कैंसर रोगियों के रक्त प्लाज्मा नमूनों में सेल मुक्त डीएनए का पता लगाना

Summary

इस पेपर में हम गैर-इनवेसिव लिक्विड बायोप्सी तकनीक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें रक्त संग्रह, प्लाज्मा और बफी कोट सेपरेशन, सीएफडीएनए और जर्मलाइन डीएनए निष्कर्षण, सीएफडीएनए या जर्मलाइन डीएनए का मात्राकरण, और सीएफडीएनए खंड संवर्धन विश्लेषण शामिल हैं।

Abstract

कैंसर रोगियों के ट्यूमर में म्यूटेशन की पहचान रोग प्रबंधन में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। ये उत्परिवर्तन ट्यूमर निदान के साथ-साथ उपचार चयन और कैंसर रोगियों में इसकी प्रतिक्रिया के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं। ट्यूमर म्यूटेशन का पता लगाने के लिए वर्तमान सोने के मानक विधि ट्यूमर बायोप्सी के माध्यम से ट्यूमर डीएनए का एक आनुवंशिक परीक्षण शामिल है । हालांकि, इस आक्रामक विधि को ट्यूमर उत्परिवर्तनीय प्रदर्शनों की सूची के अनुवर्ती परीक्षण के रूप में बार-बार किया जाना मुश्किल है। तरल बायोप्सी एक आसान उपयोग और गैर-इनवेसिव बायोप्सी दृष्टिकोण के रूप में ट्यूमर म्यूटेशन का पता लगाने के लिए एक नई और उभरती हुई तकनीक है।

कैंसर की कोशिकाएं तेजी से गुणा करती हैं। समानांतर में, कई कैंसर कोशिकाओं को एपोप्टोसिस से गुजरना पड़ता है। इन कोशिकाओं से मलबे एक मरीज के संचार प्रणाली में जारी कर रहे हैं, एक साथ पतले खंडित डीएनए टुकड़े के साथ, सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) टुकड़े कहा जाता है, जो ट्यूमर डीएनए उत्परिवर्तन ले । इसलिए, तरल बायोप्सी तकनीक का उपयोग करके सीएफडीएनए आधारित बायोमार्कर की पहचान करने के लिए, कैंसर रोगियों से रक्त के नमूने एकत्र किए जाते हैं, जिसके बाद प्लाज्मा और बफी कोट का पृथक्करण होता है। इसके बाद, प्लाज्मा को सीएफडीएनए के अलगाव के लिए संसाधित किया जाता है, और संबंधित बफी कोट को रोगी के जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए संसाधित किया जाता है। दोनों न्यूक्लिक एसिड के नमूनों को उनकी मात्रा और गुणवत्ता के लिए जांच की जाती है; और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) तकनीकों का उपयोग कर म्यूटेशन के लिए विश्लेषण किया ।

इस पांडुलिपि में, हम तरल बायोप्सी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें रक्त संग्रह, प्लाज्मा, और बफी कोट सेपरेशन, सीएफडीएनए और जर्मलाइन डीएनए निष्कर्षण, सीएफडीएनए या जर्मलाइन डीएनए का मात्राकरण, और सीएफडीएनए खंड संवर्धन विश्लेषण शामिल हैं।

Introduction

तकनीकी प्रगति के कारण सैकड़ों कैंसर जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम¹का अनुक्रमण हुआ है । इसने विभिन्न प्रकार ों में आणविक परिवर्तनों के परिदृश्य को समझने में योगदान दिया है². इन परिदृश्यों पर आगे के अध्ययनों ने अनुक्रमिक दैहिक परिवर्तन और जीन-जीन संलयन³ की विशेषता में मदद की है जो कैंसर या ट्यूमर प्रगति में शामिल हैं, जो क्रमिक रूप से एपोप्टोसिस^{पाथवे 4}को बाधित करके हैं। इसलिए, दैहिक उत्परिवर्तन और जीन-जीन संलयन एक विशेष ट्यूमर प्रकार⁵के लिए व्यक्तिगत रोगियों में बायोमार्कर के रूप में सेवा करके ट्यूमर के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, मौजूदा प्राथमिक ट्यूमर रोग का निदान⁶की पहचान, आणविक परिवर्तन⁷के आधार पर माध्यमिक ट्यूमर वर्गीकृत, और नशा ट्यूमर लक्ष्य की पहचान⁸। इस तरह की जानकारी कैंसर रोगियों के लिए व्यक्तिगत उपचार का चयन करने और सकारात्मक और नकारात्मक उपचार प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने में सुविधाजनक हो सकती है⁹. हालांकि, ट्यूमर ऊतक की जीनोमिक प्रोफाइलिंग की पहचान करने के लिए ट्यूमर सामग्री प्राप्त करना एक आक्रामक प्रक्रिया¹⁰है। इसके अलावा, एक ट्यूमर बायोप्सी में विषम ट्यूमर का केवल एक छोटा सा हिस्सा शामिल है; और, इसलिए, पूरे ट्यूमर¹¹के आणविक प्रोफ़ाइल के लिए प्रतिनिधि नहीं हो सकता है . सीरियल मॉनिटरिंग और ट्यूमर जेनोटीपिंग को ट्यूमर ऊतकों के बार-बार संग्रह की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर ट्यूमर बायोप्सी प्रक्रिया की आक्रामकता और ऐसी प्रक्रियाओं से उत्पन्न होने वाले सुरक्षा मुद्दों के कारण संभव नहीं होता है^12।

दूसरी ओर, तरल बायोप्सी तकनीक ने पिछले^{13, 14}दशक में सटीक ऑन्कोलॉजी में जबरदस्त ध्यान दिया है। यह मुख्य रूप से इस तकनीक की गैर-आक्रामकता के कारण है, और इसे कई समय बिंदुओं पर दोहराया जा रहा है, जिससे रोग^{पाठ्यक्रमों 15, 16}के लिए एक आसान उपयोग और सुरक्षित निगरानी तकनीक को सक्षम किया^जासकता है। तरल बायोप्सी एक घटना पर आधारित है जो ट्यूमर कोशिकाओं को तेजी से गुणा करती है, और साथ ही उनमें से कई एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस से गुजरते हैं। इससे मरीजों के रक्त में एपोटोटिक सेल मलबे की रिहाई होती है, साथ ही डीएनए के टुकड़े होते हैं जो एपोप्टोसिस¹⁷के दौरान सटीक आकार में काटे जाते हैं। गैर-कैंसर कोशिकाओं का एपोप्टोसिस भी रक्त में अपने सेलुलर मलबे को छोड़ने की ओर जाता है, हालांकि, इन कोशिकाओं में एपोप्टोसिस दर ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत बहुत कम है^18। तरल बायोप्सी तकनीक का तर्कसंगत डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और ट्यूमर कोशिकाओं^{14, 19} जैसे ट्यूमर से जुड़े अणुओं को कैप्चर करना है जो रक्त में लगातार प्रसारित होते हैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस), डिजिटल बूंद बहुलक चेन रिएक्शन (डीडीपीसीआर), रीयल-टाइम पीसीआर और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) सहित इन अणुओं के विश्लेषण के लिए विभिन्न तकनीकों²⁰ का उपयोग किया जा सकता है। तरल बायोप्सी तकनीक उन बायोमार्कर की पहचान करने में सक्षम बनाती है जो ट्यूमर कोशिकाओं की विशेषताएं हैं। ये बायोमार्कर अणु सिर्फ ट्यूमर के विशिष्ट हिस्सों से नहीं छोड़े जाते हैं, बल्कि ट्यूमर²¹के सभी हिस्सों से होते हैं। इसलिए, तरल बायोप्सी में पहचाने गए मार्कर शरीर में अन्य ट्यूमर के अलावा एक पूरे विषम ट्यूमर की आणविक प्रोफाइलिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस प्रकार, ऊतक बायोप्सी-आधारित तकनीक²²पर लाभ होते हैं।

सीएफडीएनए में कुछ मिनट से लेकर 1-2 घंटे²³तक के रक्त में एक छोटा आधा जीवन समय होता है । हालांकि, CFDNA के छोटे आधे जीवन समय उपचार प्रतिक्रिया और गतिशील ट्यूमर आकलन का मूल्यांकन करके वास्तविक समय विश्लेषण की सुविधा । ट्यूमर से व्युत्पन्न cfDNA स्तर ट्यूमर चरण के शकुन का संकेत/ इसके अलावा, अध्ययनों से साबित हो गया है कि सीएफडीएनए में मौजूदा ट्यूमर मार्कर²⁵की तुलना में बेहतर भविष्यवाणी क्षमता है । सीएफडीएनए का शकुन कैंसर के इलाज के बाद और भी अधिक स्पष्ट है, उपचार के बाद सीएफडीएनए का उच्च स्तर जीवित रहने की कम दर और उपचार के प्रतिरोध के साथ अच्छी तरह से संबंधित है। जबकि, चिकित्सा के बाद सीएफडीएनए का निचला स्तर आम तौर पर सकारात्मक उपचार प्रतिक्रिया से मेल खाता है। इसके अतिरिक्त, सीएफडीएनए पारंपरिक पहचान विधियों की तुलना में उपचार प्रतिक्रिया का जल्दी पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है।

सीएफडीएनए कैंसर से जुड़े म्यूटेशन का जल्दी पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है: प्रारंभिक चरण की बीमारी¹⁵के दौरान, लक्षणों की शुरुआत²⁶ और कैंसर निदान से पहले 2 साल²⁷तक । चूंकि सीएफडीएनए कई ट्यूमर क्षेत्रों या फोसी से जारी किया जाता है, इसका विश्लेषण ट्यूमर जीनोम का एक व्यापक दृश्य प्रदान करता है जो यह²⁸का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, सीएफडीएनए दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो ऊतक के नमूनों में²⁹को याद किया गया हो सकता है। के रूप में इंट्रा-ट्यूमर विषमता और उपकग्नल म्यूटेशन हजारों ठिकानों में फैले जीनोमिक क्षेत्रों के गहरे अनुक्रमण द्वारा पता लगाया जा सकता है, इसलिए सीएफडीएनए का विश्लेषण विशिष्ट जीनोमिक हस्ताक्षर¹³के साथ विशिष्ट आणविक उपप्रकारों को उजागर करने में सक्षम बनाता है। ऊतक नमूने के माध्यम से जानकारी के एक समान स्तर प्राप्त करने के लिए कई ठोस बायोप्सी की जरूरत होती ।

इसके अलावा, एक शल्य चिकित्सा उपचार और/ इसके अलावा, पेट, स्तन और फेफड़ों के कैंसर वाले रोगियों में, रक्त से सीएफडीएनए के विश्लेषण से ट्यूमर-विशिष्ट परिवर्तनों का सफलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है, जिसके कारण¹³महीने पहले कई महीनों की पुनरावृत्ति की सटीक भविष्यवाणी हुई। इसके अलावा, उपचार प्रतिरोध मार्कर, जैसे सीआरसी के साथ रोगियों में KRAS म्यूटेशन एंटी-ईजीएफआर थेरेपी³⁰प्राप्त करते हैं; विभिन्न उपचारों के साथ उपचार के बाद स्तन कैंसर वाले रोगियों में PIK3CA, MED1 या EGFR जैसे जीन के लिए VAFs³¹। और EGFR T790M फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में प्रतिरोध उत्परिवर्तन EGFR के साथ इलाज-लक्षित TKIs^३२ भी cfDNA विश्लेषण द्वारा पहचाना जा सकता है ।

संक्षेप में, सीएफडीएनए विश्लेषण का उपयोग ऑन्कोलॉजी^{13, 33}के क्षेत्र में सटीक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, 3 ग्लियोमा रोगियों और 3 स्वस्थ नियंत्रणों के रक्त नमूनों को डब्ल्यूबीसी और प्लाज्मा से सीएफडीएनए से जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए संसाधित किया गया था। ग्लियोमा कैंसर में, आईडीएच, टीईआरटी, एटीआरएक्स, ईजीएफआर और टीपी53 में उत्परिवर्तन एक नैदानिक के साथ-साथ शकुन मार्कर के रूप में कार्य करता है जो ग्लियोमा ट्यूमर के प्रारंभिक निदान में मदद कर सकते हैं, विभिन्न प्रकार के ग्लियोमा ट्यूमर को वर्गीकृत कर सकते हैं, व्यक्तिगत रोगी के लिए सटीक उपचार का मार्गदर्शन करते हैं और उपचार प्रतिक्रिया^{34, 35}को समझते हैं। इन जीनों की उत्परिवर्तनीय स्थिति की पहचान रक्त-व्युत्पन्न सीएफडीएनए का उपयोग करके की जा सकती है। इस पांडुलिपि में, हम प्लाज्मा-व्युत्पन्न सीएफडीएनए का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग ग्लियोमा कैंसर¹²में उत्परिवर्तनीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस लेख में समझाए गए इस तरह के सीएफडीएनए-आधारित तरल बायोप्सी प्रोटोकॉल का उपयोग कई अन्य प्रकार के कैंसर में उत्परिवर्तनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हाल ही में हुए एक अध्ययन से पता चला है कि सीएफडीएनए आधारित तरल बायोप्सी ५० विभिन्न प्रकार के कैंसर^३६का पता लगा सकती है ।

रक्त नमूना संग्रह, भंडारण और शिपमेंट इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं, क्योंकि इन चरणों के दौरान अनियंत्रित तापमान डब्ल्यूबीसी के लाइसिस का कारण बनता है, जिससे डब्ल्यूबीसी से प्लाज्मा में जीनोमिक डीएनए की रिहाई होती है और सीएफडीएनए नमूने का संदूषण होता है, जो बाकी प्रक्रिया³⁷को प्रभावित करता है। अनियंत्रित तापमान के कारण हीमोलिसिस सीएफडीएनए की डाउनस्ट्रीम नमूना तैयारी प्रक्रियाओं को ख़राब कर सकता है, जैसे पीसीआर चरण^38। सीरम में प्लाज्मा के बजाय जर्मलाइन सीएफडीएनए का एक उच्च अनुपात होता है, हालांकि यह ट्यूमर से जुड़े सीएफडीएनए³⁹के लिए एक बड़ी पृष्ठभूमि शोर प्रस्तुत करता है। इसलिए, ट्यूमर से जुड़े सीएफडीएनए को अलग करने के लिए, प्लाज्मा एक उपयुक्त नमूना³⁹है। रक्त संग्रह ट्यूब युक्त एक एंटी-स्कंदबंद में खींचा गया रक्त प्लाज्मा को अलग करने और सीएफडीएनए संदूषण से बचने के लिए तुरंत या दो घंटे के भीतर अपकेंद्रित्र किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, समर्पित वाणिज्यिक सीएफडीएनए संरक्षण रक्त संग्रह ट्यूबों का उपयोग किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें), जो रक्त संग्रह ट्यूबों वाले एंटीकोगुलैंट का विकल्प है। ये समर्पित रक्त संग्रह ट्यूब सीएफडीएनए और सीएफआरएनए को संरक्षित करते हैं, और परिवेश के तापमान पर 30 दिनों तक और 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 दिनों तक WBCs के लाइसिस को रोकता है। यह रक्त नमूना शिपमेंट के दौरान उचित तापमान को बनाए रखने में सुविधा प्रदान करता है और जब तक प्लाज्मा और डब्ल्यूबीसी⁴⁰अलग नहीं हो जाते ।

वर्तमान में उपलब्ध तीन प्रकार के सीएफडीएनए निष्कर्षण पद्धतियां हैं: चरण अलगाव, सिलिकॉन-झिल्ली आधारित स्पिन कॉलम, और चुंबकीय मनका-आधारित अलगाव^41। सिलिकॉन-झिल्ली आधारित स्पिन कॉलम विधि में अन्य सीएफडीएनए निष्कर्षण विधियों की तुलना में उच्च अखंडता के साथ सीएफडीएनए की उच्च मात्रा उत्पन्न^हुई।

डीएनए का मात्रात्मक मूल्यांकन तरल बायोप्सी में एक मौलिक आवश्यकता है, उनके आसान कार्यान्वयन और व्यापक उपयोग के लिए एक सरल, सस्ती और मानकीकृत प्रक्रिया विकसित करने की आवश्यकता है। सीएफडीएनए क्वांटिफिकेशन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तीन तरीके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक, फ्लोरोरमेट्रिक और क्यूपीसीआर हैं। फ्लोरिमेट्रिक विधि सटीकता, लागत और चालकता में आसानी⁴³से संबंधित अन्य तरीकों पर बेहतर साबित होती है।

सीएफडीएनए की अखंडता और शुद्धता का अनुमान या तो एगरॉग्रेस इलेक्ट्रोफोरेसिस या केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। एगरल्ड इलेक्ट्रोफोरेसिस न तो सीएफडीएनए की कम एकाग्रता पर संवेदनशीलता दिखाता है और न ही सीएफडीएनए के सटीक टुकड़े आकार को दिखाने के लिए उच्च संकल्प है। दूसरी ओर, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस से जुड़ी चुनौतियों पर काबू पाने के द्वारा एगरॉल्ड इलेक्ट्रोफोरेसिस पर एक लाभ है और इसलिए, व्यापक रूप से सीएफडीएनए टुकड़ा आकार विश्लेषण के लिए शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, एक स्वचालित केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके अलग-थलग सीएफडीएनए के टुकड़े आकार के वितरण का अनुमान लगाया गया था।

Protocol

रक्त संग्रह से पहले, अनुसंधान में भाग लेने वाले विषयों से सूचित सहमति की आवश्यकता है और प्राप्त किया जाना चाहिए । इस पांडुलिपि में वर्णित शोध राइन मेडिकल सेंटर, इज़राइल एथिक्स कमेटी (एथिक्स कोड: 0039-17-आरए?…

Representative Results

प्लाज्मा जुदाई8.5-9 एमएल रक्त सीएफडीएनए या सीएफआरएनए परिरक्षक ट्यूबों में एकत्र मात्रा में ~ 4 एमएल प्लाज्मा के आसपास पैदावार। EDTA ट्यूबों में एकत्र रक्त से अलग प्लाज्मा की मात्रा तापमान के आधार प?…

Discussion

एक ट्यूब, शिपमेंट और भंडारण में एक मरीज के रक्त का संग्रह तरल बायोप्सी में महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम हैं । अनुचित हैंडलिंग प्लाज्मा की गुणवत्ता को ख़राब कर सकती है और इसलिए, तरल बायोप्सी⁴⁷के पर?…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C