Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Påvisning af cellefri DNA i blodplasmaprøver af kræftpatienter

doi: 10.3791/61449 Published: September 9, 2020

Summary

I dette papir præsenterer vi en detaljeret protokol for ikke-invasiv flydende biopsi teknik, herunder blodopsamling, plasma og buffy pels adskillelse, cfDNA og kimbar DNA ekstraktion, kvantificering af cfDNA eller kim kim DNA, og cfDNA fragment berigelse analyse.

Abstract

Identifikation mutationer i tumorer af kræftpatienter er et meget vigtigt skridt i sygdomshåndtering. Disse mutationer tjene som biomarkører for tumor diagnose samt for behandling udvælgelse og dens reaktion hos kræftpatienter. Den nuværende guld standard metode til påvisning af tumor mutationer indebærer en genetisk test af tumor DNA ved hjælp af tumor biopsier. Denne invasive metode er imidlertid vanskelig at udføre gentagne gange som en opfølgningstest af tumormutationsrepertoiret. Flydende biopsi er en ny og spirende teknik til påvisning af tumormutationer som en brugervenlig og ikke-invasiv biopsi tilgang.

Kræftceller formere sig hurtigt. Sideløbende gennemgår mange kræftceller apoptose. Snavs fra disse celler frigives i en patients kredsløbssystem sammen med fint fragmenterede DNA-stykker, kaldet cellefri DNA (cfDNA) fragmenter, som bærer tumor-DNA-mutationer. Derfor indsamles der blodprøver fra kræftpatienterne til identifikation af cfDNA-baserede biomarkører ved hjælp af flydende biopsiteknik efterfulgt af adskillelse af plasma og buffy coat. Dernæst behandles plasma til isolering af cfDNA, og den respektive buffy frakke behandles til isolering af en patients genomiske DNA. Begge nukleinsyreprøver kontrolleres derefter for deres mængde og kvalitet; og analyseres for mutationer ved hjælp af næste generations sekventeringsteknikker (NGS).

I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol for flydende biopsi, herunder blodsamling, plasma og buffy coat separation, cfDNA og kim-DNA-ekstraktion, kvantificering af cfDNA eller kim-DNA og cfDNA fragmentberigelsesanalyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Teknologiske fremskridt har ført til sekventering af hundredvis af kræftgenomer og transskriptioner1. Dette har bidraget til at forstå landskaber af molekylære ændringer på tværs af forskellige kræfttyper2. Yderligere undersøgelser af disse landskaber har hjulpet med at karakterisere de sekventielle somatiske ændringer og gengenfusioner3, der er involveret i kræft eller tumorprogression, ved serielt at forstyrre apoptoseveje4. Derfor kan somatiske mutationer og gen-genfusioner give oplysninger om tumorer ved at tjene som biomarkører hos individuelle patienter for en bestemt tumortype5, identificere eksisterende primære tumorer prognose6, kategorisere sekundære tumorer baseret på molekylære ændringer7og identificere druggable tumormål8. Sådanne oplysninger kan gøre det lettere at vælge personlig behandling af kræftpatienter og ved bestemmelse af positive og negative behandlingsresponser9. Men at opnå tumormateriale til identifikation af genomisk profilering af tumorvæv er en invasiv procedure10. Desuden, en tumor biopsi omfatter kun en lille del af en heterogen tumor; og kan derfor ikke være repræsentativ for den molekylære profil af heletumoren 11. Seriel overvågning og tumor genotyping kræver en gentagen samling af tumorvæv, hvilket normalt ikke er muligt på grund af invasiviteten af tumorbiopsiproceduren og de sikkerhedsproblemer, der opstår ved sådanne procedurer12.

Den flydende biopsi teknik, på den anden side, har fået enorm opmærksomhed i præcision onkologi i løbet af det sidste årti13,14. Det skyldes hovedsageligt denne tekniks ikke-invasivitet og muligheden for, at den gentages på flere tidspunkter, hvilket muliggør en brugervenlig og sikker overvågningsteknik til sygdomskurserne15,16. Flydende biopsi er baseret på et fænomen, som tumorceller formere sig hurtigt, og samtidig mange af dem gennemgår apoptose og nekrose. Dette fører til frigivelse af apptotisk cellerester i patienternes blod sammen med de DNA-fragmenter, der skæres i præcise størrelser under apoptose17. Apoptose af ikke-kræftceller fører også til frigivelse af dets cellulære snavs i blodet, men apoptosehastigheden i disse celler er relativt meget lavere end tumorceller18. Rationalet i den flydende biopsiteknik er at fange tumorrelaterede molekyler som DNA, RNA, proteiner og tumorceller14,19, der cirkulerer kontinuerligt i blodet. Forskellige teknikker20 kan bruges til analyse af disse molekyler, herunder next-generation sekventering (NGS), digital dråbe polymerase kædereaktion (ddPCR), real-time PCR, og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). Flydende biopsi teknik gør det muligt at identificere biomarkører, der er kendetegnende for tumorceller. Disse biomarkørmolekyler frigives ikke kun fra specifikke dele af en tumor, men snarere fra alle dele af tumoren21. Derfor repræsenterer markører identificeret i flydende biopsi den molekylære profilering af en hel heterogen tumor, ud over andre tumorer i kroppen, og har således fordele i forhold til vævsbiopsibaseret teknik22.

CFDNA har en kort halveringstid i det cirkulerende blod fra et par minutter til 1-2 timer23. Den korte halveringstid for cfDNA letter imidlertid realtidsanalyser ved at evaluere behandlingsrespons og dynamiske tumorvurderinger. Den tumor-afledte cfDNA niveauer indikerer prognostication af tumor fase / størrelse fremgår af flere undersøgelser, som viste en sammenhæng mellem cfDNA niveauer og overlevelse resultater24. Desuden har undersøgelser vist, at cfDNA har en bedre forudsigelseskapacitet end eksisterende tumormarkører25. Prognosen for cfDNA er endnu mere udtalt efter kræftbehandling, højere niveauer af cfDNA efter behandling korrelerer godt med en reduceret overlevelsesrate og modstand mod behandling. Mens lavere niveauer af cfDNA efter behandling generelt svarer til positiv behandlingsrespons. Derudover letter cfDNA tidlig påvisning af behandlingsrespons end de traditionelle detektionsmetoder.

CFDNA øger muligheden for tidlig påvisning af kræftrelaterede mutationer: i den tidlige fase sygdom15, symptomernes begyndelse26 og før kræftdiagnose op til 2 år27. Da cfDNA frigives fra flere tumorregioner eller foci, giver dens analyse et omfattende overblik over tumorgenomet, det repræsenterer28. Derfor gør cfDNA det muligt at opdage somatiske mutationer, der kan være gået glip af i vævsprøverne29. Som intra-tumor heterogenitet og subklonale mutationer kan påvises ved dyb sekventering af genomiske regioner spænder over tusindvis af baser, derfor analysen af cfDNA gør det muligt at afdække specifikke molekylære undertyper med forskellige genomiske signaturer13. For at opnå et tilsvarende niveau af information gennem vævsprøve mange faste biopsier ville have været nødvendig.

Desuden cfDNA niveauer hos patienter med en lokaliseret sygdom som tyktarm, æggestokkene, og lungekræft efter en kirurgisk behandling og / eller kemoterapi, viste sig at være en kraftig prognostisk markør for kræft tilbagefald og behandlingsresultater20. Desuden, hos patienter med tyktarms-, bryst- og lungekræft, kunne analyser af cfDNA fra blodet med succes opdage de tumorspecifikke ændringer, hvilket førte til den præcise forudsigelse af gentagelse flere måneder i forvejen13. Endvidere behandlingsresistensmarkørerne, såsom KRAS-mutationer hos patienter med CRC, der modtager anti-EGFR-behandling30; VAF for gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos patienter med brystkræft efter behandling med forskellige behandlingsformer31; og EGFR T790M resistensmutation hos lungekræftpatienter behandlet med EGFR-målrettede TKIs32 kan også identificeres ved cfDNA-analyse.

Kort sagt kan cfDNA-analysen bruges til at identificere præcise biomarkører inden for onkologi13,33. I denne protokol blev blodprøver af 3 gliompatienter og 3 sunde kontroller behandlet for at opnå genomisk DNA fra WBCs og cfDNA fra plasmaet. I glioma cancer fungerer mutationer i IDH, TERT, ATRX, EGFR og TP53 som en diagnostisk såvel som prognostiske markører, der kan hjælpe med tidlig diagnose af glioma tumorer, klassificere forskellige typer glioma tumorer, vejlede den nøjagtige behandling for den enkelte patient og forstå behandlingsresponset34,35. Mutationsstatus for disse gener kan identificeres ved hjælp af blod-afledt cfDNA. I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol over plasma-afledt cfDNA, der er blevet brugt til at studere mutationsændringer i glioma cancer12. En sådan cfDNA-baseret flydende biopsiprotokol forklaret i denne artikel kan bruges til at studere mutationsændringer i mange andre typer kræft. Desuden har en nylig undersøgelse vist, at cfDNA-baseret flydende biopsi kan detektere 50 forskellige typer kræft36.

Blodprøveindsamling, opbevaring og forsendelse er afgørende trin i denne protokol, da ukontrolleret temperatur under disse trin forårsager lysis af WBC'er, hvilket fører til frigivelse af genomisk DNA fra WBC i plasmaet og forårsager forurening af cfDNA-prøven, hvilket påvirker resten af proceduren37. Hæmolyse på grund af ukontrolleret temperatur kan forringe downstream prøveforberedelsesprocesserne for cfDNA, såsom PCR-trin38. Serumet indeholder en høj andel af kim-cfDNA snarere end plasma, selv om det præsenterer en stor baggrundsstøj for tumor-associeret cfDNA39. Derfor er plasma til isolering af tumorrelateret cfDNA en egnet prøve39. Blod, der trækkes i et antikoagulerende middel, der indeholder blodopsamlingsrør, skal centrifuges straks eller inden for op til to timer for at adskille plasmaet og undgå cfDNA-kontaminering. I denne protokol anvendes dedikerede kommercielle cfDNA-konserveringsblodopsamlingsrør (se Materialetabel), som er et alternativ til antikoagulerende, der indeholder blodopsamlingsrør. Disse dedikerede blodopsamlingsrør bevarer cfDNA og cfRNA og forhindrer lysis af WBCs i op til 30 dage ved omgivelsestemperatur og op til 8 dage ved 37 °C. Dette gør det lettere at opretholde en passende temperatur under en blodprøveforsendelse, og indtil plasmaet og WBC adskilles40.

Der findes i øjeblikket tre typer cfDNA-ekstraktionsmetoder: faseisolation, siliciummembranbaseret spinkolonne og magnetisk perlebaseret isolation41. Den siliciummembranbaserede spin-kolonnemetode gav en stor mængde cfDNA med høj integritet sammenlignet med andre cfDNA-ekstraktionsmetoder42.

Den kvantitative evaluering af DNA er et grundlæggende krav i flydende biopsi, der er behov for at udvikle en enkel, overkommelig og standardiseret procedure for deres nemme implementering og brede brug. Tre almindeligt anvendte metoder til cfDNA-kvantificering er spektrofotometrisk, fluormetrisk og qPCR. Den fluormetriske metode er bevist bedre i forhold til de andre metoder vedrørende nøjagtighed, omkostninger og letledning43.

CFDNA's integritet og renhed kan estimeres ved enten agaroseelektroforese eller kapillærelektroforese. Agarose elektrophoresis hverken viser følsomhed ved lav koncentration af cfDNA eller har høj opløsning til at vise præcis fragmentstørrelse af cfDNA. På den anden side har kapillær elektroforese en fordel i forhold til agaroseelektroforesen ved at overvinde de tilknyttede udfordringer og derfor i vid udstrækning anvendes af forskerne til cfDNA fragmentstørrelsesanalyse. I denne protokol blev fragmentstørrelsesfordelingen af isolerede cfDNA anslået ved hjælp af et automatiseret kapillærelektroforeseinstrument (se materialetabel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forud for blodindsamling kræves informeret samtykke fra forsøgspersoner, der deltager i forskningen, og skal indhentes. Den forskning, der er beskrevet i dette manuskript, blev udført i overensstemmelse med og i overensstemmelse med Rabin Medical Center, Israels etikudvalg (etikkode: 0039-17-RMC) og Det Medicinske Fakultet Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tysklands etikudvalg (etikkode: D 405/14).

1. Opsamling og opbevaring af blodprøver i cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrør

  1. Korrekt mærkning af konserveringsrørene
  2. Saml ~ 8 mL blod i cf-DNA konserveringsrøret (se Materialetabel), ved hjælp af en blodopsamling sæt og en holder, som pr standard institutionelle protokol for venipuncture som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Brugen af et blodopsamlingssæt kan forhindre mulig tilbagestrømning af blodet fra røret.
    1. Juster patienten med armen i en nedadgående position.
    2. Hold røret oprejst med hætten opad, samtidig med at det sikres, at rørets indhold ikke rører hætten eller nålespidsen.
    3. Når blodet begynder at strømme ind i røret, skal du slippe årepressen langsomt.
  3. Umiddelbart efter at røret er fyldt med blod (maksimal kapacitet: 8,4 mL fuldblod), skal røret forsigtigt vendes (vend håndleddet på armen, der holder røret med 180° nedad og tilbage) 5 gange for at stabilisere prøven.
    BEMÆRK: Inversion sikrer, at konserveringsmidlet blandes ensartet med prøven. Men ryst ikke indholdet igen, selv før plasmapræparatet. Utilstrækkelig blanding af konserveringsmidler med blodprøven fører til destabilisering af indholdet og dannelse af mikropropper eller hæmolyse. På dette stadium kan protokollen straks fortsættes, for plasmaadskillelse eller blodfyldte rør kan vente i op til 30 dage ved omgivelsestemperatur (15-25 °C) og op til 8 dage ved 37 °C.

2. Plasma og buffy frakke adskillelse og opbevaring

  1. Centrifuge det blodfyldte konserveringsrør ved 425 x g i 20 minutter ved stuetemperatur for at adskille plasma.
    BEMÆRK: Trin 2.2 og 2.3 skal udføres i et biosikkerhedsskab.
  2. Pipetter forsigtigt det øverste plasmalag ud til et frisk rør i 1 mL aliquots uden at forstyrre de nederste lag.
  3. Overfør forsigtigt det næste lag buffy frakke til et frisk rør (laget vises som en ring over RBC pellets), samtidig med at RBCs undgås i det nederste lag.
  4. Fortsæt til trin 3 med plasma og trin 4 med buffy frakken. Opbevar om nødvendigt det adskilte indhold ved -80 °C.

3. Rensning af cirkulerende cfDNA fra 1 mL plasma

BEMÆRK: Dette trin udføres med et kommercielt sæt (se Materialeoversigt). Alle buffere leveres sammen med pakken.

  1. Fremstilling af buffere og reagenser
    ADVARSEL: Tilsættes ikke sure opløsninger eller blegemiddel direkte til prøveforberedelsesaffaldet. Guanidinsalte til stede i Lysis buffer, Binding buffer, og Wash Buffer-1, når det kombineres med blegemiddel eller syrer kan producere meget reaktive forbindelser.
    1. Bindingsbuffer: Bland 300 mL bindingsbufferkoncentrat med 200 mL 100% isopropanol for at lave 500 mL arbejdsbindingsbuffer. Opbevares ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Bindingsbufferen giver mulighed for optimal binding af de cirkulerende nukleinsyrer til silicamembranen. 500 mL af bindingsbufferen er tilstrækkelig til behandling af henholdsvis 276, 138, 92, 69 eller 55 prøver af henholdsvis 1, 2, 3, 4 eller 5 mL plasma og er stabilt i 1 år ved stuetemperatur.
    2. Vask Buffer-1: Bland 19 mL Vask Buffer-1 koncentrat med 25 mL 96-100% ethanol til at gøre 44 mL arbejde Wash Buffer-1. Opbevares ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Vask Buffer-1 eliminerer de forurenende stoffer, der er bundet til silicamembranen. 44 mL arbejdende vaskebuffer-1 er tilstrækkelig til behandling af 73 prøver af 1/2/3/4/5 mL plasma og er stabil i 1 år ved stuetemperatur.
    3. Vask Buffer-2: Bland godt 13 mL Vask Buffer-2 koncentrat med 30 mL 96-100% ethanol til at gøre 43 mL arbejde Wash Buffer-2. Opbevares ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Vask Buffer-2 eliminerer de forurenende stoffer, der er bundet til silicamembranen. 43 mL bearbejdning Wash Buffer-2 er tilstrækkelig til behandling ~56 prøver af 1/2/3/4/5 mL plasma og er stabil i 1 år ved stuetemperatur.
    4. Til et rør, der indeholder 310 μg lyofiliseret bærende RNA, tilsættes 1.550 μL Elution-buffer for at forberede en bærende RNA-opløsning på 0,2 μg/μL. Efter en grundig opløsning af bære-RNA'et skal opløsningen opdeles på passende aliquots og opbevares ved –30 °C til –15 °C. Må ikke fryse-optø disse aliquots mere end 3 gange. Føj det rekonstituerede bærende RNA, der er opløst i Elution-bufferen, til Lysis-bufferen som vist i tabel S1.
      BEMÆRK: Da bærende RNA ikke opløses direkte i Lysis-bufferen, skal det først opløses i en Elution-buffer og derefter i Lysis Buffer. For det første forstærkes bindingen af silicamembran-nukleinsyrer, når der er meget få målmolekyler til stede i prøven. For det andet reduceres risikoen for RNA-nedbrydning på grund af tilstedeværelsen af store mængder bærende RNA.
  2. Før isoleringen påbegyndes, bringes kolonnerne og prøverne til stuetemperatur, og prøvemængderne justeres til 1 mL med steril fosfatbufferet saltvand (PBS), hvis det er nødvendigt. Forvarm 2 vandbade eller varmeblokke, der indeholder henholdsvis 50 mL centrifugerør og 2 mL opsamlingsrør til henholdsvis 60 °C og 56 °C.
  3. Til et 50 mL centrifugerør tilsættes 100 μL Proteinase K, 1 mL plasma og 0,8 mL Lysis buffer indeholdende 1,0 μg bærende RNA (tilberedt i trin 3.1.4). Luk centrifugerøret med en hætte, og bland indholdet ved pulshvirvel i 30 s, samtidig med at der sikres en synlig hvirvel i røret. Grundig blanding af indholdet er vigtigt for effektiv lysis.
    BEMÆRK: Umiddelbart efter hvirvelvridning skal du straks gå videre til trin 3.4.
  4. Opløsningen inkuberes ved 60 °C i 30 min.
  5. Fjern hætten, tilsæt 1,8 mL af bindingsbufferen til røret, og bland grundigt med pulshvirvel i 15-30 s efter placering af hætten.
  6. Inkubat den resulterende blanding i 5 minutter på is og indsæt silicamembrankolonnen i vakuumapparatet, der er tilsluttet vakuumpumpen. Sæt derefter en 20 mL rørforlænger fast i den åbne kolonne for at forhindre prøvelækage.
  7. Hæld forsigtigt den inkuberede blanding i kolonnens rørforlænger og tænd vakuumpumpen. Efter at alle lysatblandingen løber helt gennem søjlerne, skal du slukke for vakuumpumpen, frigive trykket til 0 mbar og fjerne og kassere rørforlængeren.
    BEMÆRK: For at undgå krydskontaminering skal rørforlængeren kasseres forsigtigt for at forhindre, at den breder sig over tilstødende søjler.
  8. Kolonnen fjernes fra vakuumapparatet, indsættes i opsamlingsrøret og centrifuges ved 11.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at fjerne eventuelt restlysat. Kassér gennemstrømningen.
  9. Der tilsættes 600 μL vaskebuffer-1 i kolonnen, centrifuge ved 11.000 x g i 1 min ved stuetemperatur, og gennemstrømningen kasseres.
  10. Der tilsættes 750 μL vaskebuffer-2 til kolonnen, centrifuge ved 11.000 x g i 1 min ved stuetemperatur, og gennemstrømningen kasseres.
  11. Tilsættes 750 μL ethanol (96-100 %) til kolonnen, centrifuge ved 11.000 x g i 1 min ved stuetemperatur og kassér gennemstrømningen.
  12. Kolonnen centrifuges ved 20.000 x g i 3 min. ved at placere den i et rent 2 mL opsamlingsrør.
  13. Membransøjlesamlingen tørres helt ved at placere den i et nyt 2 mL opsamlingsrør med låget åbent og inkuber ved 56 °C i 10 minutter.
  14. Kolonnen anbringes i et rent 1,5 mL elueringsrør. Til midten af søjlemembranen påføres 20-150 μL Elution-buffer og inkuberes ved stuetemperatur i 3 minutter med låget lukket.
    BEMÆRK: Sørg for, at Elution-bufferen er ekvilibreret til stuetemperatur. I tilfælde af brug af elueringsbuffer mindre end 50 μL skal det sikres, at det dispenseres forsigtigt på membranens centrum. Dette hjælper med den fuldstændige elution af det bundne DNA. Elutionsvolumenet er dog ikke fast og kan ændres i henhold til downstream-applikationerne. Det genvundne eluat kan være op til 5 μL og bestemt mindre end det elueringsvolumen, der påføres kolonnen.
  15. Centrifuger det genvundne eluat i en mikrocentrifuge ved 20.000 x g i 1 min. for at eluere nukleinsyrerne og opbevares ved -20 °C.

4. Rensning af genomisk DNA fra buffy coat

BEMÆRK: Kommerciel kit, der anvendes i denne protokol er nævnt i tabellen over materialer. Buffere og reagenser, der er nævnt i nedenstående protokol, dvs. Lysis buffer A, Lysis buffer B, Wash buffer X, Wash Buffer Y, Proteinase Buffer, Elution buffer og Proteinase K er en del af dette kommercielle sæt.

  1. Udarbejdelse af stødpuder og reagenser
    ADVARSEL: Tilsættes ikke sure opløsninger eller blegemiddel direkte til prøveforberedelsesaffaldet. Guanidinsalte i Lysis buffer B og Wash buffer X, når de kombineres med blegemiddel eller syrer, kan producere meget reaktive forbindelser.
    1. Vask Buffer Y: Bland godt 12 mL Vask Buffer Y koncentrat med 48 mL ethanol (96-100%) for at opnå 60 mL fungerende vaskebuffer Y. Opbevares ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: 60 mL vaskebuffer Y er tilstrækkelig til behandling af 100 buffy frakkeprøver og er stabil i 1 år.
    2. Proteinase K: Forbered Proteinase K-opløsning ved at opløse 30 mg lyofil proteinase K i 1,35 ml Proteinase Buffer.
      BEMÆRK: Den samlede arbejdsopløsning af Proteinase K er tilstrækkelig til behandling af 52 buffy coat prøver. Proteinase K arbejdsopløsning kan opbevares i mindst 6 måneder ved -20 °C.
  2. Trin før indledning af proceduren
    1. Ekvilibrere buffy pels til stuetemperatur.
    2. Sæt varmeblokken eller vandbadet til 56 °C.
  3. Ophæng buffy coat i Lysis buffer A for at opnå et endeligt volumen på 200 μL. Derefter tilsættes 25 μL Proteinase K-opløsning og 200 μL Lysis buffer B. Blandes ved hvirvelstrøm og inkuberes ved 70 °C i 10-15 min. Sørg for, at prøverne er helt dækket af lysisopløsningen.
    BEMÆRK: Til behandling af serier af prøver kan Proteinase K og Lysis buffer A forblandes 10-15 minutter før proceduren, men ikke længere før det, da Proteinase K selv fordøjer i Lysis buffer A uden substrat.
  4. Tilsæt 210 μL 96-100% ethanol til ovennævnte blanding og vortex kraftigt.
    BEMÆRK: Tilsætning af ethanol kan danne et trævlet bundfald; Dette vil dog ikke påvirke DNA-isoleringen. Sørg for at indlæse bundfaldet også på kolonnen som vist i følgende trin.
  5. Hele prøven anbringes på silicasøjlen i et opsamlingsrør. Centrifuge i 1 min ved 11.000 x g. Placer kolonnen i et nyt opsamlingsrør, og kassér det forrige rør sammen med gennemstrømning.
    BEMÆRK: Gentag centrifugeringstrinnet, hvis prøven ikke trækkes helt gennem matrixen.
  6. Der tilsættes 500 μL vaskebuffer X, centrifuge i 1 min ved 11.000 x g, og gennemstrømningen kasseres.
  7. Kolonnen anbringes i opsamlingsrøret, der tilsættes 600 μL vaskebuffer Y på kolonnen, centrifuge i 1 min ved 11.000 x g, og gennemstrømningen kasseres.
  8. Igen skal kolonnen placeres i opsamlingsrøret og centrifuge kolonnen i 1 min ved 20.000 x g for at tørre silicamembranen.
  9. Kolonnen inkuberes ved stuetemperatur i 1 min., anbringes i et mikrocentrifugerør på 1,5 mL og tilsættes derefter 100 μL Elution-buffer. Derefter elute DNA ved centrifugering i 1 min ved 11.000 x g og opbevares ved -20 °C.

5. Kvantificering af CFDNA og genomisk DNA ved hjælp af fluorometer

  1. Før du starter protokollen, skal du udføre følgende trin.
    1. 2 μL elueret genomisk DNA fortyndes (fra trin 4.9) i 1:10 proportioner med ultrapur kernefrit vand. På grund af forventede lave koncentrationer må cfDNA-prøverne ikke fortyndes fra trin 3.15.
    2. Ekvilibrere analysen Standard #1 og assay Standard #2 til stuetemperatur.
  2. Forbered i alt 6 tyndvæggede klare rør på 0,5 mL størrelse.
    BEMÆRK: Den fremlagte protokol er til kvantificering af 2 cfDNA og 2 genomiske DNA-prøver, derfor kræver 4 rør til 4 prøver, og denne analyse kræver 2 standarder.
  3. Mærk rørets låg.
    BEMÆRK: Mærkning på siden af røret kan forstyrre aflæsningen. Derudover er assaystandardrørene mærket omhyggeligt, da kalibrering af fluorometeret kræver, at standarderne er i den rigtige rækkefølge.
  4. Analysereagenset fortyndes i 1:200 med Assay-bufferen for at forberede arbejdsopløsningen. For 4 prøver og 2 standarder skal der anvendes 6 μL assayreagens plus 1.194 μL Assay-buffer til fremstilling af 1.200 μL (200 μL i hvert rør) af arbejdsopløsningen.
    BEMÆRK: Brug ikke en glasbeholder, brug i stedet et rent plastrør. Hvert rør skal indeholde ca. 200 μL af det endelige volumen (et analysestandardglas skal indeholde 190 μL af arbejdsopløsningen, og prøveglasset skal indeholde 180-199 μL af arbejdsopløsningen). Der skal være tilstrækkelig arbejdsopløsning til at rumme alle assaystandarder og -prøver.
  5. I arbejdsanalysestandardrørene tilsættes 190 μL arbejdsopløsning og 10 μL assaystandard og blandes opløsningen ved hvirvelstrømning i 2-3 s. Undgå dannelse af bobler i opløsningen.
  6. I prøverørene tilsættes 198 μL arbejdsopløsning og 2 μL cfDNA eller genomisk DNA. Opløsningen blandes ved hvirvelstrømning i 2-3 s, og den inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
  7. På fluorometerinstrumentetsstartskærmskal du trykke på 'DNA' og vælge 'dsDNA Høj følsomhed Assay', for at vise skærmen 'Standarder', og tryk derefter på 'Ja' på fluorometeret 'Standards' skærmen for at læse standarderne.
  8. Indsæt analysen Standard #1 rør i prøvekammeret, luk låget, og tryk på 'Læs'. Fjern røret, når aflæsningen er afsluttet (ca. 3 s), og gentag det samme trin for Standard #2.
  9. Der vises en prøveskærm, når kalibreringsprocessen er afsluttet, hvorefter der indsættes et prøverør og gentages trin '5.8'. "Prøveskærmen" viser derefter en værdi, der svarer til prøvens koncentration efter fortynding i prøveglasset.
  10. For hvert eksempel gentages trin '5.9', indtil alle prøver læses.
  11. Brug følgende ligning til at beregne stikprøvens faktiske koncentration.
    Equation 1
    BEMÆRK: Analyseværdierne er i ng/mL og svarer til koncentrationen efter fortynding i assayrøret. Ligning nævnt i ovenstående trin 5.11, QF-værdi er den værdi, der er angivet af fluorometerinstrumentet, og x er antallet af mikroliter af prøven, der tilsættes analyserøret. Enhederne for QF-værdier, der genereres af ligningen, svarer til den værdi, der leveres af fluorometeret. Hvis fluorometerets værdi f.eks.

6. DNA-fragmentstørrelsesfordeling af cfDNA efter fragmentanalysator

  1. Trinnet før proceduren påbegyndes: Ekvilibrere DNA-farvestofkoncentratet og DNA-gelmatrixen til stuetemperatur i 30 minutter.
  2. Fremstilling af gel-farvestof mix
    ADVARSEL: Håndter opløsninger med forsigtighed, da DMSO er kendt for at lette indtrængen af organiske molekyler i væv.
    1. Tø DMSO grundigt op ved at hvirvle DNA-farvestofkoncentratglasset i 10 s. 15 μL af dette koncentrat pipetters ud i et DNA-gelmatrixglas og opbevares ved 4 °C i mørke.
    2. Igen, vortex det udjævnede hætteglas i 10 s indtil blanding af gel og farvestof er visualiseret.
    3. Hæld blandingen på et spinfilter til den øverste beholder.
    4. Spinfilteret mikrocentrifuge ved 2.240 x g ± 20% i 10 minutter ved stuetemperatur.
    5. Mærk det tilberedte gelfarvestof i røret, og kassér filteret i henhold til god laboratoriepraksis. Mærk røret, og registrer tilberedningsdatoen.
      BEMÆRK: Kassér filtratet i henhold til god laboratoriepraksis. Gelfarveblandingen kan bruges til 5 HS DNA-chips (High Sensitivity). Hvis den ikke bruges i mere end 1 time, opbevares den ved 4 °C. Opbevaring i mørke er mulig i op til 6 uger.
  3. For at indlæse gelfarveblandingen skal du sikre placeringen af bundpladen på spånprimingstationen og justere klemmen på den laveste position.
    1. Udjævning af gel-farvestofblandingen til stuetemperatur i 30 minutter, mens lyseksponering overvåges.
    2. Tag en ny HS DNA-chip fra en forseglet pose og læg den på spånprimingstationen, fjern derefter 9,0 μL af gelfarveblandingen og dispenser den i bunden af chippen, markeret som 'G'.
      BEMÆRK: Tegn gelfarveblandingen, og undgå partikler, der kan ophobes i bunden af hætteglasset. Mens du dispenserer gelfarveblandingen i HS DNA-chippen godt, skal du indsætte spidsen af pipetten helt for at forhindre dannelsen af store luftbobler. Desuden vil berøring af pipetten i kanterne af brønden give dårlige resultater.
    3. Placer stemplet ved 1 mL, og luk spånprimingstationen. Sørg for, at låsen af låsen klikker og indstille timeren til 60 s, og tryk derefter stemplet ned, indtil det holdes af klippet, og præcis efter 60 s, slip stemplet med klip-release mekanisme.
    4. Når stemplet trækker sig mindst tilbage til 0,3 mL-mærket, skal du vente i 5 s og derefter langsomt trække sig tilbage til 1 mL-positionen, derefter åbne spånprimingstationen og igen fjerne 9,0 μL af gelfarveblandingen og dispensere i bunden af HS DNA-chippen, mærket som 'G'.
  4. For at indlæse DNA-markøren skal du dispensere 5 μL af DNA-markøren i brønden, markeret med stigesymbolet. Gentag proceduren for alle de 11 prøvebrønde.
  5. For at indlæse stigen og prøverne skal 1 μL af DNA-stigen anbringes i brønden, markeres med stigesymbolet, og der tilsættes derefter 1 μL prøve (brugte brønde) eller 1 μL markør (ubrugte brønde) i alle 11 prøvebrønde.
  6. Hvirvel HS DNA-chippen i 60 s ved 2.400 omdrejninger i minuttet ved at placere chippen vandret i adapteren. Sørg for, at den bule, der fikserer HS DNA-chippen, ikke beskadiges under hvirvelstrømning.
  7. Hvis du vil indsætte HS DNA-chippen i fragmentanalysatorinstrumentet, skal du åbne låget og sikre, at elektrodepatronen er korrekt indsat, og at spånvælgeren er placeret til 'dsHigh Sensitivity DNA' i fragmentanalysatorinstrumentet.
  8. Monter forsigtigt HS DNA-chippen i beholderen, som kun passer én vej, og tab derefter låget ved at sikre, at elektrodepatronen passer nøjagtigt ind i HS DNA-chippens brønde.
  9. Displayet på fragmentanalysatorsoftwareskærmen angiver den indsatte HS DNA-chip og det lukkede låg gennem chipikonet øverst til venstre på skærmen.
  10. For at starte HS DNA-chippen skal du vælge dsDNA High Sensitivity Assay i menuen 'Assay' på instrumentskærmen og derefter udfylde tabellen med eksempelnavne korrekt ved at fodre oplysninger som eksempelnavne og kommentarer og starte chippen ved at klikke på knappen'Start' øverst til højre på skærmen.
  11. Elektroderensning efter en HS DNA-chipkørsel: Fjern straks den anvendte HS DNA-chip, så snart analysen er afsluttet, og kassér den i henhold til god laboratoriepraksis. Udfør følgende procedure for at sikre, at elektroderne er rene, uden rester fra den foregående analyse.
    1. Fyld langsomt 350 μL deioniseret analysekvalitetsvand i en af elektroderenseringsbrøndene, og placer elektroderenseren i fragmentanalysatorinstrumentet ved at åbne låget og luk derefter låget og vent i ca. 10 s.
    2. Fjern elektroderenseren ved at åbne låget og vente på yderligere 10 s, for at vandet på elektroderne fordamper, før låget lukkes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Plasma adskillelse
8,5-9 mL blod indsamlet i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddel rør giver omkring ~ 4 mL plasma i volumen. Mængden af plasma adskilt fra blod indsamlet i EDTA-rør kan variere afhængigt af temperaturen. Eksponering af EDTA-rør, der indeholder blod ved en temperatur på over 37 °C, fører til nedsat udbytte af plasmavolumen44.

Fluorometeranalyseresultater
cfDNA-koncentrationen i 1 mL plasma hos hver af gliompatienter #1 og #3 og sunde kontroller #H1, #H2 og #H3 var henholdsvis 137 ng, 12,6 ng, 6,52 ng, 2,26 ng og 2,48 ng. Hos gliompatienten var #2 cfDNA-koncentration imidlertid for lav til at blive påvist i et fluorometer. cfDNA koncentration i en kræftpatients 1 mL plasma varierer fra 0,5 til >1000 ng18, med en gennemsnitlig værdi på 20 ng. Hos raske personer varierer cfDNA-koncentrationen fra en ikke målbar koncentration til 16 ng med en middelværdi på 8 ng45. Genomisk DNA isoleret fra 200 μL buffy coat (PBMCs) giver omkring 25- 50 μg DNA.

Dna-fragmentanalysatoranalyseresultater
Ifølge en tidligere undersøgelse, cfDNA er beriget i 166-bp lange fragmenter, som tegner sig for ~ 85% af den samlede cfDNA i en patients plasma. I modsætning hertil tegner 332-bp lange fragmenter sig for 10%, og 498 bp lange fragmenter tegner sig for 5% af cfDNA46. To hovedfaktorer, der påvirker cfDNA fragmentanalysatoranalyseresultaterne, er genomisk DNA-forurening fra PBMCs og lav koncentration af cfDNA. Figur 1 viser den forventede cfDNA-bioanalyzergraf af gliompatient #1, hvor cfDNA-fragmenter beriges ved 166 bp, og der ikke er nogen genomisk DNA-kontaminering i prøve21. Figur 2 viser fragmentberigelsesgrafen, efter at NGS-biblioteksforberedelsen af gliomapatientens cfDNA #1 og fragmentberigelse flyttes fra 166 bp til 291 bp på grund af fastgørelse af 125 bp-indekser og adaptere til den. Figur 3 viser meget let berigelse af cfDNA-fragmenterne af gliompatient #2. På trods af den lave cfDNA-koncentration i gliompatient #2 fører tilføjelsen af NGS-adaptere til cfDNA- og PCR-forstærkningstrinnene til den synlige cfDNA-bibliotekstop på fragmentberigelsesgrafen Figur 4. Biblioteket blev derfor udarbejdet med succes ud fra denne cfDNA-prøve med lav koncentration, som vist i figur 4. I figur 5, cfDNA fragmenter af gliom patient #3 har vist sig at toppe nær 166 bp, men genomisk DNA-forurening er også synlige i nærheden af 10380 bp reference stigen peak.

Figure 1
Figur 1: En ideel cfDNA fragment analysatoranalyse graf af gliom prøve #1 cfDNA. Et stort højdepunkt blev observeret ved 166 bp og en mindre top blev observeret på 332 bp. Der blev ikke set nogen genomisk kontaminering i denne prøve, som forekommer tæt på den øvre markør på 10.380 bp. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En ideel cfDNA fragment analysator analyse graf af gliom prøve #1 cfDNA bibliotek. Efter ligating 125 bp næste generation sekventering bibliotek adaptere, 166 bp og 332 bp cfDNA fragmenter viste en stor top på 291 bp og en mindre top på 457 bp hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: cfDNA fragment analysatoranalyse graf af gliom prøve #2 cfDNA, viser en meget lille top på 166 bp. På grund af den lave koncentration af cfDNA, peak på 166 bp var næppe synlig. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: cfDNA fragment analysatoranalyse graf af cfDNA bibliotek af gliom prøve #2. Efter ligating 125 bp næste generation sekventering bibliotek adaptere og udfører PCR cykler under biblioteket forberedelse, knap synlige cfDNA peak på 166 bp eller helt usynlige toppe på 332 bp og 498 bp, var tydeligt synlige. Et stort højdepunkt var til stede tæt på 291 bp og et mindre højdepunkt på 457 bp, 623 bp, 789 bp og nær 2.500 bp blev observeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: cfDNA fragmentanalysatoranalyse, der viser genomisk DNA-kontaminering i gliomprøven #3 cfDNA. En lille top på 166 bp indikerede tilstedeværelsen af cfDNA og berigelse nær øvre markør (10.380 bp) var genomisk DNA-forurening. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel S1: Mængder af lysis buffer og bæretøj RNA (opløst i Buffer AVE), der kræves til behandling af 1 mL plasmaprøver. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Indsamling af en patients blod i et rør, forsendelse og opbevaring er afgørende indledende skridt i flydende biopsi. Forkert håndtering kan forringe plasmaets kvalitet og kan derfor forstyrre resultaterne af den flydende biopsi47. Hvis der opsamles en blodprøve i et EDTA-blodrør, skal plasmaet adskilles inden for to timer efter blodopsamlingen for at undgå lysis af WBCs og frigivelse af dets genomiske DNA i plasmaet48. WBCs kan også gennemgå apoptose i et EDTA-rør, hvis de opbevares i længere tid, og de resulterende cfDNA-fragmenter kan forurene original cfDNA i plasmaet48. Udsættelse af en blodprøve for en høj temperatur (>37 °C) eller overdreven omrystning af røret før plasmaadskillelse forårsager hæmolyse. Hæmoglobinet, der derfor forbliver som forurenende stof i plasma, påvirker cfDNA's downstream-processer, f.eks. Høj temperatur (>37 °C) påvirker også udbyttet af plasma i et EDTA-blodrør. Derfor er hurtig adskillelse af plasma efter dets indsamling i et EDTA-rør50 et vigtigt skridt i kvalitetskontrol af metoden. Hvis der opsamles blod i kommerciel cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrør, skal konserveringskemikaliet blandes med blodet umiddelbart efter blodopsamlingen40. Hvis konserveringskemikaliet ikke blandes korrekt, føres der til dannelse af mikroclots i plasmaet. Disse tilstopper silicamembranerne i en kolonne under cfDNA-ekstraktionsprocessen og sænker udbyttet af cfDNA. Moderat rystelse af blod i røret forårsager ikke hæmolyse; selv om overdreven rysten kan forårsage hæmolyse selv i disse rør40. Derfor bør overdreven omrystning undgås under forsendelse eller håndtering af disse rør. Blodrør anbefales at blive afsendt i oprejst stilling.

Den nøjagtige kvantificering og vurdering af cfDNA-koncentrationen pr. enhedsplasma er et vigtigt skridt i flydende biopsi, da plasma cfDNA-koncentrationen er direkte forbundet med fysiologiske og patologiske processer51. CFDNA-koncentrationen er højere hos patienter med kræft end hos raske forsøgspersoner52. Øget cfDNA koncentration i humant blod er ikke specifik for kræft; gravide kvinder og patienter, der modtager transplantationer også en tendens til at have forhøjet cfDNA koncentrationer i blodet21. Foreninger har også vist sig for inflammation, vævstraume, diabetes, myokardieinfarkt og sepsis med et øget niveau af cfDNA-koncentration53. Koncentrationen af plasma cfDNA i tidlig fase kræftpatienter tendens til at være lavere end hos patienter med avancerede eller metastatiske tumorer. Dette understøtter en direkte tilknytning af cfDNA med en tumorbyrde54. CFDNA-koncentrationen i blodet varierer betydeligt mellem 0,5 og >1000 ng/mL hos kræftpatienter og mellem 0 og 100 ng/mL hos raske forsøgspersoner18. Til biblioteksforberedelsen kræves mindst 0,5 ng cfDNA. For at opnå den mindste efterspørgselsmængde af cfDNA til sekventering kan man starte med mindst 2 mL af en blodprøve eller 1 mL plasmaprøve. Desuden reducerer tekniske fejl under plasma cfDNA-ekstraktionen også cfDNA-udbyttet og den deraf følgende koncentration og afviger derved fra den faktiske plasma cfDNA-koncentration. cfDNA-nedbrydning kan forekomme på grund af antikoaguleringsmidler i EDTA-rør eller på grund af processen med flere optøning og frysning af plasmaprøver. En dårlig aktivitet af proteinase K under lysis processen resulterer også i et lavt udbytte af cfDNA. Proteinase K aktivitet falder på grund af sin langvarige eksponering for høje temperaturer. Brugen af lav koncentration ethanol i stedet for 96-100% under cfDNA ekstraktion vask trin forårsager også et lavt udbytte af cfDNA. Derfor er det vigtigt at undgå tekniske fejl i den flydende biopsiteknik for at opnå nøjagtige og pålidelige resultater.

Kvalitativ analyse af cfDNA er et centralt trin, hvor den faktiske fordeling af DNA-fragmenter, der er til stede i den udvundne cfDNA-prøve, anslås. Kvantitative resultater af cfDNA er først pålidelige efter at have bekræftet dens renhed ved kvalitativ analyse. Derfor viser en ideel graf over cfDNA genereret i DNA-fragmentanalysatoranalysen berigelse af den store top af cfDNA-fragmenter nær 166 bp og en mindre top nær 332 bp længde. Dette indikerer, at den udvundne CFDNA-prøve ikke er forurenet med genomisk DNA fra WBCs. Hvis et fragment er beriget fra 7.000 bp til referencestigen (10.380bp) og videre, indikerer dette forurening af en cfDNA-prøve med WBC genomisk DNA. Hvis genomisk DNA-kontaminering ses i en cfDNA-prøve efter skøn over DNA-fragmentstørrelse, kan prøven køres på 2% agarosegel med en 100 bp stige, og gel kan fjernes mellem intervallet ~ 150-200 bp, efterfulgt af en gelekstraktionsanalyse. En vis mængde cfDNA går tabt under agarose gel størrelse udvælgelsesprocessen. NGS-bibliotekets forberedelsestrin kræver dog mindst 0,5 ng og maksimalt 1.000 ng input-DNA-materiale for at forberede biblioteker til sekventering. Derfor, hvis den samlede mængde cfDNA er lig med eller mere end 0,5 ng, er det nok mængde til biblioteksforberedelsestrin. Desuden passerer sådanne prøver biblioteksforberedelsesprocessen med succes, og det resulterende bibliotek viser et stort højdepunkt tæt på 291 bp og en mindre top på 457 bp på grund af tilføjelsen af 125 bp-indekser og adaptere.

NGS-dataanalysen er det sidste trin i den NGS-baserede flydende biopsiteknik, og lister over mutationer og gengenfusioner3,55,56,57 genereres i dette trin. Mutationer og gengenfusioner, der identificeres, kan vurderes i henhold til tidligere undersøgelser af kræftmutationslandskaber58,59, tidligere karakteriserede genmutationer60 eller gengenfusioner61,62,63. Disse kan tjene som prognostiske64 og diagnostiske7 biomarkører hos kræftpatienter. For eksempel er R132H-mutationen i isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1) genet et afgørende tegn på sekundær glioblastoma kræft, og adskiller det også fra primær glioblastoma, hvor denne mutation normalt er fraværende65. Desuden er kronisk myelogen leukæmi (CML) karakteriseret ved en BCR/ABL1 genfusion som følge af en afbalanceret translokation mellem kromosom 9 og 2261. BCR/ABL1-genet og dets mRNA- og fusionsprotein er unikke for CML-forfædre og udgør derfor et godt mål for behandling66.

Avanceret diagnose, den korrekte iscenesættelse af tumor og behandling overvågning er en aktuel strategi for effektiv forvaltning af kræft. Indtil for nylig har vævsbiopsi været guldstandarden for den histologiske evaluering af tumorvæv. Men efter stor forskning på dette område og fremkomsten af teknologi har det vist sig, at en enkelt biopsi ikke er i stand til at give hele mutationslandskabet af en tumor, og at serielle biopsier normalt er upraktiske at udføre på grund af deres invasivitet, især i glioblastoma og lymfom, hvor biopsier er meget invasive. Derudover er ca. 16% af nålebiopsier forbundet med proceduremæssige komplikationer67. Desuden kræver genomisk profilering af høj kvalitet en tilstrækkelig mængde væv, et krav, der normalt ikke opfyldes af nålebiopsi68.

Den flydende biopsier, fra en rutinemæssig blodprøve ved at analysere tumor-afledt DNA viser sig at erstatte eller adjungere den rutinemæssige nål væv biopsi procedurer12. Analyse af tumor-afledt DNA / cfDNA gennem plasma ved flydende biopsi er en minimalt invasiv og effektiv procedure for molekylær profilering af tumorer. Det kan i det væsentlige tillade behandling overvågning ved seriel prøveudtagning over tid uden de potentielle risici og komplikationer normalt forbundet med traditionelle tumorvæv biopsi på grund af sin invasive karakter69. Desuden fandt undersøgelser, der sammenligner nålebiopsien med cfDNA-analyse ved flydende biopsi af en enkelt tumorlæsion, at cfDNA-profilering kan tilbyde en fuld molekylær heterogenitet, at en tumor kan huses af flere forskellige klonpopulationer70.

Men selv om plasma cfDNA baseret diagnose har mange fordele i forhold til tumorvæv biopsi, der er stadig nogle afgørende begrænsninger, der hæmmer dens anvendelighed i den generelle kliniske praksis. Begrænsninger af cfDNA-baseret væskebiopsidiagnose omfatter de højere omkostninger ved den overordnede procedure, behovet for DNA af høj kvalitet og en dedikeret bioinformatiker for nødvendigheden af en omfattende dataanalyse71. På grund af datastyringsproblem forbundet med cfDNA-analyse giver NGS også problemer i sin umiddelbare anvendelse i klinikken. Udfordringerne ved den datastyring , som NGS udgør , skyldes primært vanskeligheden ved at skelne mellem den iboende baggrundsstøj fra dyb sekventering og de afvigelser , der er forbundet med tumoren72. Endelig er de på grund af den manglende adgang til de kliniske validitets- og nyttedata for størstedelen af de flydende biopsianalyser i øjeblikket kun begrænset til kliniske undersøgelser og grundforskning13.

Den fremtidige udvikling inden for den flydende biopsi teknik, forventes gennem kombineret indsats fra grundforskning inden for biologi, fysiologi, molekylær biologi, analyseteknikker, statistisk analyse til datastyring og maskinlæringsteknologi73,74. Derudover er adskillige kliniske forsøg baseret på cfDNA biomarkør evaluering i gang, og deres resultater vil bidrage til at fastslå gyldigheden af teknikken. Disse kombinerede indsats forhåbentlig vil etablere den flydende biopsi platform gennem cfDNA analyse som en kraftfuld prognostiker, diagnostiske og behandling overvågning værktøj i onkologi kliniske indstilling inden for de næste fem år70,75.

Afslutningsvis tilbyder cfDNA-baseret flydende biopsi en sikker og ikke-invasiv tilgang til identifikation af genomiske biomarkører, der er nyttige i kræftsygdomsstyring. For at opnå pålidelige og nøjagtige resultater kræves der dog især standardiserede protokoller for blodindsamling, plasma/WBC-adskillelse, cfDNA-ekstraktion og cfDNA-kvantitativ og kvalitativ analyse74,75.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Laboratoriet for Cancer Genomics og Biocomputing af komplekse sygdomme for deres ivrige observationelle input og deres deltagelse i flere diskussioner på forskellige stadier af dette projekt. Finansieringsstøtten omfatter Israel Cancer Association (ICA-tilskud til M.F-M 2017-2019) og Kamin-tildeling af Israel Innovation Authority (til M.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578, (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1, (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48, (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30, (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18, (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22, (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57, (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37, (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11, (7), 950 (2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19, (10), 2877 (2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14, (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087 (2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1, (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463 (2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359, (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17, (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20, (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35, (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11, (11), 1656 (2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61, (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20, (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254, (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134, (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377, (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54, (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6, (1), 8839 (2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4, (4), 295 (2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4, (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2, (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19, (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1, (1), 96 (2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19, (6), 1610 (2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31, (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29, (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17, (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21, (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20, (3), 704 (2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2, (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9, (1), 12 (2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11, (11), 0166354 (2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7, (11), 47020 (2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8, (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4, (7), 00699 (2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20, (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8, (1), 7375 (2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23, (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11, (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7, (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775, (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411, (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45, (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47, (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155, (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21, (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28, (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22, (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17, (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18, (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6, (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31, (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84, (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19, (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63, (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579, (7800), 9 (2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579, (7800), 6-8 (2020).
Påvisning af cellefri DNA i blodplasmaprøver af kræftpatienter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter