I dette papir præsenterer vi en detaljeret protokol for ikke-invasiv flydende biopsi teknik, herunder blodopsamling, plasma og buffy pels adskillelse, cfDNA og kimbar DNA ekstraktion, kvantificering af cfDNA eller kim kim DNA, og cfDNA fragment berigelse analyse.
Identifikation mutationer i tumorer af kræftpatienter er et meget vigtigt skridt i sygdomshåndtering. Disse mutationer tjene som biomarkører for tumor diagnose samt for behandling udvælgelse og dens reaktion hos kræftpatienter. Den nuværende guld standard metode til påvisning af tumor mutationer indebærer en genetisk test af tumor DNA ved hjælp af tumor biopsier. Denne invasive metode er imidlertid vanskelig at udføre gentagne gange som en opfølgningstest af tumormutationsrepertoiret. Flydende biopsi er en ny og spirende teknik til påvisning af tumormutationer som en brugervenlig og ikke-invasiv biopsi tilgang.
Kræftceller formere sig hurtigt. Sideløbende gennemgår mange kræftceller apoptose. Snavs fra disse celler frigives i en patients kredsløbssystem sammen med fint fragmenterede DNA-stykker, kaldet cellefri DNA (cfDNA) fragmenter, som bærer tumor-DNA-mutationer. Derfor indsamles der blodprøver fra kræftpatienterne til identifikation af cfDNA-baserede biomarkører ved hjælp af flydende biopsiteknik efterfulgt af adskillelse af plasma og buffy coat. Dernæst behandles plasma til isolering af cfDNA, og den respektive buffy frakke behandles til isolering af en patients genomiske DNA. Begge nukleinsyreprøver kontrolleres derefter for deres mængde og kvalitet; og analyseres for mutationer ved hjælp af næste generations sekventeringsteknikker (NGS).
I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol for flydende biopsi, herunder blodsamling, plasma og buffy coat separation, cfDNA og kim-DNA-ekstraktion, kvantificering af cfDNA eller kim-DNA og cfDNA fragmentberigelsesanalyse.
Teknologiske fremskridt har ført til sekventering af hundredvis af kræftgenomer og transskriptioner1. Dette har bidraget til at forstå landskaber af molekylære ændringer på tværs af forskellige kræfttyper2. Yderligere undersøgelser af disse landskaber har hjulpet med at karakterisere de sekventielle somatiske ændringer og gengenfusioner3, der er involveret i kræft eller tumorprogression, ved serielt at forstyrre apoptoseveje4. Derfor kan somatiske mutationer og gen-genfusioner give oplysninger om tumorer ved at tjene som biomarkører hos individuelle patienter for en bestemt tumortype5, identificere eksisterende primære tumorer prognose6, kategorisere sekundære tumorer baseret på molekylære ændringer7og identificere druggable tumormål8. Sådanne oplysninger kan gøre det lettere at vælge personlig behandling af kræftpatienter og ved bestemmelse af positive og negative behandlingsresponser9. Men at opnå tumormateriale til identifikation af genomisk profilering af tumorvæv er en invasiv procedure10. Desuden, en tumor biopsi omfatter kun en lille del af en heterogen tumor; og kan derfor ikke være repræsentativ for den molekylære profil af heletumoren 11. Seriel overvågning og tumor genotyping kræver en gentagen samling af tumorvæv, hvilket normalt ikke er muligt på grund af invasiviteten af tumorbiopsiproceduren og de sikkerhedsproblemer, der opstår ved sådanne procedurer12.
Den flydende biopsi teknik, på den anden side, har fået enorm opmærksomhed i præcision onkologi i løbet af det sidste årti13,14. Det skyldes hovedsageligt denne tekniks ikke-invasivitet og muligheden for, at den gentages på flere tidspunkter, hvilket muliggør en brugervenlig og sikker overvågningsteknik til sygdomskurserne15,16. Flydende biopsi er baseret på et fænomen, som tumorceller formere sig hurtigt, og samtidig mange af dem gennemgår apoptose og nekrose. Dette fører til frigivelse af apptotisk cellerester i patienternes blod sammen med de DNA-fragmenter, der skæres i præcise størrelser under apoptose17. Apoptose af ikke-kræftceller fører også til frigivelse af dets cellulære snavs i blodet, men apoptosehastigheden i disse celler er relativt meget lavere end tumorceller18. Rationalet i den flydende biopsiteknik er at fange tumorrelaterede molekyler som DNA, RNA, proteiner og tumorceller14,19, der cirkulerer kontinuerligt i blodet. Forskellige teknikker20 kan bruges til analyse af disse molekyler, herunder next-generation sekventering (NGS), digital dråbe polymerase kædereaktion (ddPCR), real-time PCR, og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). Flydende biopsi teknik gør det muligt at identificere biomarkører, der er kendetegnende for tumorceller. Disse biomarkørmolekyler frigives ikke kun fra specifikke dele af en tumor, men snarere fra alle dele af tumoren21. Derfor repræsenterer markører identificeret i flydende biopsi den molekylære profilering af en hel heterogen tumor, ud over andre tumorer i kroppen, og har således fordele i forhold til vævsbiopsibaseret teknik22.
CFDNA har en kort halveringstid i det cirkulerende blod fra et par minutter til 1-2 timer23. Den korte halveringstid for cfDNA letter imidlertid realtidsanalyser ved at evaluere behandlingsrespons og dynamiske tumorvurderinger. Den tumor-afledte cfDNA niveauer indikerer prognostication af tumor fase / størrelse fremgår af flere undersøgelser, som viste en sammenhæng mellem cfDNA niveauer og overlevelse resultater24. Desuden har undersøgelser vist, at cfDNA har en bedre forudsigelseskapacitet end eksisterende tumormarkører25. Prognosen for cfDNA er endnu mere udtalt efter kræftbehandling, højere niveauer af cfDNA efter behandling korrelerer godt med en reduceret overlevelsesrate og modstand mod behandling. Mens lavere niveauer af cfDNA efter behandling generelt svarer til positiv behandlingsrespons. Derudover letter cfDNA tidlig påvisning af behandlingsrespons end de traditionelle detektionsmetoder.
CFDNA øger muligheden for tidlig påvisning af kræftrelaterede mutationer: i den tidlige fase sygdom15, symptomernes begyndelse26 og før kræftdiagnose op til 2 år27. Da cfDNA frigives fra flere tumorregioner eller foci, giver dens analyse et omfattende overblik over tumorgenomet, det repræsenterer28. Derfor gør cfDNA det muligt at opdage somatiske mutationer, der kan være gået glip af i vævsprøverne29. Som intra-tumor heterogenitet og subklonale mutationer kan påvises ved dyb sekventering af genomiske regioner spænder over tusindvis af baser, derfor analysen af cfDNA gør det muligt at afdække specifikke molekylære undertyper med forskellige genomiske signaturer13. For at opnå et tilsvarende niveau af information gennem vævsprøve mange faste biopsier ville have været nødvendig.
Desuden cfDNA niveauer hos patienter med en lokaliseret sygdom som tyktarm, æggestokkene, og lungekræft efter en kirurgisk behandling og / eller kemoterapi, viste sig at være en kraftig prognostisk markør for kræft tilbagefald og behandlingsresultater20. Desuden, hos patienter med tyktarms-, bryst- og lungekræft, kunne analyser af cfDNA fra blodet med succes opdage de tumorspecifikke ændringer, hvilket førte til den præcise forudsigelse af gentagelse flere måneder i forvejen13. Endvidere behandlingsresistensmarkørerne, såsom KRAS-mutationer hos patienter med CRC, der modtager anti-EGFR-behandling30; VAF for gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos patienter med brystkræft efter behandling med forskellige behandlingsformer31; og EGFR T790M resistensmutation hos lungekræftpatienter behandlet med EGFR-målrettede TKIs32 kan også identificeres ved cfDNA-analyse.
Kort sagt kan cfDNA-analysen bruges til at identificere præcise biomarkører inden for onkologi13,33. I denne protokol blev blodprøver af 3 gliompatienter og 3 sunde kontroller behandlet for at opnå genomisk DNA fra WBCs og cfDNA fra plasmaet. I glioma cancer fungerer mutationer i IDH, TERT, ATRX, EGFR og TP53 som en diagnostisk såvel som prognostiske markører, der kan hjælpe med tidlig diagnose af glioma tumorer, klassificere forskellige typer glioma tumorer, vejlede den nøjagtige behandling for den enkelte patient og forstå behandlingsresponset34,35. Mutationsstatus for disse gener kan identificeres ved hjælp af blod-afledt cfDNA. I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol over plasma-afledt cfDNA, der er blevet brugt til at studere mutationsændringer i glioma cancer12. En sådan cfDNA-baseret flydende biopsiprotokol forklaret i denne artikel kan bruges til at studere mutationsændringer i mange andre typer kræft. Desuden har en nylig undersøgelse vist, at cfDNA-baseret flydende biopsi kan detektere 50 forskellige typer kræft36.
Blodprøveindsamling, opbevaring og forsendelse er afgørende trin i denne protokol, da ukontrolleret temperatur under disse trin forårsager lysis af WBC’er, hvilket fører til frigivelse af genomisk DNA fra WBC i plasmaet og forårsager forurening af cfDNA-prøven, hvilket påvirker resten af proceduren37. Hæmolyse på grund af ukontrolleret temperatur kan forringe downstream prøveforberedelsesprocesserne for cfDNA, såsom PCR-trin38. Serumet indeholder en høj andel af kim-cfDNA snarere end plasma, selv om det præsenterer en stor baggrundsstøj for tumor-associeret cfDNA39. Derfor er plasma til isolering af tumorrelateret cfDNA en egnet prøve39. Blod, der trækkes i et antikoagulerende middel, der indeholder blodopsamlingsrør, skal centrifuges straks eller inden for op til to timer for at adskille plasmaet og undgå cfDNA-kontaminering. I denne protokol anvendes dedikerede kommercielle cfDNA-konserveringsblodopsamlingsrør (se Materialetabel), som er et alternativ til antikoagulerende, der indeholder blodopsamlingsrør. Disse dedikerede blodopsamlingsrør bevarer cfDNA og cfRNA og forhindrer lysis af WBCs i op til 30 dage ved omgivelsestemperatur og op til 8 dage ved 37 °C. Dette gør det lettere at opretholde en passende temperatur under en blodprøveforsendelse, og indtil plasmaet og WBC adskilles40.
Der findes i øjeblikket tre typer cfDNA-ekstraktionsmetoder: faseisolation, siliciummembranbaseret spinkolonne og magnetisk perlebaseret isolation41. Den siliciummembranbaserede spin-kolonnemetode gav en stor mængde cfDNA med høj integritet sammenlignet med andre cfDNA-ekstraktionsmetoder42.
Den kvantitative evaluering af DNA er et grundlæggende krav i flydende biopsi, der er behov for at udvikle en enkel, overkommelig og standardiseret procedure for deres nemme implementering og brede brug. Tre almindeligt anvendte metoder til cfDNA-kvantificering er spektrofotometrisk, fluormetrisk og qPCR. Den fluormetriske metode er bevist bedre i forhold til de andre metoder vedrørende nøjagtighed, omkostninger og letledning43.
CFDNA’s integritet og renhed kan estimeres ved enten agaroseelektroforese eller kapillærelektroforese. Agarose elektrophoresis hverken viser følsomhed ved lav koncentration af cfDNA eller har høj opløsning til at vise præcis fragmentstørrelse af cfDNA. På den anden side har kapillær elektroforese en fordel i forhold til agaroseelektroforesen ved at overvinde de tilknyttede udfordringer og derfor i vid udstrækning anvendes af forskerne til cfDNA fragmentstørrelsesanalyse. I denne protokol blev fragmentstørrelsesfordelingen af isolerede cfDNA anslået ved hjælp af et automatiseret kapillærelektroforeseinstrument (se materialetabel).
Indsamling af en patients blod i et rør, forsendelse og opbevaring er afgørende indledende skridt i flydende biopsi. Forkert håndtering kan forringe plasmaets kvalitet og kan derfor forstyrre resultaterne af den flydende biopsi47. Hvis der opsamles en blodprøve i et EDTA-blodrør, skal plasmaet adskilles inden for to timer efter blodopsamlingen for at undgå lysis af WBCs og frigivelse af dets genomiske DNA i plasmaet48. WBCs kan også gennemgå apoptose i et EDTA-rør,…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Laboratoriet for Cancer Genomics og Biocomputing af komplekse sygdomme for deres ivrige observationelle input og deres deltagelse i flere diskussioner på forskellige stadier af dette projekt. Finansieringsstøtten omfatter Israel Cancer Association (ICA-tilskud til M.F-M 2017-2019) og Kamin-tildeling af Israel Innovation Authority (til M.F-M.).
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies, Inc. | G2939BA | The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules. |
Adjustable Clip for Priming Station | Agilent Technologies, Inc. | 5042-1398 | Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming. |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Inc. | 5067-4626 | The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries |
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes | Norgen Biotek Corp. | 63950 | Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping |
Chip Priming Station | Agilent Technologies, Inc. | 5065-4401 | Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip |
Electrode Cleaner Kit | Agilent Technologies, Inc. | 5065-9951 | Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes. |
Filters for Gel Matrix | Agilent Technologies, Inc. | 185-5990 | Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix |
IKA Basic Chip Vortex | IKA-Werke GmbH & Co. KG | MS-3-S36 | Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips |
NucleoSpin Tissue kit | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources. |
QIAamp circulating nucleic acid kit | Qiagen | 55114 | The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids. |
QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel. |
QIAvac Connecting System | Qiagen | 19419 | In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle. |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation. |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer. |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL. |
Vacuum Pump | Qiagen | 84010 | used for vacuum processing of QIAGEN columns |
Miscellaneous | |||
50 ml centrifuge tubes | |||
Crushed ice | |||
Ethanol (96–100%) | |||
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes) | |||
Isopropanol (100%) | |||
Microcentrifuge | |||
Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
Pipettes (adjustable) | |||
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination) | |||
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C |