Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten

doi: 10.3791/61449 Published: September 9, 2020

Summary

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor niet-invasieve vloeibare biopsietechniek, waaronder bloedafname, plasma- en buffy coatscheiding, cfDNA- en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Abstract

Het identificeren van mutaties in tumoren van kankerpatiënten is een zeer belangrijke stap in de ziektebestrijding. Deze mutaties dienen als biomarkers voor tumordiagnose en voor de behandelingsselectie en de respons ervan bij kankerpatiënten. De huidige gouden standaardmethode voor het detecteren van tumormutaties omvat een genetische test van tumor-DNA door middel van tumorbiopsieën. Deze invasieve methode is echter moeilijk herhaaldelijk uit te voeren als vervolgtest van het tumormutatierepertoire. Vloeibare biopsie is een nieuwe en opkomende techniek voor het detecteren van tumormutaties als een gebruiksvriendelijke en niet-invasieve biopsiebenadering.

Kankercellen vermenigvuldigen zich snel. Tegelijkertijd ondergaan tal van kankercellen apoptose. Puin van deze cellen komt vrij in de bloedsomloop van een patiënt, samen met fijn gefragmenteerde DNA-stukken, celvrije DNA-fragmenten (cfDNA) genoemd, die tumor-DNA-mutaties dragen. Daarom worden voor het identificeren van cfDNA-gebaseerde biomarkers met behulp van vloeibare biopsietechniek bloedmonsters verzameld van de kankerpatiënten, gevolgd door de scheiding van plasma en buffy coat. Vervolgens wordt plasma verwerkt voor de isolatie van cfDNA en wordt de respectieve buffy coat verwerkt voor de isolatie van het genomische DNA van een patiënt. Beide nucleïnezuurmonsters worden vervolgens gecontroleerd op hun hoeveelheid en kwaliteit; en geanalyseerd op mutaties met behulp van next-generation sequencing (NGS) technieken.

In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd protocol voor vloeibare biopsie, inclusief bloedafname, plasma- en buffy coat separation, cfDNA en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Technologische vooruitgang heeft geleid tot de volgorde van honderden kankergenoom en transcriptomen1. Dit heeft bijgedragen tot het begrijpen van landschappen van moleculaire veranderingen in verschillende kankertypen2. Verdere studies naar deze landschappen hebben geholpen bij het karakteriseren van de sequentiële somatische veranderingen en gengenfusies3 die betrokken zijn bij kanker of tumorprogressie, door apoptoseroutes serieel te verstoren4. Daarom kunnen somatische mutaties en gengenfusies informatie over tumoren verstrekken door te dienen als biomarkers bij individuele patiënten voor een bepaald tumortype5, bestaande primaire tumorenprognose6te identificeren , secundaire tumoren te categoriseren op basis van moleculaire veranderingen7, en druggable tumordoelen te identificeren8. Dergelijke informatie kan vergemakkelijken bij het selecteren van gepersonaliseerde behandeling voor kankerpatiënten en bij het bepalen van positieve en negatieve behandelingsreacties9. Het verkrijgen van tumormateriaal voor het identificeren van genomische profilering van tumorweefsel is echter een invasieve procedure10. Bovendien omvat een tumorbiopsie slechts een klein deel van een heterogene tumor; en kan daarom niet representatief zijn voor het moleculaire profiel van de gehele tumor11. Seriële monitoring en tumorgeneratie vereisen een herhaalde verzameling tumorweefsels, wat meestal niet haalbaar is vanwege de invasieve tumorbiopsieprocedure en de veiligheidsproblemen die voortvloeien uit dergelijke procedures12.

De vloeibare biopsietechniek heeft daarentegen de afgelopen tien jaar enorme aandacht gekregen in precisie-oncologie13,14. Het is voornamelijk te wijten aan de niet-invasieve van deze techniek en de mogelijkheid dat deze op meerdere tijdstipen wordt herhaald, waardoor een gebruiksvriendelijke en veilige monitoringtechniek voor de ziektecursussen15,16mogelijk wordt. Vloeibare biopsie is gebaseerd op een fenomeen dat tumorcellen zich snel vermenigvuldigen, en tegelijkertijd ondergaan velen van hen apoptose en necrose. Dit leidt tot het vrijkomen van apoptotisch celafval in het bloed van de patiënten, samen met de DNA-fragmenten die op precieze grootte worden gesneden tijdens apoptose17. De apoptose van niet-kankercellen leidt ook tot het vrijkomen van zijn cellulaire puin in het bloed, maar de apoptosesnelheid in deze cellen is relatief veel lager dan tumorcellen18. De rationale van de vloeibare biopsietechniek is om tumor-geassocieerde moleculen zoals DNA, RNA, eiwitten en tumorcellen14,19 vast te leggen die continu in het bloed circuleren. Verschillende technieken20 kunnen worden gebruikt voor de analyse van deze moleculen, waaronder Next-Generation Sequencing (NGS), digitale druppelpolymerasekettingreactie (ddPCR), real-time PCR en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA). Vloeibare biopsietechniek maakt het mogelijk om biomarkers te identificeren die kenmerken van tumorcellen zijn. Deze biomarkermoleculen komen niet alleen vrij uit specifieke delen van een tumor, maar eerder uit alle delen van de tumor21. Vandaar dat markers geïdentificeerd in vloeibare biopsie de moleculaire profilering van een volledige heterogene tumor vertegenwoordigen, naast andere tumoren in het lichaam, dus voordelen hebben ten opzichte van de op weefselbiopsie gebaseerde techniek22.

De cfDNA heeft een korte halfwaardetijd in het circulerende bloed, variërend van een paar minuten tot 1-2 uur23. De korte halfwaardetijd van cfDNA vergemakkelijkt echter real-time analyses door de behandelingsrespons en dynamische tumorbeoordelingen te evalueren. De van tumoren afgeleide cfDNA-niveaus wijzen op prognose van het tumorstadium/-grootte, zoals blijkt uit verschillende studies, die een verband aantoonden tussen cfDNA-niveaus en de overlevingsresultaten24. Bovendien hebben studies aangetoond dat de cfDNA een betere voorspellingscapaciteit heeft dan bestaande tumormarkers25. De prognosticatie van cfDNA is nog sterker na kankerbehandeling, hogere niveaus van cfDNA na behandeling correleren goed met een verminderde overlevingskans en resistentie tegen behandeling. Terwijl lagere niveaus van cfDNA na de behandeling over het algemeen overeenkomen met een positieve behandelingsrespons. Bovendien vergemakkelijkt de cfDNA vroege detectie van de behandelingsrespons dan de traditionele detectiemethoden.

De cfDNA verhoogt de kans op vroegtijdige opsporing van kankergerelateerde mutaties: tijdens ziekte in een vroeg stadium15, het begin van symptomen26 en vóór kankerdiagnose tot 2 jaar27. Aangezien cfDNA wordt vrijgegeven uit meerdere tumorgebieden of foci, biedt de analyse een uitgebreid overzicht van het tumorgenoom dat hetvertegenwoordigt 28. Daarom maakt de cfDNA het mogelijk somatische mutaties te detecteren die mogelijk zijn gemist in de weefselmonsters29. Aangezien intra-tumor heterogeniteit en subklonale mutaties kunnen worden gedetecteerd door diepe sequencing van genomische regio's die duizenden bases beslaan, maakt de analyse van de cfDNA het mogelijk om specifieke moleculaire subtypen met afzonderlijke genomische handtekeningen te ontdekken13. Om een vergelijkbaar niveau van informatie via weefselmonster te verkrijgen, zouden veel vaste biopsieën nodig zijn geweest.

Bovendien bleek het cfDNA-gehalte bij patiënten met een gelokaliseerde ziekte zoals dikke darm-, eierstok- en longkanker na een chirurgische behandeling en/of chemotherapie een krachtige prognostische marker te zijn voor terugkeer van kanker en behandelingsresultaten20. Bovendien konden bij patiënten met darm-, borst- en longkanker analyses van cfDNA uit het bloed met succes de tumorspecifieke veranderingen detecteren, wat leidde tot de nauwkeurige voorspelling van recidief enkele maanden van tevoren13. Bovendien zijn de behandelingsresistentiemarkers, zoals KRAS-mutaties bij patiënten met CRC die anti-EGFR-therapie krijgen30; VAF's voor genen zoals PIK3CA, MED1 of EGFR bij patiënten met borstkanker na de behandeling met verschillende therapieën31; en EGFR T790M resistentiemutatie bij longkankerpatiënten behandeld met EGFR-gerichte TKIs32 kan ook worden geïdentificeerd door cfDNA-analyse.

Samengevat kan de cfDNA-analyse worden gebruikt om nauwkeurige biomarkers op het gebied van oncologie13,33te identificeren . In dit protocol werden bloedmonsters van 3 glioompatiënten en 3 gezonde controles verwerkt om genomisch DNA van WBC's en cfDNA uit het plasma te verkrijgen. Bij glioomkanker dienen mutaties in IDH , TERT, ATRX, EGFR en TP53 als diagnostische en prognostische markers die kunnen helpen bij de vroege diagnose van glioomtumoren, het classificeren van verschillende soorten glioomtumoren, het begeleiden van de nauwkeurige behandeling voor de individuele patiënt en het begrijpen van de behandelingsrespons34,35. Mutatiestatus van deze genen kan worden geïdentificeerd met behulp van bloed-afgeleide cfDNA. In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd protocol van plasma-afgeleid cfDNA dat is gebruikt voor het bestuderen van mutatieveranderingen in glioomkanker12. Een dergelijk op cfDNA gebaseerd vloeibaar biopsieprotocol dat in dit artikel wordt uitgelegd, kan worden gebruikt voor het bestuderen van mutatieveranderingen bij veel andere soorten kankers. Bovendien heeft een recente studie aangetoond dat op cfDNA gebaseerde vloeibare biopsie 50 verschillende soorten kankers kan detecteren36.

Het verzamelen, opslaan en verzenden van bloedmonsters zijn cruciale stappen in dit protocol, omdat ongecontroleerde temperatuur tijdens deze stappen lyse van WBC's veroorzaakt, wat leidt tot het vrijkomen van genomisch DNA uit de WBC in het plasma en verontreiniging van het cfDNA-monster veroorzaakt, wat de rest van de procedure beïnvloedt37. Hemolyse als gevolg van ongecontroleerde temperatuur kan downstream monstervoorbereidingsprocessen van cfDNA aantasten, zoals de PCR-stappen38. Het serum bevat een hoog percentage kiembaan cfDNA in plaats van plasma, hoewel het een groot achtergrondgeluid vertoont voor tumor-geassocieerde cfDNA39. Daarom is plasma voor het isoleren van tumorgerelateerde cfDNA een geschikt monster39. Bloed dat wordt getrokken in een anticoagulant dat bloedafnamebuis bevat, moet onmiddellijk of binnen maximaal twee uur worden gecentrifugeerd, om het plasma te scheiden en cfDNA-besmetting te voorkomen. In dit protocol worden speciale commerciële cfDNA-conserveringsbloedafnamebuizen gebruikt (zie Tabel met materialen),die een alternatief zijn voor anticoagulantiva die bloedafnamebuizen bevatten. Deze speciale bloedafnamebuizen behouden cfDNA en cfRNA en voorkomen lyse van WBC's gedurende maximaal 30 dagen bij omgevingstemperatuur en tot 8 dagen bij 37 °C. Dit vergemakkelijkt het handhaven van de juiste temperatuur tijdens een bloedmonsterverzending en totdat het plasma en WBC zijn gescheiden40.

Er zijn momenteel drie soorten cfDNA-extractiemethodologieën beschikbaar: fase-isolatie, spinkolom op basis van siliciummembraan en isolatie op basis van magnetische kralen41. De op siliciummembraan gebaseerde spinkolommethode leverde een hoge hoeveelheid cfDNA op met een hoge integriteit in vergelijking met andere cfDNA-extractiemethoden42.

De kwantitatieve evaluatie van DNA is een fundamentele vereiste in vloeibare biopsie, er is behoefte aan het ontwikkelen van een eenvoudige, betaalbare en gestandaardiseerde procedure voor hun eenvoudige implementatie en breed gebruik. Drie veelgebruikte methoden voor cfDNA-kwantificering zijn spectrofotometrisch, fluorimetrisch en qPCR. De fluorimetrische methode is beter bewezen ten opzichte van de andere methoden met betrekking tot de nauwkeurigheid, kosten en het gemak van geleiding43.

De integriteit en zuiverheid van de cfDNA kan worden geschat door agarose-elektroforese of capillaire elektroforese. Agarose elektroforese toont noch gevoeligheid bij lage concentratie cfDNA noch heeft hoge resolutie om nauwkeurige fragmentgrootte van cfDNA te tonen. Aan de andere kant heeft capillaire elektroforese een voordeel ten opzichte van de agarose-elektroforese door de bijbehorende uitdagingen te overwinnen en daarom veel gebruikt door de onderzoekers voor cfDNA-fragmentgrootteanalyse. In dit protocol werd de fragmentgrootteverdeling van geïsoleerde cfDNA geschat met behulp van een geautomatiseerd capillair elektroforese-instrument (zie Tabel met materialen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voorafgaand aan de bloedafname is geïnformeerde toestemming vereist van proefpersonen die deelnemen aan het onderzoek en moeten deze worden verkregen. Het in dit manuscript beschreven onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met en naleving van het Rabin Medical Center, Israël ethic committee (ethische code: 0039-17-RMC) en de Faculteit Geneeskunde Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Duitsland ethic committee (ethische code: D 405/14).

1. Bloedmonsterverzameling en -opslag in cfDNA- of cfRNA-conserveermiddelen

  1. Label de conserveringsbuizen op de juiste manier
  2. Verzamel ~8 ml bloed in de cf-DNA conserveringsbuis (zie Tabel met materialen),met behulp van een bloedafnameset en een houder, volgens het standaard institutionele protocol voor venipunctuur zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Het gebruik van een bloedafnameset kan een mogelijke terugstroming van het bloed uit de buis voorkomen.
    1. Lijn de patiënt uit met de arm in een neerwaartse positie.
    2. Houd de buis rechtop, met de dop naar boven gericht, terwijl u ervoor zorgt dat de inhoud van de buis de dop of naaldpunt niet raakt.
    3. Als er bloed in de buis stroomt, laat je het tourniquet langzaam los.
  3. Onmiddellijk nadat de buis is gevuld met bloed (maximale capaciteit: 8,4 ml volbloed), keert u de buis voorzichtig om (draai de pols van de arm die de buis 180° naar beneden en naar achteren houdt) 5 keer om het monster te stabiliseren.
    OPMERKING: Inversie zorgt ervoor dat het conserveermiddel gelijkmatig met het monster wordt gemengd. Schud de inhoud echter niet opnieuw, zelfs niet vóór plasmapreparaat. Onvoldoende vermenging van conserveermiddelen met het bloedmonster leidt tot destabilisatie van de inhoud en de vorming van microstolsels of hemolyse. In dit stadium kan het protocol onmiddellijk worden voortgezet, want plasmascheiding of met bloed gevulde buizen kunnen tot 30 dagen wachten bij omgevingstemperatuur (15-25 °C) en tot 8 dagen bij 37 °C.

2. Plasma en buffy vachtscheiding en opslag

  1. Centrifugeer de met bloed gevulde conserveringsbuis gedurende 425 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om plasma te scheiden.
    OPMERKING: De stappen 2.2 en 2.3 moeten in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd.
  2. Pipetteer de bovenste plasmalaag voorzichtig naar een verse buis in 1 ml aliquots, zonder de onderste lagen te verstoren.
  3. Breng de volgende laag buffy coat voorzichtig over naar een verse buis (de laag verschijnt als een ring boven de RBC-pellets), terwijl RBCs in de onderste laag worden vermeden.
  4. Ga verder met stap 3 met plasma en stap 4 met de buffy coat. Bewaar indien nodig de gescheiden inhoud op -80 °C.

3. Zuivering van circulerende cfDNA uit 1 ml plasma

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met een commerciële kit (zie Tabel met materialen). Alle buffers zijn voorzien van de kit.

  1. Bereiding van buffers en reagentia
    LET OP: Voeg geen zure oplossingen of bleekmiddel rechtstreeks toe aan het monsterbereidingsafval. Guanidinezouten aanwezig in Lysis buffer, Binding buffer, en Wash Buffer-1 in combinatie met bleekmiddel of zuren kunnen zeer reactieve verbindingen produceren.
    1. Bindingsbuffer: Meng 300 ml bindbufferconcentraat met 200 ml 100% isopropanol om 500 ml werkende bindingsbuffer te maken. Bewaren bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Bindingsbuffer maakt de optimale binding van de circulerende nucleïnezuren aan het silicamembraan mogelijk. 500 ml van de bindingsbuffer is voldoende voor de verwerking van 276, 138, 92, 69 of 55 monsters van respectievelijk 1, 2, 3, 4 of 5 ml plasma en is 1 jaar stabiel bij kamertemperatuur.
    2. Wash Buffer-1: Meng 19 ml Wash Buffer-1 concentraat met 25 ml 96-100% ethanol om 44 ml werkende Wash Buffer-1 te maken. Bewaren bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Wash Buffer-1 elimineert de verontreinigingen die aan het silicamembraan zijn gebonden. 44 ml werkende Wash Buffer-1 is voldoende voor de verwerking van 73 monsters van 1/2/3/4/5 ml plasma en is 1 jaar stabiel bij kamertemperatuur.
    3. Wash Buffer-2: Meng goed 13 ml Wash Buffer-2 concentraat met 30 ml 96-100% ethanol om 43 ml werkende Wash Buffer-2 te maken. Bewaren bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Wash Buffer-2 elimineert de verontreinigingen die aan het silicamembraan zijn gebonden. 43 ml werkende Wash Buffer-2 is voldoende voor het verwerken van ~ 56 monsters van 1/2/3/4/5 ml plasma en is stabiel gedurende 1 jaar bij kamertemperatuur.
    4. Voeg aan een buis met 310 μg lyophilized carrier RNA 1.550 μL Elution buffer toe om een drager RNA-oplossing van 0,2 μg/μL voor te bereiden. Nadat u het drager-RNA grondig hebt opgelost, verdeelt u de oplossing in geschikte aliquots en bewaart u deze bij –30 °C tot –15 °C. Vries deze aliquots niet meer dan 3 keer in. Voeg aan de Lysis-buffer, zoals weergegeven in tabel S1,de gereconstitueerde drager RNA toe die is opgelost in de Elution-buffer.
      OPMERKING: Omdat drager RNA niet direct oplost in Lysis buffer, moet het eerst worden opgelost in een Elution buffer en vervolgens in Lysis Buffer. Ten eerste wordt de binding van silicamembraan-nucleïnezuren versterkt wanneer er zeer weinig doelmoleculen in het monster aanwezig zijn. Ten tweede wordt het risico op RNA-degradatie verminderd door de aanwezigheid van grote hoeveelheden drager RNA.
  2. Voordat u met de isolatie begint, brengt u de kolommen en monsters op kamertemperatuur en past u de monstervolumes indien nodig aan op 1 ml met steriele fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS). Verwarm 2 waterbaden of verwarmingsblokken die respectievelijk 50 ml centrifugebuizen en 2 ml opvangbuizen bevatten tot respectievelijk 60 °C en 56 °C.
  3. Voeg aan een centrifugebuis van 50 ml 100 μL Proteinase K, 1 ml plasma en 0,8 ml Lysis-buffer toe met 1,0 μg drager RNA (bereid in stap 3.1.4). Sluit de centrifugebuis met een dop en meng de inhoud door 30 s puls-vortexing, terwijl u zorgt voor een zichtbare vortex in de buis. Een grondige menging van de inhoud is belangrijk voor een efficiënte lysis.
    OPMERKING: Ga onmiddellijk na het vortexen onmiddellijk verder met stap 3.4.
  4. Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij 60 °C.
  5. Verwijder de dop, voeg 1,8 ml van de bindingsbuffer toe aan de buis en meng grondig met pulskolk gedurende 15-30 s na het plaatsen van de dop.
  6. Incubeer het resulterende mengsel gedurende 5 minuten op ijs en steek de silicamembraankolom in het vacuümapparaat dat op de vacuümpomp is aangesloten. Plaats vervolgens stevig een 20 ml buisverleng in de open kolom om monsterlekkage te voorkomen.
  7. Giet het geïncubeerde mengsel voorzichtig in de buisverlenging van de kolom en schakel de vacuümpomp in. Nadat al het lysaatmengsel volledig door de kolommen loopt, schakelt u de vacuümpomp uit, laat u de druk op 0 mbar los en verwijdert en gooit u de buisverlenging weg.
    OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, moet de buisverlengende drager zorgvuldig worden weggegooid om verspreiding over aangrenzende kolommen te voorkomen.
  8. Verwijder de kolom van het vacuümapparaat, steek in de opvangbuis en centrifugeer op 11.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur, om eventuele resterende lysaat te verwijderen. Gooi de doorstroming weg.
  9. Voeg 600 μL Wash Buffer-1 toe aan de kolom, centrifugeer op 11.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, gooi de doorstroom weg.
  10. Voeg 750 μL Wash Buffer-2 toe aan de kolom, centrifugeer gedurende 1 minuut op 11.000 x g bij kamertemperatuur en gooi de doorstroom weg.
  11. Voeg 750 μL ethanol toe (96–100%) naar de kolom, centrifugeren bij 11.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en de doorstroom weggooien.
  12. Centrifugeer de kolom op 20.000 x g gedurende 3 minuten, door deze in een schone opvangbuis van 2 ml te plaatsen.
  13. Droog de membraankolom volledig door deze in een nieuwe 2 ml opvangbuis te plaatsen met het deksel open en gedurende 10 minuten te broeden bij 56 °C.
  14. Plaats de kolom in een schone elutiebuis van 1,5 ml. Breng in het midden van het kolommembraan 20-150 μL elutiebuffer aan en broed gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur met het deksel gesloten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de elutiebuffer in evenwicht is met kamertemperatuur. Bij gebruik van een elutiebuffer van minder dan 50 μL moet u ervoor zorgen dat deze voorzichtig op het midden van het membraan wordt afgegeven. Dit helpt bij de volledige elutie van het gebonden DNA. Het elutievolume is echter niet vast en kan worden gewijzigd volgens de downstreamtoepassingen. Het teruggewonnen eluaat kan tot 5 μL zijn en zeker minder dan het elutievolume dat op de kolom wordt toegepast.
  15. Centrifugeer het teruggewonnen eluaat in een microcentrifuge bij 20.000 x g gedurende 1 minuut om de nucleïnezuren te eluteeren en op te slaan bij -20 °C.

4. Zuivering van genomisch DNA van buffy coat

OPMERKING: Commerciële kit die in dit protocol wordt gebruikt, wordt vermeld in de tabel met materialen. Buffers en reagentia genoemd in het onderstaande protocol, d.w.z. Lysis buffer A, Lysis buffer B, Wash buffer X, Wash Buffer Y, Proteinase Buffer, Elution buffer en Proteinase K maken deel uit van deze commerciële kit.

  1. Bereiding van de buffers en reagentia
    LET OP: Voeg geen zure oplossingen of bleekmiddel rechtstreeks toe aan het monsterbereidingsafval. Guanidinezouten aanwezig in Lysis buffer B en Wash buffer X in combinatie met bleekmiddel of zuren, kunnen zeer reactieve verbindingen produceren.
    1. Wash Buffer Y: Meng goed 12 ml Wash Buffer Y concentraat met 48 ml ethanol (96–100%) om 60 ml werkende wasbuffer te verkrijgen Y. Bewaren bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: 60 ml werkende Wash Buffer Y is voldoende voor het verwerken van 100 buffy vachtmonsters en is stabiel voor 1 jaar.
    2. Proteinase K: Bereid Proteinase K-oplossing door 30 mg gelyophiliseerde Proteinase K op te lossen in 1,35 ml Proteinase Buffer.
      OPMERKING: De totale werkoplossing van Proteinase K is voldoende voor de verwerking van 52 buffy coat monsters. Proteinase K werkoplossing kan minstens 6 maanden worden bewaard bij -20 °C.
  2. Stappen vóór de inleiding van de procedure
    1. Evenwicht van de buffy vacht op kamertemperatuur.
    2. Stel het warmteblok of het waterbad in op 56 °C.
  3. Hang buffy coat in Lysis buffer A om een eindvolume van 200 μL te verkrijgen. Voeg vervolgens 25 μL Proteinase K-oplossing en 200 μL Lysis-buffer B toe. Meng door te vortexen en incuberen bij 70 °C gedurende 10-15 min. Zorg ervoor dat de monsters volledig bedekt zijn met de lyseoplossing.
    OPMERKING: Voor het verwerken van reeksen monsters kunnen Proteinase K en Lysis buffer A 10-15 minuten voor de procedure worden voorgemengd, maar niet langer daarvoor, omdat Proteinase K zichzelf verteert in Lysis buffer A zonder substraat.
  4. Voeg 210 μL 96-100% ethanol toe aan bovenstaand mengsel en vortex krachtig.
    OPMERKING: De toevoeging van ethanol kan een snaarachtig neerslag vormen; dit heeft echter geen invloed op de DNA-isolatie. Zorg ervoor dat u het neerslag ook op de kolom laadt, zoals in de volgende stappen wordt weergegeven.
  5. Plaats het hele monster op de silicakolom die in een opvangbuis is geplaatst. Centrifugeer gedurende 1 min bij 11.000 x g. Plaats de kolom in een nieuwe opvangbuis en gooi de vorige buis samen met doorstroom weg.
    OPMERKING: Herhaal de centrifugeerstap als het monster niet volledig door de matrix wordt getrokken.
  6. Voeg 500 μL Wash buffer X toe, centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11.000 x g en gooi de doorstroom weg.
  7. Plaats de kolom in de opvangbuis, voeg 600 μL washbuffer Y toe aan de kolom, centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11.000 x g en gooi de doorstroom weg.
  8. Plaats nogmaals de kolom in de opvangbuis en centrifugeer de kolom gedurende 1 minuut bij 20.000 x g om het silicamembraan te drogen.
  9. Incubeer de kolom bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut, plaats in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg vervolgens 100 μL el ellutionbuffer toe. Eluteer vervolgens het DNA door 1 min bij 11.000 x g te centrifugeren en op te slaan bij -20 °C.

5. Kwantificering van cfDNA en genomisch DNA met behulp van fluorometer

  1. Voordat u het protocol start, voert u de volgende stappen uit.
    1. Verdun 2 μL geëuteerd genomisch DNA (vanaf stap 4.9) in 1:10 verhoudingen met ultrapure nucleasevrij water. Verdun cfDNA-monsters uit stap 3.15 niet vanwege verwachte lage concentraties.
    2. Evenwicht van de assay Standaard #1 en assay Standaard #2 op kamertemperatuur.
  2. Bereid in totaal 6 dunwandige heldere buizen van 0,5 ml groot.
    OPMERKING: Het gepresenteerde protocol is voor kwantificering van 2 cfDNA en 2 genomische DNA-monsters, daarom 4 buizen voor 4 monsters en deze test vereist 2 normen.
  3. Label de deksels van de buis.
    OPMERKING: Etikettering aan de zijkant van de buis kan de aflezing verstoren. Bovendien worden de standaardbuizen zorgvuldig geëtiketteerd, omdat kalibratie van de fluorometer vereist dat de normen in de juiste volgorde zijn.
  4. Verdun het assay-reagens in 1:200 met de Assay-buffer om de werkoplossing voor te bereiden. Gebruik voor 4 monsters en 2 normen 6 μL testreagens plus 1.194 μL assaybuffer om 1.200 μL (200 μL in elke buis) werkoplossing te maken.
    OPMERKING: Gebruik geen glazen container, maar gebruik een schone plastic buis. Elke buis moet ongeveer 200 μL van het uiteindelijke volume bevatten (een teststandaardbuis moet 190 μL van de werkoplossing bevatten en de monsterbuis moet 180-199 μL van de werkoplossing bevatten). Er moet voldoende werkoplossing worden bereid om aan alle testnormen en monsters te voldoen.
  5. Voeg in de standaardbuizen voor werktests 190 μL werkoplossing en 10 μL teststandaard toe en meng de oplossing door vortexing gedurende 2-3 s. Vermijd de vorming van bubbels in de oplossing.
  6. Voeg in de monsterbuizen 198 μL werkoplossing en 2 μL cfDNA of genomisch DNA toe. Meng de oplossing door 2-3 s te vortexen en bewaar deze 2 minuten op kamertemperatuur.
  7. Druk in het scherm 'Home' van het fluorometer-instrument op 'DNA' en selecteer 'dsDNA High Sensitivity Assay', om het scherm 'Standaarden' weer te geven en druk vervolgens op 'Ja' op het scherm fluorometer 'Standaarden' om de normen te lezen.
  8. Plaats in de monsterkamer de teststandaard #1 buis, sluit het deksel en druk op 'Lezen'. Verwijder de buis zodra de meting is voltooid (ongeveer 3 s) en herhaal dezelfde stap voor Standaard #2.
  9. Na afloop van het kalibratieproces wordt een voorbeeldscherm weergegeven, vervolgens een monsterbuis invoegen en stap '5.8' herhalen. Het "monsterscherm" geeft dan een waarde weer die overeenkomt met de concentratie van het monster na verdunning in de monsterbuis.
  10. Herhaal voor elk monster stap "5.9", totdat alle monsters zijn gelezen.
  11. Gebruik de volgende vergelijking om de werkelijke concentratie van het monster te berekenen.
    Equation 1
    OPMERKING: De testwaarden zijn in ng/ml en komen overeen met de concentratie na verdunning in de testbuis. Vergelijking vermeld in bovenstaande stap 5.11, QF-waarde is de waarde die wordt gegeven door het fluorometer-instrument, en x is het aantal microliters monster dat aan de testbuis is toegevoegd. De eenheden voor QF-waarden die door de vergelijking worden gegenereerd, zijn vergelijkbaar met de waarde die door de fluorometer wordt geleverd. Als de waarde van de fluorometer bijvoorbeeld in ng/ml ligt, zijn de eenheden voor de concentratie berekend door de vergelijking ng/ml.

6. DNA fragment grootte verdeling van cfDNA door fragment analyzer

  1. De stap voor het starten van de procedure: Evenwicht het DNA-kleurstofconcentraat en de DNA-gelmatrix gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
  2. Bereiding van de gel-dye mix
    LET OP: Ga voorzichtig om met oplossingen, aangezien DMSO bekend staat om de binnenkomst van organische moleculen in weefsels te vergemakkelijken.
    1. Ontdooi de DMSO grondig door de DNA-kleurstofconcentraatflacon gedurende 10 s te vortexen. Pipetteer 15 μL van dit concentraat in een DNA-gelmatrixflacon en bewaar bij 4 °C in het donker.
    2. Nogmaals, vortex de afgetopte flacon gedurende 10 s totdat het mengen van de gel en kleurstof wordt gevisualiseerd.
    3. Giet de mix op een spinfilter naar de bovenste recipiënt.
    4. Microcentrifugeer het spinfilter op 2.240 x g ± 20% gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Label de bereide gelkleurstof in de buis en gooi het filter weg, volgens goede laboratoriumpraktijken. Label de buis en noteer de voorbereidingsdatum.
      OPMERKING: Gooi het filtraat weg volgens goede laboratoriumpraktijken. De gel-dye mix kan worden gebruikt voor 5 High Sensitivity (HS) DNA chips. Indien niet gebruikt voor meer dan 1 uur, bewaren bij 4 °C. Bewaren in het donker is mogelijk tot 6 weken.
  3. Om de gelkleurstofmix te laden, moet u de positie van de basisplaat van het spaanaanzuigstation garanderen en de clip op de laagste positie instellen.
    1. Breng de gelkleurstofmix gedurende 30 minuten in evenwicht op kamertemperatuur en houd de blootstelling aan licht in de gaten.
    2. Neem een nieuwe HS DNA-chip uit een verzegelde zak en plaats deze op het chipaanzuigstation, verwijder vervolgens 9,0 μL van de gelkleurstofmix en doseer deze aan de onderkant van de chipput, gemarkeerd als 'G'.
      OPMERKING: Trek de gelkleurstofmix op en vermijd deeltjes die zich aan de onderkant van de flacon kunnen ophopen. Terwijl u de gelkleurstofmix goed in de HS DNA-chip doseert, plaatst u de punt van de pipet volledig, om de vorming van grote luchtbellen te voorkomen. Bovendien zal het aanraken van de pipet aan de randen van de put slechte resultaten opleveren.
    3. Plaats de zuiger op 1 ml en sluit het chipaanzuigstation. Zorg ervoor dat het slot van de vergrendeling klikt en stel de timer in op 60 s, druk vervolgens de zuiger naar beneden totdat deze door de clip wordt vastgehouden en laat precies na 60 s de zuiger los met het clip-release mechanisme.
    4. Wanneer de zuiger zich ten minste terugtrekt naar de 0,3 ml-markering, wacht u 5 s en trekt u zich langzaam terug naar de 1 ml-positie, opent u vervolgens het chipaanzuigstation en verwijdert u opnieuw 9,0 μL van de gel-kleurstofmix en doseert u aan de onderkant van de HS DNA-chip goed, gemarkeerd als 'G'.
  4. Om de DNA-marker te laden, doseer je 5 μL van de DNA-marker in de put, gemarkeerd met het laddersymbool. Herhaal de procedure voor alle 11 monsterputten.
  5. Om de ladder en monsters te laden, doseert u 1 μL van de DNA-ladder in de put, gemarkeerd met het laddersymbool en voegt u vervolgens 1 μL monster (gebruikte putten) of 1 μL marker (ongebruikte putten) toe aan alle 11 monsterputten.
  6. Vortex de HS DNA-chip voor 60 s bij 2.400 tpm door de chip horizontaal in de adapter te plaatsen. Zorg ervoor dat de uitstulping die de HS DNA-chip bevestigt, niet wordt beschadigd tijdens het vortexen.
  7. Om de HS DNA-chip in het fragmentanalysatorinstrument te plaatsen, opent u het deksel en zorgt u ervoor dat de elektrodecartridge correct is geplaatst en wordt de chipkiezer geplaatst op 'dsHigh Sensitivity DNA' in het fragmentanalysatorinstrument.
  8. Monteer de HS DNA-chip voorzichtig in de recipiënt, die slechts op één manier past, en verlies vervolgens het deksel door ervoor te zorgen dat de elektrodecartridge precies in de putten van de HS DNA-chip past.
  9. Het display op het softwarescherm van de fragmentanalysator geeft de geplaatste HS DNA-chip en het gesloten deksel aan, via het chippictogram linksboven in het scherm.
  10. Om de HS DNA-chiprun te starten, selecteert u de dsDNA High Sensitivity Assay in het menu 'Assay' op het instrumentenscherm en vult u vervolgens de tabel met voorbeeldnamen correct in door informatie zoals voorbeeldnamen en opmerkingen te voeden en start u de chiprun door rechtsboven in het scherm op de knop'Start' te klikken.
  11. Elektrodereiniging na een HS DNA-chiprun: Verwijder onmiddellijk de gebruikte HS DNA-chip, zodra de test is voltooid en gooi deze weg volgens goede laboratoriumpraktijken. Voer de volgende procedure uit om ervoor te zorgen dat de elektroden schoon zijn, zonder restresten van de vorige test.
    1. Vul langzaam 350 μL gedeïoniseerd water van analysekwaliteit in een van de elektrodereinigerputten en plaats de elektrodereiniger in het fragmentanalysatorinstrument door het deksel te openen en sluit vervolgens het deksel en wacht ongeveer 10 s.
    2. Verwijder de elektrodereiniger door het deksel te openen en wacht nog 10 s tot het water op de elektroden verdampt voordat u het deksel sluit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Plasmascheiding
8,5-9 ml bloed verzameld in cfDNA of cfRNA conserveermiddel buizen levert ongeveer ~4 ml plasma in volume. Het volume plasma gescheiden van bloed verzameld in EDTA-buizen kan variëren afhankelijk van de temperatuur. Blootstelling van EDTA-buizen die bloed bevatten bij een temperatuur hoger dan 37 °C leidt tot een verminderde plasmavolumeopbrengst44.

Fluorometer Assay Resultaten
cfDNA-concentratie in 1 ml plasma van elk van de glioompatiënten #1 en #3 en gezonde controles #H1, #H2 en #H3 waren respectievelijk 137 ng, 12,6 ng, 6,52 ng, 2,26 ng en 2,48 ng. Bij glioompatiënten was #2 cfDNA-concentratie echter te laag om in een fluorometer te worden gedetecteerd. cfDNA-concentratie in het 1 ml plasma van een kankerpatiënt varieert van 0,5 tot >1000 ng18, met een gemiddelde waarde van 20 ng. Bij gezonde personen varieert de cfDNA-concentratie van een niet-detecteerbare concentratie tot 16 ng, met een gemiddelde waarde van 8 ng45. Genoom-DNA geïsoleerd uit 200 μL buffy coat (PBMC's) levert ongeveer 25- 50 μg DNA op.

Dna-fragmentanalysator testresultaten
Volgens een eerdere studie is cfDNA verrijkt in 166 bp lange fragmenten, die goed zijn voor ~ 85% van de totale cfDNA in het plasma van een patiënt. Daarentegen zijn 332 bp lange fragmenten goed voor 10% en 498 bp lange fragmenten zijn goed voor 5% van cfDNA46. Twee belangrijke factoren die van invloed zijn op de resultaten van de cfDNA fragment analyzer assay zijn genomische DNA-besmetting door PBMC's en een lage concentratie cfDNA. Figuur 1 toont de verwachte cfDNA bioanalyzer grafiek van glioompatiënt #1, waarin cfDNA-fragmenten worden verrijkt met 166 bp en er geen genomische DNA-besmetting in het monster21is . Figuur 2 toont de fragmentverrijkingsgrafiek na de NGS-bibliotheekvoorbereiding van de cfDNA van glioompatiënt #1 en fragmentverrijking wordt verschoven van 166 bp naar 291 bp, vanwege de bevestiging van 125 bp-indexen en adapters eraan. Figuur 3 toont een zeer lichte verrijking van de cfDNA-fragmenten van glioompatiënten #2. Ondanks de lage cfDNA-concentratie bij glioompatiënten #2, leidt de toevoeging van NGS-adapters aan de cfDNA- en PCR-versterkingsstappen tot de zichtbare cfDNA-bibliotheekpiek op de fragmentverrijkingsgrafiek figuur 4. Daarom werd de bibliotheek met succes voorbereid uit dit lage concentratie cfDNA-monster, zoals weergegeven in figuur 4. In figuur 5blijkt dat de cfDNA-fragmenten van glioompatiënten #3 in de buurt van 166 bp pieken, maar genomische DNA-besmetting is ook zichtbaar in de buurt van de referentieladderpiek van 10380 bp.

Figure 1
Figuur 1: Een ideale cfDNA fragment analyzer assay grafiek van glioma monster #1 cfDNA. Een belangrijke piek werd waargenomen bij 166 bp en een kleinere piek werd waargenomen bij 332 bp. Er was geen genomische besmetting te zien in dit monster, dat zich voordoet in de buurt van de bovenste marker van 10.380 bp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Een ideale cfDNA fragment analyzer assay grafiek van glioma monster #1 cfDNA bibliotheek. Na het ligaten van 125 bp next-generation sequencing bibliotheekadapters vertoonden 166 bp en 332 bp cfDNA fragmenten een grote piek bij respectievelijk 291 bp en een kleinere piek bij 457 bp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: cfDNA fragment analyzer assay grafiek van glioma monster #2 cfDNA, met een zeer kleine piek bij 166 bp. Door de lage concentratie cfDNA was de piek bij 166 bp nauwelijks zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: cfDNA fragment analyzer assay grafiek van cfDNA bibliotheek van glioma monster #2. Na het ligaten van 125 bp next-generation sequencing bibliotheekadapters en het uitvoeren van PCR-cycli tijdens de voorbereiding van de bibliotheek, was de nauwelijks zichtbare cfDNA-piek bij 166 bp of volledig onzichtbare pieken bij 332 bp en 498 bp duidelijk zichtbaar. Een belangrijke piek was aanwezig dicht bij 291 bp en een kleinere piek bij 457 bp, 623 bp, 789 bp en dichtbij 2.500 bp werden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: cfDNA fragment analyzer assay met genomische DNA-besmetting in glioommonster #3 cfDNA. Een kleine piek bij 166 bp wees op de aanwezigheid van cfDNA en verrijking in de buurt van de bovenste marker (10.380 bp) was genomische DNA-besmetting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel S1: Volumes van de lysisbuffer en drager RNA (opgelost in Buffer AVE) die nodig zijn voor de verwerking van 1 ml plasmamonsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het verzamelen van bloed van een patiënt in een buis, verzending en opslag zijn cruciale eerste stappen in vloeibare biopsie. Onjuiste behandeling kan de kwaliteit van het plasma aantasten en kan daarom de resultaten van de vloeibare biopsieverstoren 47. Als een bloedmonster wordt verzameld in een EDTA-bloedbuis, moet het plasma binnen twee uur na de bloedafname worden gescheiden om lyse van WBC's te voorkomen en het genomische DNA in het plasma vrij te geven48. WBC's kunnen ook apoptose ondergaan in een EDTA-buis als ze langer worden bewaard, en de resulterende cfDNA-fragmenten kunnen originele cfDNA in het plasmabesmetten 48. Blootstelling van een bloedmonster aan een hoge temperatuur (>37 °C) of overmatig schudden van de buis voordat plasmascheiding hemolyse veroorzaakt. Het hemoglobine dat bijgevolg als verontreiniging in plasma blijft, beïnvloedt de downstreamprocessen van cfDNA, zoals tijdens bibliotheekbereiding49. Hoge temperatuur (>37 °C) beïnvloedt ook de opbrengst van plasma in een EDTA-bloedbuis. Daarom is een snelle scheiding van plasma na het verzamelen ervan in een EDTA-buis50 een belangrijke stap in de kwaliteitscontrole van de methode. Als bloed wordt verzameld in commerciële cfDNA of cfRNA Preservation Tube, moet de conserveermiddelstof onmiddellijk na de bloedafname met het bloed worden gemengd40. Het niet goed mengen van de conserveermiddelstof leidt tot de vorming van microdoeken in het plasma. Deze verstoppen de silicamembranen in een kolom tijdens het cfDNA-extractieproces en verlagen de opbrengst van cfDNA. Matig schudden van bloed in de buis veroorzaakt geen hemolyse; hoewel overmatig schudden hemolyse kan veroorzaken, zelfs in deze buizen40. Daarom moet tijdens het verzenden of hanteren van deze buizen overmatig schudden worden vermeden. Bloedbuizen worden aanbevolen om rechtop te worden verzonden.

De nauwkeurige kwantificering en beoordeling van de cfDNA-concentratie per eenheidsplasma is een belangrijke stap in de vloeibare biopsie, aangezien de plasma cfDNA-concentratie rechtstreeks geassocieerd is met fysiologische en pathologische processen51. De cfDNA-concentratie is hoger bij patiënten met kanker dan bij gezonde proefpersonen52. Verhoogde cfDNA-concentratie in menselijk bloed is niet specifiek voor kanker; zwangere vrouwen en patiënten die transplantaties krijgen, hebben ook de neiging om verhoogde cfDNA-concentraties in hun bloed te hebben21. Associaties zijn ook aangetoond voor ontsteking, weefseltrauma, diabetes, myocardinfarct en sepsis met een verhoogd niveau van cfDNA-concentratie53. De concentratie plasma cfDNA bij kankerpatiënten in een vroeg stadium is meestal lager dan bij patiënten met gevorderde of gemetastaseerde tumoren. Dit ondersteunt een directe associatie van cfDNA met een tumorlast54. De cfDNA-concentratie in het bloed varieert aanzienlijk tussen 0,5 en >1000 ng/ml bij kankerpatiënten en tussen 0 en 100 ng/ml bij gezonde proefpersonen18. Voor de bibliotheekvoorbereiding is minimaal 0,5 ng cfDNA vereist. Om de minimale vraaghoeveelheid cfDNA voor sequencing te bereiken, kan men beginnen met een minimum van 2 ml van een bloedmonster of 1 ml plasmamonster. Bovendien verminderen technische fouten tijdens de plasma cfDNA-extractie ook de cfDNA-opbrengst en de resulterende concentratie, waardoor wordt afgeweken van de werkelijke plasma cfDNA-concentratie. cfDNA-afbraak kan optreden als gevolg van anticoagulantia in EDTA-buizen of als gevolg van het proces van meervoudig ontdooien en invriezen van plasmamonsters. Een slechte activiteit van proteinase K tijdens het lyseproces resulteert ook in een lage opbrengst van cfDNA. De activiteit van Proteinase K neemt af als gevolg van de langdurige blootstelling aan hoge temperaturen. Het gebruik van lage concentratie ethanol in plaats van 96-100% tijdens de cfDNA extractie wasstap veroorzaakt ook een lage opbrengst van cfDNA. Daarom is het vermijden van technische fouten in de vloeibare biopsietechniek belangrijk voor het bereiken van nauwkeurige en betrouwbare resultaten.

Kwalitatieve analyse van cfDNA is een centrale stap, waarbij de daadwerkelijke verdeling van DNA-fragmenten in het geëxtraheerde cfDNA-monster wordt geschat. Kwantitatieve resultaten van cfDNA zijn pas betrouwbaar na bevestiging van de zuiverheid ervan door kwalitatieve analyse. Daarom toont een ideale grafiek van cfDNA gegenereerd in de DNA-fragmentanalysatortest verrijking van de belangrijkste piek van cfDNA-fragmenten in de buurt van 166 bp en een kleinere piek in de buurt van 332 bp lengte. Dit geeft aan dat het geëxtraheerde cfDNA-monster niet is besmet met genomisch DNA van WBC's. Als een fragment wordt verrijkt van 7.000 bp tot de referentieladder (10.380bp) en verder, duidt dit op besmetting van een cfDNA-monster met WBC-genomisch DNA. Als genomische DNA-besmetting wordt gezien in een cfDNA-monster na dna-fragmentgrootteschattingstest, kan het monster worden uitgevoerd op 2% agarosegel met een ladder van 100 bp, en kan gel worden verwijderd tussen het bereik ~ 150-200 bp, gevolgd door een gelextractietest. Enige hoeveelheid cfDNA gaat verloren tijdens het agarose gel size selectieproces. De voorbereidingsstap van de NGS-bibliotheek vereist echter minimaal 0,5 ng en maximaal 1.000 ng invoer-DNA-materiaal om bibliotheken voor te bereiden op sequencing. Daarom, als de totale hoeveelheid cfDNA gelijk is aan of groter is dan 0,5 ng, is het voldoende hoeveelheid voor de voorbereidingsstap van de bibliotheek. Bovendien passeren dergelijke monsters het bibliotheekvoorbereidingsproces met succes en toont de resulterende bibliotheek een grote piek van bijna 291 bp en een kleinere piek bij 457 bp, vanwege de toevoeging van 125 bp-indexen en adapters.

De NGS-data-analyse is de laatste stap in de op NGS gebaseerde vloeibare biopsietechniek, en lijsten van mutaties en gengenfusies3,55,56,57 worden in deze stap gegenereerd. Mutaties en gengenfusies die worden geïdentificeerd , kunnen worden beoordeeld aan de hand van eerdere studies naar kankermutatielandschappen58,59, eerder gekarakteriseerde genmutaties60 of gengenfusies61,62,63. Deze kunnen dienen als prognostische64 en diagnostische7 biomarkers bij kankerpatiënten. De R132H-mutatie in het gen isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) is bijvoorbeeld een beslissende wegwijzer van secundaire glioblastoomkanker en onderscheidt deze ook van primair glioblastoom waarbij deze mutatie normaal gesproken afwezig is65. Bovendien wordt chronische myelogene leukemie (CML) gekenmerkt door een BCR/ABL1 genfusie als gevolg van een evenwichtige translocatie tussen chromosoom 9 en 2261. Het BCR/ABL1-gen en zijn mRNA- en fusie-eiwit zijn uniek voor CML-voorlopers en vormen daarom een goed doelwit voor therapie66.

Geavanceerde diagnose, de juiste fasering van de tumor en behandelingsmonitoring is een huidige strategie voor een efficiënte behandeling van kanker. Tot voor kort was weefselbiopsie de gouden standaard voor de histologische evaluatie van tumorweefsels. Maar na uitgebreid onderzoek op dit gebied en de komst van technologie, heeft het bewezen dat een enkele biopsie niet in staat is om het hele mutatielandschap van een tumor te bieden en dat seriële biopsieën meestal onpraktisch zijn om te worden uitgevoerd vanwege hun invasieve kenmerken, met name bij glioblastoom en lymfoom, waar biopsieën zeer invasief zijn. Bovendien wordt ongeveer 16% van de naaldbiopten geassocieerd met procedurelecomplicaties 67. Bovendien vereist hoogwaardige genomische profilering een voldoende hoeveelheid weefsel, een vraag die meestal niet wordt vervuld door de naaldbiopsie68.

De vloeibare biopsieën, van een routinebloedmonster door het analyseren van tumor-afgeleid DNA wordt gevonden om de routine naaldweefselbiopsieprocedures te vervangen of te vervangen12. Analyse van tumor-afgeleid DNA/cfDNA door plasma door vloeibare biopsie is een minimaal invasieve en effectieve procedure voor moleculaire profilering van tumoren. Het kan in wezen behandelingsmonitoring door seriële bemonstering in de loop van de tijd mogelijk maken zonder de potentiële risico's en complicaties die gewoonlijk gepaard gaan met traditionele tumorweefselbiopsie vanwege het invasieve karakter69. Bovendien vonden studies die de naaldbiopsie vergeleken met cfDNA-analyse door vloeibare biopsie van een enkele tumorlaesie dat cfDNA-profilering een volledige moleculaire heterogeniteit kan bieden dat een tumor kan worden ondergebracht door meerdere verschillende klonale populaties70.

Hoewel op plasma cfDNA gebaseerde diagnose veel voordelen heeft ten opzichte van biopsie van tumorweefsel, zijn er nog steeds enkele cruciale beperkingen die de toepasbaarheid ervan in de algemene klinische praktijk belemmeren. Beperkingen van cfDNA-gebaseerde vloeibare biopsiediagnose omvatten de hogere kosten van de algemene procedure, de behoefte aan hoogwaardig DNA en een toegewijde bio-informaticus voor de noodzaak van een uitgebreide gegevensanalyse71. Vanwege het probleem met gegevensbeheer in verband met cfDNA-analyse, stelt NGS ook problemen bij de onmiddellijke toepassing ervan in de kliniek. De uitdagingen van het gegevensbeheer dat NGS met zich meebrengt , zijn voornamelijk te wijten aan de moeilijkheid om onderscheid te maken tussen het intrinsieke achtergrondgeluid van diepe sequencing en de afwijkingen die verband houden met de tumor72. Ten slotte zijn zij, vanwege de onbeschikbaarheid van de klinische validiteits - en gebruiksgegevens voor de meeste vloeibare biopsietests, momenteel alleen beperkt tot de klinische studies en basisonderzoeken13.

De toekomstige ontwikkelingen in de vloeibare biopsietechniek worden verwacht door gecombineerde inspanningen van fundamenteel onderzoek op het gebied van biologie, fysiologie, moleculaire biologie, testtechnieken, statistische analyse voor gegevensbeheer en machine-learn-technologie73,74. Bovendien zijn er tal van klinische studies op basis van cfDNA biomarker evaluatie aan de gang, en hun resultaten zullen helpen de geldigheid van de techniek vast te stellen. Deze gecombineerde inspanningen zullen hopelijk het platform voor vloeibare biopsie opzetten door middel van cfDNA-analyse als een krachtig prognostisch, diagnostisch en behandelingsmonitoringsinstrument in de klinische oncologieomgeving binnen de komende vijf jaar70,75.

Tot slot biedt de op cfDNA gebaseerde vloeibare biopsie een veilige en niet-invasieve aanpak voor het identificeren van genomische biomarkers die nuttig zijn bij het beheer van kankerziekten. Om betrouwbare en nauwkeurige resultaten te bereiken, zijn echter met name gestandaardiseerde protocollen voor bloedafname, plasma/WBC-scheiding, cfDNA-extractie en cfDNA kwantitatieve en kwalitatieve analyse vereist74,75.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen de leden van het Laboratorium voor Kanker genomics en Biocomputing of Complex Diseases bedanken voor hun scherpe observationele input en hun deelname aan meerdere discussies in verschillende stadia van dit project. De financieringssteun omvat Israel Cancer Association (ICA-subsidie voor M.F-M 2017-2019) en Kamin-subsidie van Israel Innovation Authority (voor M.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578, (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1, (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48, (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30, (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18, (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22, (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57, (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37, (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11, (7), 950 (2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19, (10), 2877 (2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14, (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087 (2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1, (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463 (2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359, (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17, (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20, (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35, (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11, (11), 1656 (2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61, (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20, (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254, (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134, (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377, (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54, (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6, (1), 8839 (2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4, (4), 295 (2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4, (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2, (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19, (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1, (1), 96 (2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19, (6), 1610 (2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31, (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29, (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17, (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21, (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20, (3), 704 (2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2, (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9, (1), 12 (2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11, (11), 0166354 (2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7, (11), 47020 (2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8, (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4, (7), 00699 (2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20, (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8, (1), 7375 (2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23, (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11, (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7, (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775, (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411, (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45, (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47, (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155, (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21, (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28, (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22, (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17, (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18, (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6, (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31, (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84, (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19, (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63, (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579, (7800), 9 (2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579, (7800), 6-8 (2020).
Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter