molekyl Förster resonans energi overføring til å studere HJ oppløsning. To fargers vekslende eksitasjon brukes til å bestemme dissosiasjon konstanter. Single-Color tid forfalle smFRET blir deretter brukt i sanntid kløft analyser for å få bo tids fordelingen før HJ oppløsning.
Bulk metoder måle ensemble atferden til molekyler, der enkelte reaksjons rater av de underliggende trinnene er gjennomsnitt i hele befolkningen. Single-molekylet Förster resonans energi overføring (smFRET) gir en innspilling av conformational endringene som skjer ved individuelle molekyler i sanntid. Derfor er smFRET kraftig i å måle strukturelle endringer i enzymet eller substrat under binding og katalyse. Dette arbeidet presenterer en protokoll for single-molekylet Imaging av samspillet av en fire-veis Holliday Junction (HJ) og gap endonuclease jeg (GEN1), en cytosolic homologe rekombinasjon enzym. Også presentert er single-farge og to-farge alternerende eksitasjon (ALEX) smFRET eksperimentelle protokoller for å følge oppløsningen av HJ av GEN1 i sanntid. Den Kinetics av GEN1 dimerization bestemmes på HJ, som har blitt foreslått å spille en nøkkelrolle i oppløsningen av HJ og har vært unnvikende til nå. Teknikkene beskrevet her kan bli mye brukt for å få verdifull mekanistisk innsikt i mange enzym-DNA-systemer.
Enkelt molekyl metoder basert på fluorescens deteksjon gir høy signal-til-støy-forhold1. Bånd er en spektroskopiske teknikk som kan måle avstander i området 1-10 NM, rendering denne teknikken som en molekylær linjal for å måle avstander i nanometer området2,3. Acceptor absorpsjons spektrum har en delvis Spectral overlapping med giverens utslipps spektrum på den kortere bølgelengde enden. BÅND er formidlet av stråling-mindre energi overføring mellom en donor og Acceptor par, mens effektiviteten av energi overføring er avhengig av avstand og orientering av Acceptor4.
Det er iverksatt flere tilnærminger for å minimere bakgrunnen og forbedre deteksjons effektiviteten til fluorescens signal5,6. En tilnærming er konfokalmikroskopi mikroskopi, der en pinhole begrenser eksitasjon stedet til en størrelse under Diffraksjon grensen7. En annen tilnærming er total intern refleksjon fluorescens (TIRF), som er et bredt felt belysning teknikk der lyset er rettet off-aksen over en kritisk vinkel8. Lyset er så helt internt reflektert i grensesnittet mellom glass og vandig løsning, genererer en evanescent bølge som bare lyser opp fluorophores festet til glassflaten og hindrer bakgrunn fra fluorophores i resten av løsningen.
I konfokalmikroskopi mikroskopi kan molekylene enten fritt spre eller flate immobilisert. Den oppnådde timelige resolusjonen kan være innenfor mikrosekunder til flere millisekunder9. Konfokalmikroskopi deteksjon for et enkelt molekyl er utført av single-Foton skred diode (SPAD) og punkt-for-punktskanning av regionen av interesse10. I TIRF, en tid-serie av noen få hundre molekyler immobilisert på overflaten er registrert av en posisjon-følsom to-dimensjonal ladning kombinert detektor (CCD). CCD forsterker fluorescens signalet enten ved intensivert fosfor skjerm og MicroChannel plate eller on-chip multiplikasjon av photoelectrons (EMCCD). Den timelige oppløsningen er avhengig av avlesning hastighet og Quantum effektiviteten av CCD og vanligvis på rekkefølgen av få titalls millisekunder6.
HJ er en sentral mellomliggende i DNA reparasjon og rekombinasjon11,12,13,14. HJ har to kontinuerlige og to krysset tråder som kobler mellom den kontinuerlige tråder uten kryssende hverandre. HJ eksisterer i løsningen som X-stablet conformers, som gjennomgår kontinuerlig isomerization av den kontinuerlige tråder blir krysset og krysset trådene blir kontinuerlig i den andre conformer15. Isomer preferanse for HJ er avhengig av kjernen sekvens og ioniske miljø og har blitt grundig studert av bånd16,17,18,19.
GEN120 er en monomere protein i løsning21 og krever DIMERIZATION å Cleave den HJ, og dermed gir riktig separasjon av saman tråder22,23. Den stabling conformer preferanse for HJ påvirker utfallet av genetisk rekombinasjon ved å sette retningen av oppløsningen ved HJ resolvases24. Forstå hvordan GEN1 binder HJ, koordinerer de to snittene, og sikrer sin fulle oppløsning har alle vært under intensiv studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
I denne studien brukes en objektiv basert TIRF-oppsett som beskrevet tidligere31. To-farge alternerende eksitasjon (ALEX) er brukt for å bestemme conformational endringer på samspillet av GEN1 med fluoroforen merket HJ. ALEX produserer 2D histogrammer basert på to ratiometrisk parametre bånd effektivitet E, som er donor-Acceptor avstand avhengig, og støkiometri parameteren S, som måler donor-Acceptor støkiometri32. ALEX gjør det mulig å sortere fluorescerende arter basert på stoichiometries til fluorophores, inkludert bare giver, Acceptor og blandede subpopulasjoner. ALEX kan forlenge bruken av bånd til hele spekteret og kan oppdage forskjeller i fluoroforen lysstyrke og oligomerisering samt overvåke Makromolekyl-ligand interaksjoner33.
Det er funnet at GEN1 konsekvent lykkes i å løse HJ i løpet av levetiden til GEN1-HJ kompleks. De tidsavhengige conformational endringene er avledet fra tids sporene til enkelte molekyler, mens histogrammer representerer fordelingen av de underliggende populasjoner. Bruke time-lapse single-Color bånd, rask på priser og langsom off-priser for GEN1 dimer er demonstrert, noe som øker affinitet av de monterte GEN1 dimer ved første snitt produktet.
I denne studien, ulike smFRET teknikker ble iverksatt for å bestemme Kinetics av HJ oppløsning av GEN130. Lignende smFRET tilnærminger ble brukt til å følge dobbel klaff DNA conformational krav og kløft av DNA replikering og reparasjon klaff endonuclease 142,43,44. Her diskuteres kritiske trinn i denne protokollen. Den silanisering reaksjonen skal være fri for spor av fuktighet. Den pegylation løsningen skal påføres raskt på det silanized glasset når PEG oppløses for å unngå hydrolyse. I flerkanals strømningscelle bør eventuell fanget luft i selvklebende ark fjernes for å unngå lekkasje mellom nabo kanaler. PCA-løsningen bør tilberedes på en nylaget siden den oksiderer over tid. Tillegg av 10 N NaOH bør være dråpevis, med virvlingen i mellom. Den fluorescens bakgrunnen i dekkglass bør være minimal før du strømmer fluorescensmerkete merket HJ. Bildebehandling i strømningscellen skal utføres i én retning for å unngå bilde av bleket områder. I ALEX eksperimenter, bør kraften i den røde laseren reduseres for å unngå rask bleking av Acceptor. I eksperimenter med tidsforløp må syklustiden være kortere enn den raskeste hendelsen.
smFRET er en følsom teknikk som kan gi verdifull sanntidsinnsikt i Biomolecular reaksjoner. Imidlertid har denne metoden flere tekniske utfordringer, blant annet er å oppnå målbar endring i bånd under biokjemiske reaksjon. Dette er nødvendig for å oppnå godt separerte funksjoner i histogrammer og skille stater i tid-spor. I mange tilfeller krever smFRET nøye utforming av underlag, valg av fluoroforen parene og deres posisjoner, og forsterkning av bånd endringer i DNA underlaget på grunn av den lille strukturelle endringer i underlaget45. En annen tilnærming for å utføre bånd er å bruke merket proteiner46. Observasjons vinduet i bånd er begrenset av stabiliteten i Acceptor som Cy5 eller Alexa fluor 647 som har en tendens til å bleke mer raskere enn donor (Cy3 i dette tilfellet). Derfor krever bånd et kontinuerlig Søk etter stabile fluorophores for å forlenge eksperimentet varighet og arbeidet med å utvikle oksygen rensing systemer for å forlenge fluorescens signalet og maksimere signal-til-støy-forhold47,48 .
Blant tipsene for feilsøking i smFRET er å balansere flere parametre involvert i avbildning som laser strøm, eksponeringstid, syklustid, og antall sykluser for å maksimere fluorescens utslipp, forlenge eksperimentet varighet, og oppnå passende sampling intervaller for enzymet dynamikk. Lengre observasjons tider og minimale effekter fra photobleaching er avgjørende for å oppnå høy troskap dvele tids distribusjoner som representerer enzymet dynamikk. ALEX genererer bedre histogrammer siden denne metoden er utsatt for lavere bidrag fra photobleached partikler i forhold til én fargebånd. Men den timelige oppløsningen i ALEX er lavere enn i en enkelt fargebånd.
Til slutt, smFRET ‘ s vekt på å oppdage conformational/strukturelle endringer i individuelle molekyler i sanntid broer gapet mellom høy oppløsning strukturelle teknikker (dvs., X-ray crystallography, kjernefysisk magnetisk resonans, elektron mikroskopi), som gir Atomic oppløsning strukturelle detaljer under statiske forhold og bulk metoder som gir ensemblet gjennomsnittet av en målbar eiendom. I mange aspekter, smFRET har vist seg å være en kraftig teknikk for å studere biologiske systemer i sanntid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av kong Abdullah University of Science and Technology gjennom kjernen finansiering og konkurrerende Research Award (CRG3) til S. M. H.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |