En alsidig cryoslicing bn-MS protokol ved hjælp af en mikrotomen er præsenteret for høj opløsning complexome profilering.
Proteiner udøver generelt biologiske funktioner gennem interaktioner med andre proteiner, enten i dynamiske protein samlinger eller som en del af stabilt dannede komplekser. Sidstnævnte kan elegant løses efter molekyl størrelse ved hjælp af Native polyacrylamid gel elektroforese (BN-side). Koblingen af sådanne separationer til følsom massespektrometri (BN-MS) er veletableret og giver teoretisk mulighed for en udtømmende vurdering af det ekstruderbare complexome i biologiske prøver. Men denne fremgangsmåde er temmelig omstændelig og giver begrænset kompleks størrelse opløsning og følsomhed. Også, dens anvendelse er forblevet begrænset til rigelige mitokondrie og plastid proteiner. Derfor mangler der stadig oplysninger om integration i stabile protein komplekser for et flertal af proteiner. Præsenteret her er en optimeret tilgang til complexome profilering omfattende præparativ-skala BN-side separation, sub-millimeter prøveudtagning af brede gel baner ved cryomicrotome udskæring, og massespektrometrisk analyse med etiket-fri protein kvantificering. Procedurerne og værktøjerne til kritiske trin er beskrevet i detaljer. Som en applikation beskriver rapporten complexome analyse af en solubiliseret endosome-beriget membran fraktion fra mus nyrer, med 2.545 proteiner profileret i alt. Resultaterne viser identifikation af ensartede, lavtliggende membran proteiner såsom intracellulære Ionkanaler samt høj opløsning, komplekse protein samlings mønstre, herunder glykosylering isoformer. Resultaterne er i enighed med uafhængige biokemiske analyser. Sammenfattende giver denne metode mulighed for omfattende og upartisk identifikation af protein (Super) komplekser og deres underenhed sammensætning, der giver et grundlag for at undersøge støkiometri, samling, og interaktion dynamik af protein komplekser i enhver biologisk system.
BN-PAGE separation blev først direkte koblet til LC-MS Analysis (BN-MS) af Majeran1 og Wessels2 forskergrupper ved hjælp af manuel UDSKÆRING af bn-Page gel Lanes. Deres analyser identificerede en række rigelige membran protein komplekser med kendte underenhed sammensætning fra plante blødninger og hek celle mitokondrier hhv. Disse analyser var imidlertid langtfra omfattende og gav ikke mulighed for objektiv identifikation af nye forsamlinger. Resultaterne af massespektrometre og mærknings frie kvantificeringsmetoder er blevet væsentligt forbedret siden da, hvilket har muliggjort omfattende mia-MS-analyser. Dette har opfundet udtrykket “complexome profilering”. For eksempel, Heide og kollegaer analyseret rotte hjerte mitokondrier identificere og klyngedannelse 464 mitokondrie proteiner, hvilket bekræfter mange kendte forsamlinger. Desuden fandt de TMEM126B at være en roman og afgørende underenhed af en bestemt samling kompleks3. Sammenlignelige resultater (med 437 mitokondrie protein profiler) blev opnået i en parallel undersøgelse af hek celle mitokondrier4.
På trods af disse forbedringer er der stadig flere spørgsmål, som begrænser det fulde potentiale af BN-MS til complexome profilering. En væsentlig begrænsning er den effektive størrelses opløsning af komplekser, der er bestemt af to faktorer: (i) kvaliteten af BN-side separationen, som afhænger af ensartetheden af gel-matrix pore gradient såvel som stabiliteten/opløseligheden af prøve komplekser, og (II) trin størrelse af gel prøvetagning, som er i bedste 1 mm ved brug af konventionel manuel udskæring5,6. Dårlig størrelse opløsning ikke kun savner subtile komplekse isoformer og heterogeneities, men det også negativt påvirker det dynamiske område og tillid af objektive, de Novo underenhed tildeling og kvantificering.
Andre udfordringer omfatter præcisionen af protein kvantificering og dækning af det faktiske dynamiske område af protein mængder i prøven ved massespektrometrisk analyse. Derfor har anvendelsen af bn-MS complexome profilering stort set været begrænset til biologiske prøver med lavere kompleksitet, høj ekspression af målkomplekser og gunstige solubilisering egenskaber (dvs. blødninger, mitokondrier og mikroorganismer)6,7,8,9,10.
Vi har for nylig introduceret cryomicrotome Slicing-Assisted BN-MS (csBN-MS), som kombinerer præcis submillimeter prøvetagning af BN-side gel baner med omfattende MS-analyse og udførlige MS data processing til bestemmelse af protein profiler med høj tillid11. Ansøgning til en mitokondriel membran forberedelse fra rotte hjerner demonstreret tidligere uopfyldte effektiv kompleks størrelse opløsning og maksimal dækning af oxidativ respiratorisk kæde kompleks (OXPHOS) under enheder (dvs., 90 af 90 MS-tilgængelig). Dette eksempel identificerede også en række nye protein samlinger.
Beskrevet her er optimerede procedurer for præparativ skala BN-side adskillelse af protein komplekser (ikke begrænset til en bestemt biologisk kilde), støbning af store præparative BN-side gels, cryomicrotome udskæring af brede gel baner, og MS data Behandling. Ydeevnen af høj opløsning profilering er demonstreret for en protein kompleks forberedelse fra mus nyre endosome-beriget membraner. Endelig diskuteres fordelene ved øget opløsning og præcision af massespektrometrisk kvantificering.
Den præsenterede undersøgelse byggede på csBN-MS-teknikken, der tidligere var benchmærket med en mitokondriel forberedelse11 og indarbejdet forbedringer i prøveforberedelse, gel behandling og MS dataevaluering. Fokuseret analyse af en del af den store separation BN-PAGE gel leverede et omfattende sæt data, der viste kvalitetsforanstaltninger svarende til studiet med mitokondrie membraner. Masse-og retentionstiden fejl samt køre-til-Run variationer blev holdt meget lav og gav grundlag for fastsættelsen af pålidelige protein overflod profiler. Størrelses opløsningen syntes at være god, med halv maksimale spids bredder så lavt som seks skiver (svarende til 1,5 mm, figur 4) og relative størrelsesforskelle på mindre end 10% forsvandt (figur 3, figur 5A). Disse værdier opfyldte ikke fuldt ud størrelses opløsnings kvaliteten af den tidligere csBN-MS-analyse af mitokondrier (på trods af den valgte mindre gel prøveudtagnings trin), men de er væsentligt bedre end ydeevnen af konventionelle BN-MS-eller size-eksklusions-MS nærmer sig20 , der for nylig er blevet populære.
Betydningen af en høj effektiv kompleks størrelses opløsning understreges af simulerings eksperimentet i figur 3 (ved hjælp af TPC1-associerede komplekser), som næppe kan løses med 2D bn/SDS-Page Western blot-analyse (figur 1B). Disse resultater tyder på, at 0,25 mm udskæring i dette tilfælde resulterede i nogle oversampling, men det dette stadig viste sig at være nyttigt for eliminering af “kvantificering støj” uden at kompromittere effektiv størrelse opløsning. Således, i overensstemmelse med tidligere resultater11, en prøveudtagnings trin størrelse på ~ 0,3 mm er generelt anbefalelig.
Navnlig er diskrimination af TPC1-associerede komplekser helt tabt med 1 mm gel prøvetagning, som er den mindste trin størrelse, der leveres af manuel udskæring i konventionelle bn-MS5,6. Dette kan forklare det faktum, at trods kraftfulde MS-teknologier er tilgængelige, meget få protein komplekser og under enheder er blevet identificeret de Novo ved complexome profilering. Ud over den gode løsnings effekt tilbyder csBN-MS høj alsidighed. Membranbundne komplekser og opløselige protein komplekser, der spænder fra 50 kDa til flere MDa, kan løses effektivt i et enkelt eksperiment med minimum bias11. Dette står i kontrast til alternative separationsteknikker, der anvendes til complexome profilering som størrelses udelukkelse eller ionbytningskromatografi, som opererer med undergrupper af opløselige proteiner med visse størrelsesintervaller eller opladnings egenskaber. På bagsiden er csBN-MS mindre skalerbar (maksimal belastning på ~ 3 mg protein pr. gel), kan være teknisk udfordrende og kan ikke automatiseres.
Samlet set viser resultaterne, at csBN-MS-baseret complexome-profilering kan anvendes med succes på ikke-mitokondrielle mål, men også indikerer nogle tilknyttede udfordringer. Således, effektiv udvinding og biokemiske stabilitet af protein komplekser kræver mere optimering, og rengøring trin og kan stadig være begrænset. Inden for den undersøgte størrelse vindue, antallet af velfokuserede, monodispers protein komplekser var faktisk betydeligt lavere (data ikke vist) sammenlignet med en mitokondrie prøve. Det anbefales også at sænke BN-side prøve belastninger for at opnå acceptabel gel separation. Højere belastninger kan kræve bredere gelbaner, der er vanskeligere at bearbejde korrekt til udskæring (Se medfølgende video). Desuden var protein kompleksiteten af prøverne højere (omkring to gange) end de mitokondria-afledte skive fordøjer, hvilket førte til mere manglende PV værdier og et reduceret dynamikområde. Faktisk manglede nogle små proteiner, der forventes at være en del af de komplekser, der er vist i figur 5 , i analyserne. Disse problemer kan løses i fremtiden ved hjælp af hurtigere og mere følsomme MS-instrumenter eller data-uafhængige erhvervelse modes.
Prøveforberedelse er meget kritisk for protein kompleks hentning, stabilitet og gel separations kvalitet. Parametre og procedurer bør optimeres for hvert kilde væv, celle lysat, membran (fraktion), og protein kompleks af interesse. Der gives følgende generelle anbefalinger, som kan medvirke til at forlænge ansøgninger fra csBN-MS:
i) at forberede prøverne frisk og undgå opvarmning/frysning, kraftige fortyndinger, ændringer i buffer forhold og unødvendige forsinkelser
II) anvendelse af buffere, der i det væsentlige er blottet for salte (Udskift med 500-750 mM betain eller aminocapolsyre), om en neutral pH-værdi, og som indeholder op til 1% (w/v) ikke-denatureringsmiddel (protein: forholdet mellem 1:4-1:10 og opløsningsmiddel for opløsning af membran protein komplekser, ingen vaskemiddel kræves til opløselige protein komplekser);
III) omhyggelig afprøvning og justering af vaskemiddel forholdene ved analytisk BN-side, da disse kan have en stærkt indvirkning på effektiviteten af kompleks opløselibilisering, repræsentation af membran protein komplekser i prøven, stabilitet og homogenitet af miceller af protein-vaskemiddel. Sidstnævnte er forudsætninger for proteiner til at fokusere som særskilte bands/komplekse populationer på BN-PAGE gels. Tidligere litteratur tilbyder en bred vifte af neutrale rengøringsmidler. Dog er DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6 og digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 har været de mest populære valg for bn-MS analyser indtil videre. Det skal understreges, at enhver form for vaskemiddel tilstand nødvendigvis udgør et kompromis mellem opløselibiliserings effektivitet og bevarelse af protein interaktioner og måske ikke er lige velegnet til alle typer målprotein og udgangsmateriale;
IV) fjernelse af ladede polymerer som fibrier, filamenter, polylysin, DNA og rigelige komponenter med lavere molekylvægt (dvs. metabolitter, lipider eller peptider). Dette kan opnås ved ultracentrifugering, gel filtrering, eller dialyse. Dette er især vigtigt for total celle-eller vævs lysates;
v) tilsætning af Coomassie G-250 (endelig koncentration 0,05%-0,1%) og saccharose (for at øge tæthed for lastning, endelig koncentration 10%-20% [w/v]) til prøven lige før lastning, for at klare ved korte ultracentrifugering, indlæse prøven uden perturbation, og starte kørslen umiddelbart derefter.
Som et fremtidigt perspektiv tilbyder csBN-MS-baseret complexome-profilering muligheder for multiplexing for at studere protein kompleks dynamik eller ændringer i forbindelse med specifikke biologiske forhold. Kombineret adskillelse af metabolisk mærkede prøver som foreslået for størrelses udelukkelse baseret profilering21 forekommer ligetil, men det kan blive hæmmet af spontan udveksling af under enheder i komplekser, der opstår uafhængigt af den anvendte adskillelse Metode. Alternativt kan mærkede prøver løses i tilstødende gel baner, som derefter kan skæres sammen eller kombineres efter fordøje for differentiel analyse med høj følsomhed og robusthed.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, den tyske forskningsfond) – projekt-ID 403222702 – SFB 1381 og under Tysklands Excellence Strategy CIBSS-EXC-2189-Project ID 390939984. Vi takker Katja zappe for teknisk assistance.
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |