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Neuroscience

ऑटोलोगस रक्त के दोहरे इंजेक्शन द्वारा बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज

doi: 10.3791/62089 Published: May 29, 2021
* These authors contributed equally

Summary

हम ऑटोलॉगस रक्त के दोहरे इंजेक्शन के माध्यम से चूहे में एक बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज मॉडल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हम चूहे में एक बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज मॉडल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में करीब 250 ग्राम वजनी चूहों का इस्तेमाल किया गया। ऑटोलॉगस रक्त के १०० माइक्रोलीटर पूंछ नस से लिया गया था और टकसाली पोन में इंजेक्शन । इंजेक्शन प्रक्रिया को 2 चरणों में विभाजित किया गया था: सबसे पहले, 10 माइक्रोन रक्त को एक विशिष्ट स्थान, एंटेरोपोस्टेरियर स्थिति (एपी) -9.0 मिमी में इंजेक्ट किया गया था; पार्श्व (Lat) 0 मिमी; ऊर्ध्वाधर (वर्ट) -9.2 मिमी, एपी -9.0 मिमी पर स्थित अवशिष्ट रक्त का दूसरा इंजेक्शन; लैट 0 मिमी; 20 मिनट के अंतराल के साथ वर्ट -9.0 मिमी। बैलेंस बीम टेस्ट, लिंब प्लेसमेंट टेस्ट और मॉडिफाइड वोएस्ट न्यूरोस्कोर का इस्तेमाल न्यूरोलॉजिकल फंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । वीवो में हेमरेज की मात्रा का आकलन करने के लिए मैग्नेटिक रेओनेंस इमेजिंग (एमआरआई) का इस्तेमाल किया गया। इस मॉडल के लक्षण बड़े पैमाने पर पोंटिन रक्तस्राव के साथ रोगियों के साथ कतार में थे ।

Introduction

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इंट्रासैरेब्रल हेमरेज स्ट्रोक रोगियों के पांचवें हिस्से के लिए खाते हैं। इंट्रासैरेब्रल हेमरेज का पूर्वानुमान रक्तस्राव की गति, मात्रा और स्थान पर निर्भर करता है1,2। पूर्वाभास नकसीर की तुलना में, ब्रेनस्टेम हेमरेज में मृत्यु दर अधिक होती है और रुग्णता3होती है। ब्रेनस्टेम नकसीर का लगभग 40% पों में होता है4. पोंटिन हेमरेज की एटियोलॉजी और पैथोलॉजी काफी अलग है और फोर्ब्रेन हेमरेज 5 की तुलना में कम अध्ययन कियाजाताहै।

दो तरह के पोंटिन हेमरेज एनिमल मॉडल होते हैं। एक सहज नकसीर मॉडल है जो पोन्स 6 ,7,8में बैक्टीरियल कोलेजनेस के अर्क से प्रेरित है । इस मॉडल का सबसे बड़ा फायदा यह है कि रक्तस्राव सहज है। हालांकि, कोलेजनेस केवल पोंटिन हेमरेज की एक छोटी मात्रा को प्रेरित कर सकता है। इसके अलावा, कोलेजनेस मस्तिष्क को अन्य चोटों का कारण बन सकता है। दूसरा मॉडल पोन्स9में ऑटोलॉगस रक्त के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन से प्रेरित है । इस मॉडल का लाभ यह है कि उच्च सफलता दर के साथ मास्टर करना आसान है। सैद्धांतिक रूप से, शोधकर्ताओं ने पोन के किसी भी स्थान में रक्त की किसी भी मात्रा सुई सकता है । हालांकि, सुई मार्ग के माध्यम से वापस रिसाव के कारण, इंजेक्शन की मात्रा सीमित है। हाल ही में, डबल इंजेक्शन विधि को बढ़ावा दिया गया है वापस रिसाव9को कम करने के लिए । यह विधि इंजेक्शन के बीच 20 मिनट के अंतराल के साथ दो बार ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्ट करती है। डबल-इंजेक्शन विधि हल्के (30 माइक्रोल) और मध्यम (60 माइक्रोन) पोंटिन हेमरेज को प्रेरित करने के लिए लागू की जाती है लेकिन बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज नहीं होती है। क्लिनिक में, खराब पूर्वानुमान वाले अधिकांश पोंटिन हेमरेज रोगियों में बड़े पैमाने पर रक्तस्राव (10 एमएल से अधिक) होता है।

पिछले अध्ययन में, हम चूहा10में एक पोंटिन इस्कीमिक स्ट्रोक मॉडल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की है । इस अध्ययन में, हम मौजूदा दोहरे इंजेक्शन विधि को संशोधित करते हैं, और पोन में दो अलग-अलग स्थानों पर 100 माइक्रोन ऑटोलॉगस रक्त के दोहरे इंजेक्शन द्वारा चूहे में बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज को प्रेरित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और ग्वांग्झू मेडिकल यूनिवर्सिटी के दूसरे संबद्ध अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । चूहों दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय के पशु केंद्र द्वारा प्रदान किए गए थे । प्रायोगिक डिजाइन चित्र 1में दिखाया गया है ।

1. पशु और उपकरण

  1. 8 सप्ताह पुराने पुरुष स्प्राग-डावले चूहों का उपयोग करें जिनका वजन 250 ± 10 ग्राम है।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस के परिवेशी तापमान, 65% की सापेक्ष आर्द्रता, और 12/12-एच हल्के-अंधेरे चक्र के साथ नियंत्रित पर्यावरणीय स्थितियों के तहत सर्जरी से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए चूहों को घर करें।
  3. कोई सीमा नहीं होने से भोजन और पानी उपलब्ध कराएं।
  4. उपकरणों को तैयार करें(चित्रा 2A-E)।

2. पोन में रक्त इंजेक्ट करें

  1. प्रयोगों के लिए उपयुक्त शरीर के वजन के साथ चूहों का चयन करने के लिए सर्जरी से 3 दिन पहले फिर से चूहों का वजन करें।
  2. मॉडलिंग से पहले 3 दिनों के दौरान, चूहों को प्रति दिन 3 बार बैलेंस बीम पर चलने के लिए प्रशिक्षित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सामान्य चूहे बिना किसी ठहराव के बैलेंस बीम से गुजर सकते हैं।
  3. संज्ञाहरण से पहले हीटिंग पैड को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
  4. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर धारक को माइक्रोड्रिल संलग्न करें।
  5. चूहों को 50 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 5 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन इंट्रापेरिटी के साथ इंजेक्ट करें । इंतजार तब तक करें जब तक कि कोई टो-चुटकी प्रतिक्रिया न हो जाए।
  6. चूहे को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में एक प्रवण स्थिति में परिवहन करें। सिर को सुरक्षित करने के लिए कान की नहर के ऊपर कान की सलाखों को रखें। इंजेक्शन(चित्रा 2F)के तिरछा से बचने के लिए खोपड़ी को क्षैतिज स्थिति में ठीक करें।
  7. एक इनलेट और आउटलेट पोर्ट के साथ स्टीरियोटैक्सिक नाक शंकु के माध्यम से आइसोफ्लाणे (97.5% ऑक्सीजन और 2.5% आइसोफ्लुन) द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें।
  8. कॉर्निया नम रखने के लिए आंखों का मरहम का प्रयोग करें।
  9. एक माइक्रो शेवर के साथ खोपड़ी के ऊपर बाल दाढ़ी।
  10. द्विपक्षीय पार्श्व कैंथस की रेखा से खोपड़ी में एक मार्कर पेन के साथ 3 सेमी मिड-लाइन खींचें पीछे फॉन्टेनेल के पीछे 0.5 सेमी, जैसा कि चित्रा 2Fमें दिखाया गया है।
  11. एक परिपत्र फैशन में एंटिओडीन सर्जिकल स्क्रब लागू करें, चिह्नित मध्य रेखा के बीच में शुरू करने और जावक घूर्णन।
  12. सर्जिकल ड्रेप रखें।
  13. चिह्नित मध्य रेखा के साथ एक स्केलपेल के साथ एक चीरा बनाएं।
  14. किसी भी संभावित रक्त को हटाने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें।
  15. खोपड़ी(चित्रा 2G)का पर्दाफाश करने के लिए खोपड़ी फ्लैप के प्रत्येक पक्ष पर संदंश का एक टुकड़ा रखें।
  16. 0.9% खारा में एक कपास झाड़ू डुबकी और धीरे से कनेक्टिव ऊतकों से कनेक्टिव ऊतकों को दूर करने के लिए कनेक्टिव ऊतकों माइक्रोड्रिल में पकड़ा जा रहा से बचने के लिए।
  17. एक मार्कर कलम के माध्यम से मूल बिंदु के रूप में ब्रेग्मा के केंद्रीय बिंदु को चिह्नित करें।
  18. एपी-9.0 मिमी, लैट 0 मिमी(चित्रा 1बी और टेबल 1) में माइक्रोड्रिल का उपयोग करके क्रैनियोटॉमी (व्यास में 1 मिमी)करें। ध्यान से आगे बढ़ें क्योंकि यह बिंदु शिरीन साइनस(चित्रा 2G) केबहुत करीब है।
  19. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माइक्रोड्रिल निकालें।
  20. स्टीरियोटैक्सिक होल्डर(चित्रा 2K)में १०० μL हैमिल्टन सिरिंज रखो । इंजेक्शन पंप स्विच चालू करें, रैपिड इनहेलेशन बटन पर क्लिक करें, एस्पिरेट हेपरिन समाधान (12500 यू नमकीन के 100 मिलीएल में पतला) 100 माइक्रोन तक और फिर रक्त के थक्के को भी तेजी से रोकने के लिए इसे पूरी तरह से छान लें।
  21. त्वचा को कीटाणुरहित करने, सींग को नरम करने और इंजेक्शन की सफलता दर बढ़ाने के लिए पूंछ नस को फैलाने के लिए जड़ से कम से कम 3 बार टिप करने के लिए पूरी पूंछ में क्लोरहेक्सीडीन और 75% अल्कोहल सर्जिकल स्क्रब लागू करें।
  22. एक खोपड़ी एक्यूपंक्चर एक 1 मिलील सिरिंज के लिए देते हैं।
  23. खोपड़ी एक्यूपंक्चर को पूंछ की नोक से 3 सेमी पार्श्व पूंछ नस में डालें और 150 माइक्रोन रक्त(चित्रा 2H)लें।
  24. 1 मिली सिरिंज से सिर का एक्यूपंक्चर निकालें।
  25. रक्त को एक ट्यूब(चित्रा 2I) में स्थानांतरित करें।
    नोट: रक्त के थक्के को रोकने के लिए जल्दी से स्थानांतरित करें।
  26. सर्जिकल दस्ताने बदलें।
  27. वापस लेने मोड चुनें, १०० μL करने के लिए मात्रा सेट, २०० μL/मिनट पर गति सेट, रन बटन क्लिक करें, हैमिल्टन सिरिंज(चित्रा 2J)में रक्त के १०० μL aspirate ।
  28. इन्फ्यूज मोड चुनें, गति को 1 μL/मिनट पर सेट करें।
  29. सिरिंज को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि टिप मस्तिष्क की सतह के नीचे 9.2 मिमी तक न पहुंच जाए(चित्रा 1C और चित्रा 2L)।
  30. रन बटन पर क्लिक करें, 1 μL/मिनट(टेबल1) की गति से पहले 10 माइक्रोन रक्त इंजेक्ट करें ।
  31. इंजेक्शन बंद करो और 20 मिनट के लिए स्थिति में सिरिंज छोड़ उपराच्नाइड अंतरिक्ष में रक्त बहने से रोकने के लिए ।
  32. सिरिंज को तब तक वापस लें जब तक कि टिप मस्तिष्क की सतह से नीचे 9.0 मिमी पर न आ।
  33. अवशिष्ट रक्त को पूरी तरह से इंजेक्ट किए जाने तक 1 माइक्रोन/मिनट की एक ही गति से इंजेक्शन को पुनः आरंभ करें।
  34. रक्त बैकफ्लो से बचने के लिए सिरिंज को 10 मिनट के लिए स्थिति में छोड़ दें।
  35. सिरिंज को धीरे-धीरे दिमाग से निकाल दें।
  36. क्रैनिओटॉमी छेद को कवर करने के लिए बोन सीमेंट का उपयोग करें।
  37. जब सीमेंट सूख जाता है, तो घाव को 4-0 पॉलीमाइड सीवन फिलामेंट के साथ सीवन करें। सिलाई के बाद 3 या 4 स्टिच, टाई 2-1-1 मानक सर्जिकल नॉट।
  38. संक्रमण को रोकने के लिए, चूहे को पेनिसिलिन (0.25 एमएल, 4 एमएल नमकीन में पतला 80 आईयू) के साथ इंजेक्ट करें।
  39. चूहों को बुटोफेनॉल टार्ट्रेट (2.5 मिलीग्राम/किलो) के साथ चमड़े के इंजेक्शन दें और सर्जरी के 24 घंटे बाद तक पश्चात दर्द से राहत के लिए हर 2 घंटे में इंजेक्शन दोहराएं।
  40. चूहे को हर 15 मिनट में निरीक्षण करें जब तक कि यह संज्ञाहरण से पूरी तरह ठीक न हो जाए। पिंजरे के नीचे एक हीटिंग पैड के साथ, इसे मूल पिंजरे में वापस करें। बलिदान तक भोजन और पानी के लिए चूहा मुफ्त पहुंच प्रदान करें।

3. व्यवहार परीक्षण

नोट: मॉडलिंग के बाद 1 दिन, 3, दिन 7 और दिन 14 पर व्यवहार परीक्षण करें, जिसमें बैलेंस बीम टेस्ट, अंग प्लेसमेंट टेस्ट और संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर शामिल हैं।

  1. शेष बीम परीक्षण11
    नोट: यह विशेष रूप से हिंडलिब के संवेदी समारोह की जांच के लिए एक परीक्षण है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए उपकरण तैयार किया कि बीम (3 सेमी चौड़ा × 70 सेमी लंबा) फर्श से 20 सेमी ऊपर है।
    2. एक संकीर्ण प्रवेश द्वार के साथ बीम के पीछे के छोर पर एक डार्क बॉक्स रखो।
    3. एक सफेद शोर जनरेटर और एक उज्ज्वल प्रकाश स्रोत रखें, जिसका उपयोग चूहे को बीम को पार करने और बीम के सिर के अंत में गोल बॉक्स में प्रवेश करने के लिए प्रेरित करने के लिए किया जाता है।
    4. जब जानवर गोल बॉक्स में प्रवेश करता है तो शोर और प्रकाश को रोकें। हेड एंड से गोल बॉक्स (सेकंड में) और बीम को पार करने के दौरान हिंडलिम्ब के प्रदर्शन को रिकॉर्ड करें।
    5. निम्नलिखित के रूप में प्रदर्शन स्कोर रिकॉर्ड करें: 0, स्थिर मुद्रा के साथ संतुलन; 1, बीम के किनारे पकड़ती है; 2, बीम को 1 हिंडलिम्ब के साथ बंद कर देता है; 3, बीम को 2 अंगों के साथ बंद कर देता है, या 60 से अधिक एस के लिए बीम के चारों ओर घूमते हैं; 4, बीम >40 एस पर संतुलन का प्रयास करता है, लेकिन बंद हो जाता है; 5, बीम >20 एस पर संतुलन का प्रयास करता है, लेकिन बंद हो जाता है; और 6, बंद हो जाता है, कोई संतुलन या बीम <20 एस पर संतुलन का प्रयास के साथ ।
  2. अंग प्लेसमेंट परीक्षा
    नोट: अंग प्लेसमेंट परीक्षण चूहे के संवेदी कार्य का मूल्यांकन करने के लिए 6 मापदंडों के साथ दृष्टि, स्पर्श और प्रोप्रोसेप्शन की 3 स्वतंत्र उत्तेजनाओं की जांच करता है। कुल न्यूरोलॉजिकल फंक्शन स्कोर 0 से लेकर 12 तक था । परीक्षण से पहले, चूहे को संभालने के लिए आदी होना चाहिए।
    1. चूहे को पीठ से पकड़ें और 10 सेमी की ऊंचाई से धीरे-धीरे मेज पर रखें। आम तौर पर, चूहा अग्रअंगों को फैलाता है और उन्हें मेज पर रखेगा।
    2. पीठ से चूहे को पकड़ो और इसे मेज के किनारे का सामना करना पड़ रहा है। अग्रअंगों की प्रतिक्रिया देखी जाती है। एक सामान्य चूहा मेज पर अग्रअंगों को रखेगा।
    3. चूहे को मेज के किनारे को समझने दें। नाक और नाक के बालों को टेबल एज को छूने से रोकने के लिए एक सामान्य चूहा ठोड़ी का इस्तेमाल करेगा।
    4. मेज पर चूहे रखो, मेज के किनारे की ओर चूहे के कंधे के पीछे एक कोमल पार्श्व दबाव के साथ चूहे को धक्का, और अग्रअंगों और हिंडलिंब्स के प्लेसमेंट का निरीक्षण करें। एक सामान्य चूहा अपने अग्रअंगों और हिंडलिंबों के साथ किनारे को समझ देगा।
    5. किनारे की ओर चेहरे के साथ मेज पर चूहे रखें, और धीरे से इसे पीछे से किनारे पर धकेलें। एक सामान्य चूहा अपने अग्रअंगों के साथ किनारे को समझ देगा।
    6. चूहे को अपनी पीठ के साथ मेज पर किनारे पर रखें और इसे पीठ से मेज के किनारे पर धकेल दें। हिंडलिंब्स की प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें। एक सामान्य चूहा अपने हिंडलिंब्स के साथ किनारे को समझ देगा।
    7. टेबल एज के लिए अग्रभाग या हिंडलिम्ब्स के प्लेसमेंट का आकलन करें। स्कोर को इस प्रकार रिकॉर्ड करें: 0, कोई प्लेसमेंट नहीं; 1, अधूरा और/या विलंबित प्लेसमेंट; 2, तत्काल, पूरा प्लेसमेंट।
  3. संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर8
    नोट: संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर संवेदी क्षमता का एक वेर्टेब्रोबेसिलर स्केल स्कोर है, जिसमें 14 पैरामीटर होते हैं: सिर आंदोलन, गतिविधि, सुनवाई, दर्द पलटा, कॉर्नियल पलटा, प्रोप्रोप्रिय, गर्दन सनसनी, अन्वेषण, चक्कर, अक्षीय धड़ सनसनी, 4-अंग आंदोलन, अग्रभाग आंदोलन, चढ़ाई, और बीम चलना। प्रत्येक पैरामीटर के लिए स्कोर 0 (पूर्ण न्यूरोलॉजिकल घाटा) से 3 (कोई न्यूरोलॉजिकल घाटा) तक होता है। कुल न्यूरोलॉजिकल फंक्शन स्कोर 0 से 42 तक है।
    1. चूहे को मेज पर रखें (50 सेमी लंबा × 35 सेमी चौड़ा) और इसे पांच मिनट के लिए घूमने की अनुमति दें। अपने सिर के सहज आंदोलन का निरीक्षण करें: सभी आयामों में चलता है, 3; एक तरफ पसंद करते हैं, 2; केवल 1 तरफ आंदोलन, 1; एकतरफा पक्ष को ठोका, 0 ।
    2. चूहे को मेज पर रखें (50 सेमी लंबा × 35 सेमी चौड़ा) और इसे पांच मिनट के लिए घूमने की अनुमति दें। गतिविधि को परिभाषित किया गया है: पूरी तरह से उत्तरदायी, 3; मामूली रूप से उत्तरदायी, 2; न्यूनतम उत्तरदायी, 1; कोमा, 0।
    3. क्रैनिओक्यूडल चक्कर का निरीक्षण करें: द्विपक्षीय रूप से बदल जाता है, 3; 1 पक्ष, 2 पसंद करते हैं; केवल 1 तरफ, 1; 1 तरफ गिर गया, 0 ।
    4. अग्रभाग आंदोलन का मूल्यांकन करें: समान और द्विपक्षीय आंदोलन, 3; मामूली विषमता, 2; महान विषमता, 1; पैरेसिस, 0.
    5. 4-अंग आंदोलन का मूल्यांकन करें: समान और द्विपक्षीय आंदोलन, 3; मामूली विषमता, 2; महान विषमता, 1; पैरेसिस, 0.
    6. जब चूहा स्थिर होता है, तो ऑरिकल्स को उत्तेजित करने और दर्द पलटा परीक्षण करने के लिए कान चुटकी करें: उत्तेजना से जल्दी और सममित रूप से दूर चले जाते हैं, 3; उत्तेजना से धीरे-धीरे या विषम रूप से दूर चले जाते हैं, 2; दर्द के जवाब में कुछ आंदोलन दिखाता है, 1; कोई प्रतिक्रिया नहीं, 0।
    7. जब चूहा स्थिर होता है, तो सुनवाई का परीक्षण करने के लिए चूहे के शरीर के दोनों ओर शोर मचाएं: उंगलियां रगड़ती हैं, 3; उंगलियों की तस्वीर, 2; जोर से ताली बजाने, 1 और कोई चौंकाने वाला, 0 ।
    8. प्रोप्रोसेप्शन की जांच करने के लिए, एक कुंद छड़ी के साथ क्रमशः दोनों पक्षों पर चूहे के वाइब्रेसे को स्पर्श करें और उत्तेजना के प्रति अपनी प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें: स्पर्श पर प्रतिक्रिया दें, 3; एक तरफ कम प्रतिक्रिया, 2; दोनों पक्षों पर कम, 1; अनुपस्थित, 0.
    9. धड़ अक्षीय सनसनी का मूल्यांकन करने के लिए, चूहे के शरीर के दोनों ओर एक कुंद छड़ी रखें और उत्तेजना के प्रति अपनी प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें: उत्तेजनाओं के लिए तेज और सममित प्रतिक्रिया, 3; थोड़ा कम या विषम प्रतिक्रिया, 2; बहुत कम और विषम प्रतिक्रिया, 1 और कोई प्रतिक्रिया नहीं, 0।
    10. कॉर्नियल पलटा का परीक्षण करने के लिए, चूहे को पकड़ें और जल्दी से दोनों तरफ कॉर्निया को कपास के झाड़ू के साथ स्पर्श करें: दोनों आंखें जल्दी बंद हो जाती हैं, 3; एक तरफ कम पलटा, 2; दोनों पक्षों पर कम, 1; अनुपस्थित, 0.
    11. गर्दन की सनसनी की जांच करने के लिए, चूहे को पकड़ें और गर्दन को छूने के लिए एक कुंद छड़ी का उपयोग करें: सक्रिय रूप से छूने के लिए प्रतिक्रिया करता है, 3; स्पर्श करने के लिए धीमी प्रतिक्रिया, 2; बहुत कम प्रतिक्रिया, 1; कोई प्रतिक्रिया नहीं, 0।
    12. अन्वेषण का निरीक्षण करने के लिए, हल्के अंधेरे बॉक्स का उपयोग करें।
      नोट: बॉक्स के दो तिहाई खुले और जलाया जाना चाहिए, जबकि यह बाकी कवर और अंधेरा है । एक 7 सेमी दरवाजा दो डिब्बों को जोड़ता है।
    13. चूहे को 5 मिनट के लिए हल्के डिब्बे में रखें और फिर एक और 5 मिनट के लिए अंधेरे डिब्बे, इसे चारों ओर ले जाने और चूहे की गतिविधियों को रिकॉर्ड करने की अनुमति दें। जब एक कमरे में 4 अंग रखे जाएं तो इसे प्रवेश द्वार के रूप में रिकॉर्ड करें। इस प्रकार रिकॉर्ड स्कोर: सक्रिय रूप से प्रकाश और अंधेरे डिब्बों तक पहुंचता है, 3; 1 डिब्बे, 2 तक पहुंचता है; उत्तेजना के बाद धीरे-धीरे चलता है, 1; और कोई आंदोलन, 0।
    14. चढ़ाई की क्षमता की जांच करने के लिए, चूहे को 20 सेमी चौड़े, 70 सेमी लंबे विमान के नीचे क्षैतिज जमीन पर 30 डिग्री कोण के साथ रखें। इस प्रकार रिकॉर्ड स्कोर: शीर्ष पर चढ़ने में सक्षम, 3; बिगड़ा चढ़ाई, 2; स्थिर पकड़, 1; और तुरंत गिर जाता है, 0।
    15. बीम वॉक की जांच करने के लिए, चूहे को 3 सेमी चौड़े, 70 सेमी लंबी बीम के एक छोर पर रखें जो जमीन से 20 सेमी ऊपर है, निम्नलिखित के रूप में रिकॉर्ड स्कोर: पूरे बीम की पड़ताल करता है, 3; बीम, 2 के हिस्से की पड़ताल; कुछ आंदोलन और गिर जाता है, 1; कोई आंदोलन नहीं, 0।
    16. अंकों की गणना करें।

4. एमआरआई द्वारा रक्तस्राव की पुष्टि

  1. सर्जरी के बाद 24 घंटे में एमआरआई स्कैन करें।
  2. आइसोफ्लुरेन (प्रेरण के लिए 5%, रखरखाव के लिए 1%- 1.5%) के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें।
  3. चूहे मस्तिष्क सरणी कुंडली में चूहे के सिर को एक संचारित-केवल मात्रा कुंडली के साथ संयुक्त रूप से सुरक्षित करें।
  4. कुंडली को एमआरआई स्कैनर में चूहे के साथ रखें। दांत और कान की सलाखों के माध्यम से पालने के भीतर चूहे को सुरक्षित करें।
  5. एमआरआई स्कैनिंग के दौरान चूहे के शरीर के तापमान को 37 ± 05 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने के लिए क्लोज सर्किट थर्मल जैकेट का इस्तेमाल करें।
  6. सही ज्यामिति सुनिश्चित करने के लिए एक पायलट अनुक्रम प्रदर्शन करें।
  7. टी2 भारित स्कैन इकट्ठा करने के लिए एक फास्ट-स्पिन इको सीक्वेंस लागू करें। मापदंडों को इस प्रकार निर्धारित करें: इको टाइम (टीई), 132 एमएस; पुनरावृत्ति समय (टीआर), 2,500 एमएस; अधिग्रहण मैट्रिक्स, 148 × 148; देखने का क्षेत्र, 100 मिमी × 100 मिमी; 12 स्लाइस; 1.5 मिमी मोटी।
  8. चूहे को पिंजरे में लौटा दें।

5. सकल शरीर रचना विज्ञान द्वारा रक्तस्राव की पुष्टि

नोट: निर्धारित समय बिंदु पर चूहों का बलिदान, 24 घंटे और 14 डी सर्जरी के बाद(चित्रा 1D)

  1. चेतना की हानि तक 5% आइसोफ्लुन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें। फिर, इसे कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)(प्रति मिनट पिंजरे की मात्रा का 20-30%) के साथ इच्छामृत्यु दें।
  2. निम्नलिखित संकेतों का उपयोग करके मृत्यु की पुष्टि न करें: कोई छाती बढ़ती है और गिरती है, कोई स्पष्ट दिल की धड़कन नहीं, पैर की अंगुली चुटकी, खराब म्यूकोसा रंग, रंग परिवर्तन, या आंखों में अस्पष्टता का कोई जवाब नहीं है।
  3. सर्वाइकल अपभ्रंश करें।
  4. एक बाँझ मंच पर पंजे टेप द्वारा चूहे को सुरक्षित करें। हाइपोग्स्ट्रियम को छाती और जिगर में बेनकाब करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा से एक मिडलाइन चीरा बनाएं। दिल को बेनकाब करने के लिए, क्लैविकल के साथ ऊपरी स्टर्नल मार्जिन से दूर बाईं ओर और डायाफ्राम के साथ xiphoid से एक और पार्श्व कटौती करें। रिबकेज फ्लैप उठाएं और पिन के साथ इसे प्लेटफॉर्म पर ठीक करें।
  5. एक सुई (27 जी) के अंत को 4 डिग्री सेल्सियस नमकीन वाले परफ्यूजन पंप से कनेक्ट करें। एट्रियम में प्रवेश करने से बचने के लिए बाएं वेंट्रिकल के बाएं किनारे के साथ दिल में सुई टिप को आगे बढ़ाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए पर्फ्यूजन पंप चालू करें कि टिप बाएं वेंट्रिकल में है, फिर दाएं एट्रियम में कटौती करें।
  6. पर्फ्यूजन पंप बंद कर दें जब तरल सही एट्रियम से सूखा बेरंग हो जाता है और जिगर सफेद हो जाता है। इस प्रक्रिया को लगभग 100 एमएल 4 डिग्री सेल्सियस खारा की जरूरत है।
  7. चूहे को काटना और कैंची और संदंश का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क को फसल। ब्लॉटिंग पेपर के साथ मस्तिष्क की सतह से किसी भी नमी को हटा दें।
  8. 1 मिनट के लिए पूरे मस्तिष्क को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: यह कदम छोड़ दिया जा सकता है अगर मस्तिष्क ठंड के बिना काटा जा सकता है ।
  9. मस्तिष्क को कोरोनल चूहा मस्तिष्क मैट्रिक्स में पृष्ठीय पक्ष के साथ ऊपर रखें।
  10. मस्तिष्क की सतह में छेद के अनुसार नकसीर केंद्र में एक 0.21 मिमी मोटी स्टेनलेस स्टील ब्लेड डालें।
  11. 2 मिमी के अंतराल पर मस्तिष्क में अन्य ब्लेड डालें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान के 10 एमएल में मस्तिष्क वर्गों को विसर्जित करें। उन्हें 0.01 mmol/L फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कुल्ला।
  13. रोस्ट्रल से कौडल तक के वर्गों को व्यवस्थित करें और उन्हें छवि दें।

6. पैराफिन सेक्शन और हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचई) धुंधला

  1. कमरे के तापमान पर कम से कम 24 घंटे के लिए 4% पीएफए समाधान के साथ मस्तिष्क को ठीक करें। पीएफए की मात्रा मस्तिष्क की मात्रा का 5-10 गुना होना चाहिए।
  2. रक्तस्राव केंद्र से मस्तिष्क को ब्लेड और कोरोनल चूहा मस्तिष्क मैट्रिक्स के माध्यम से दो टुकड़ों में काटें।
  3. पैराफिन एम्बेडेड टिश्यू ब्लॉक बनाएं।
  4. एक माइक्रोटॉम पर 40 माइक्रोन मोटाई स्लाइड में पैराफिन एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक कोरोनली अनुभाग, उत्तराधिकार में 4 वर्गों में कटौती, नकसीर केंद्र से शुरू, और उन्हें एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में नाव।
  5. साफ ग्लास स्लाइड पर 40 माइक्रोन वर्गों (एक मस्तिष्क के लिए कुल में 8 स्लाइड) माउंट और कमरे के तापमान पर रात भर सूखी हवा।
  6. 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बेक करें।
  7. जाइलीन में 3 मिनट के लिए धोएं, 3 बार।
  8. 100% इथेनॉल में 30 गुना, 100% इथेनॉल में 30 गुना, 95% इथेनॉल में 30 गुना और 95% इथेनॉल में 30 गुना अधिक बार वर्गों को डुबकी दें।
  9. साफ होने तक नल के पानी में कुल्ला करें।
  10. लगभग 10 मिनट के लिए हेमटॉक्सीलिन में वर्गों को विसर्जित करें।
  11. साफ होने तक नल के पानी में कुल्ला करें।
  12. 30 एस के लिए ियोसिन दाग में वर्गों विसर्जित कर दिया।
  13. 3-4 डिप्स 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल में 3-4 डिप्स, 1 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और 100% इथेनॉल + जाइलीन (1:1) में 10 डिप्स के साथ निर्जलेट स्लाइड।
  14. 1 मिनट, 2 बार के लिए जाइलीन के साथ साफ वर्गों।
  15. गैर जलीय बढ़ते माध्यम और एक कवरस्लिप का उपयोग कर माउंट ।
  16. कमरे के तापमान पर रात भर हवा में वर्गों को सुखाएं, फिर उन्हें सैन करें।

7. सांख्यिकी

  1. छात्र के टी-टेस्ट या मान व्हिटनी यू टेस्ट की गणना करने के लिए ग्राफपैड चश्मे 6.0 का उपयोग करें।
    नोट: सभी डेटा का मतलब है ± एसई के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए । दो समूहों के बीच मतभेद एक दो पूंछ छात्र टी परीक्षण या मान व्हिटनी यू परीक्षण के साथ निर्धारित कर रहे हैं । पी<0.05 को सांख्यिकीय महत्व के रूप में परिभाषित किया गया है।

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Representative Results

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कुल 25 जानवरों का इस्तेमाल किया गया, 3 नियंत्रण के लिए, 6 के लिए 30 माइक्रोन, 60 माइक्रोन के लिए, और 100 माइक्रोन रक्त इंजेक्शन के लिए। एक चूहा है कि ऑटोलॉगस रक्त (1/10) का एक १०० μL इंजेक्शन प्राप्त सर्जरी के बाद 24 घंटे के भीतर मर गया ।

सर्जरी के बाद 1 दिन, 3 दिन, 7 दिन और 14 दिन पर व्यवहार परीक्षण किए गए । सर्जरी के बाद विभिन्न टाइमपॉइंट पर कंट्रोल ग्रुप और ब्लड-इंजेक्शन ग्रुप के लिए स्कोर टेबल 2में प्रस्तुत किए जाते हैं । पोंटिन नकसीर के कारण न्यूरोलॉजिकल घाटे जैसे कम कॉर्नियल पलटा और चक्कर(चित्रा 3 बी,सी)। 100 माइक्रोन रक्त के इंजेक्शन ने मायोटोनिया(चित्रा 3 ए)को भी प्रेरित किया। बैलेंस बीम टेस्ट, लिंब प्लेसमेंट टेस्ट और मॉडिफाइड Voetsch न्यूरोस्कोर के नतीजों से पता चला कि पोंटिन हेमरेज की मात्रा बढ़ने से न्यूरोलॉजिकल फंक्शन में कमी आई ।

एमआरआई स्कैनिंग सर्जरी के 24 घंटे बाद किया गया था(चित्रा 4)। रक्त-इंजेक्शन समूहों में, टी-2 अनुक्रम पर, नकसीर को एक आइसो के साथ हाइपॉइंटेंज रिम के रूप में पाया गया- पोन के बेसिलर भाग में थोड़ा हाइपरइंटेंस कोर। अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों(चित्रा 4)में एमआरआई द्वारा कोई रक्तस्राव का पता नहीं चला था । ऑटोलोगस रक्त के इंजेक्शन की मात्रा बढ़ने के साथ ही रक्तस्राव की मात्रा बढ़ गई थी।

फिर चूहों को सर्जरी के बाद 24 घंटे और दिन 14 में बलिदान दिया गया, अलग से, और 2 मिमी मोटी वर्गों(चित्रा 4) बनायागया । नकसीर इंजेक्शन साइट के आसपास और पोन के आधार में वितरण का पता चला था । 100 माइक्रोन ब्लड-इंजेक्शन ग्रुप में हेमरेज के आसपास मामूली एडिमा था।

चूहों में से कुछ सर्जरी और पैराफिन-sectioned के बाद 3 दिन बलिदान करने के लिए वह धुंधला कर रहे थे । परिणामों से पता चला है कि रक्त इंजेक्शन समूहों में, भड़काऊ कोशिकाओं पेरी-नकसीर क्षेत्र(चित्रा 5C और एफ)में समृद्ध । हीमोग्लोबिन बरकरार लाल रक्त कोशिकाओं(चित्रा 5D और जी)के भीतर निहित रहता है ।

Figure 1
चित्रा 1:पोंटिन हेमरेज मॉडल के योजनाबद्ध आरेख। (ए) पूंछ नस से ऑटोलॉगस रक्त संग्रह। (ख) ड्रिल स्थान का योजनाबद्ध आरेख । (ग) इंजेक्शन स्थान के योजनाबद्ध आरेख । (घ) प्रायोगिक डिजाइन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:उपकरण और सर्जरी की प्रक्रिया। (A) संज्ञाहरण मशीन। (ख) सर्जिकल उपकरण । (ग) माइक्रोड्रिल । (घ) माइक्रो इंजेक्शन पंप। (ई) स्टीरियोटैक्सिक उपकरण । (च) खोपड़ी के बीच में चिह्नित एक रेखा । (जी) पीला तीर ड्रिल स्थान के लिए अंक । (ज) पूंछ की नस से रक्त की जल निकासी। (I) रक्त को एपेंडोर्फ ट्यूब में स्थानांतरित करें। (जम्मू) हैमिल्टन सिरिंज में खून को एस्पिरेट करें । (कश्मीर) खोपड़ी छेद के माध्यम से हैमिल्टन सिरिंज अग्रिम । (L) ऑटोलॉगस रक्त की इंजेक्शन प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:व्यवहार परीक्षणों के प्रतिनिधि परिणाम। (क) चूहे में मायोटोनिया ने ऑटोलॉगस रक्त के 100 माइक्रोन का इंजेक्शन लगाया। (ख) एक चूहे में दाईं ओर कम कॉर्नियल पलटा ऑटोलॉगस रक्त के ६० माइक्रोन इंजेक्शन । (ग) एक चूहे में द्विपक्षीय पक्षों में कम कॉर्नियल पलटा ऑटोलॉगस रक्त के १०० माइक्रोन इंजेक्शन । (घ) एक चूहे को घाव के विपरीत पक्ष की परिक्रमा करने वाले ऑटोलॉगस रक्त का 60 माइक्रोन प्राप्त हुआ। (ङ) बैलेंस बीम टेस्ट के परिणाम। (च) संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर के परिणाम । (जी) अंग प्लेसमेंट परीक्षा के परिणाम । लाइन का मतलब है दो समूहों (पी < ०.०५) के बीच महत्वपूर्ण अंतर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एमआरआई स्कैनिंग और सकल शरीर रचना विज्ञान के प्रतिनिधि परिणाम। एमआरआई स्कैनिंग (ऊपरी) पोंटिन नकसीर सर्जरी के बाद 24 घंटे किया गया था, तो चूहों की बलि और 2 मिमी मस्तिष्क वर्गों (नीचे) में कटौती की गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:वह धुंधला के प्रतिनिधि परिणाम । दिमाग चूहों से काटा गया था सर्जरी के बाद १०० माइक्रोन रक्त 3 डी इंजेक्शन । (क) पूरा मस्तिष्क खंड । (ख) सामान्य पोंटीन क्षेत्र, (सी) पेरी-घाव क्षेत्र और (डी) नकसीर कोर से कम क्षेत्र। (ई) सामान्य पोंटिन क्षेत्र, (एफ) पेरी-घाव क्षेत्र और (जी) नकसीर कोर से उच्च क्षेत्र। स्केल बार 100 माइक्रोन था. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा S1: सर्जरी के बाद 14 दिन पर सकल शरीर रचना विज्ञान के प्रतिनिधि परिणाम । कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

हलका मध्‍यमार्गी भारी-भरकम
कुल मात्रा 30 माइक्रोन 60 माइक्रोन 100 माइक्रोल
पहला इंजेक्शन
स्टीरियोटाटिक निर्देशांक एपी -9.0 मिमी; लैट 0; वर्ट -9.2 मिमी
आयतन 10 माइक्रोल 10 माइक्रोल 10 माइक्रोल
गति 1 माइक्रोन/मिनट 1 माइक्रोन/मिनट 1 माइक्रोन/मिनट
अंतराल का समय 20 मिनट 20 मिनट 20 मिनट
दूसरा इंजेक्शन
स्टीरियोटाटिक निर्देशांक एपी -9.0 मिमी; लैट 0; वर्ट -9.2 मिमी एपी -9.0 मिमी; लैट 0; वर्ट -9.0 मिमी
आयतन 20 माइक्रोन 50 माइक्रोन 90 माइक्रोन
गति 1 माइक्रोन/मिनट 1 माइक्रोन/मिनट 1 माइक्रोन/मिनट
सुई की वापसी से पहले 10 मिनट 10 मिनट 10 मिनट
एपी: एंटेरोपोस्टेर स्थिति
Lat: पार्श्व
वर्ट: वर्टिकल

तालिका 1: ऑटोलॉगस रक्त का इंजेक्शन।

चूहा संख्या दिन 1 तीसरा दिन दिन 7 दिन 14
संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर
30 माइक्रोल-1 33 34 38 41
30 माइक्रोल-2 30 35 37 41
30 माइक्रोन-3 34 37 40 42
60 माइक्रोन-4 27 30 36 38
60 माइक्रोन-5 23 28 34 39
60 माइक्रोन-6 26 29 35 39
100 माइक्रोल-7 16 25 31 36
100 माइक्रोल-8 13 22 29 37
100 माइक्रोल-9 14 21 26 36
शाम-10 41 42 42 42
शाम-11 42 42 42 42
शाम-12 42 42 42 42
बैलेंस बीम टेस्ट
30 माइक्रोल-1 1 0 0 0
30 माइक्रोल-2 1 1 0 0
30 माइक्रोन-3 2 1 0 0
60 माइक्रोन-4 3 2 0 0
60 माइक्रोन-5 4 2 0 0
60 माइक्रोन-6 3 2 1 0
100 माइक्रोल-7 5 4 3 1
100 माइक्रोल-8 5 4 2 1
100 माइक्रोल-9 4 4 2 1
शाम-10 0 0 0 0
शाम-11 0 0 0 0
शाम-12 0 0 0 0
अंग प्लेसमेंट परीक्षा
30 माइक्रोल-1 11 12 12 12
30 माइक्रोल-2 10 11 12 12
30 माइक्रोन-3 10 11 12 12
60 माइक्रोन-4 9 11 12 12
60 माइक्रोन-5 8 9 9 11
60 माइक्रोन-6 8 9 10 11
100 माइक्रोल-7 4 5 9 11
100 माइक्रोल-8 3 4 8 10
100 माइक्रोल-9 2 4 7 8
शाम-10 11 12 12 12
शाम-11 12 12 12 12
शाम-12 12 12 12 12

तालिका 2: व्यवहार परीक्षणों के परिणाम।

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Discussion

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वर्तमान अध्ययन में, हमने एक बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज चूहा मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया। इस मॉडल का उपयोग रोगविज्ञान तंत्र और बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज के पूर्वानुमान पर अनुसंधान के लिए किया जा सकता है।

पूरे प्रयोग के दौरान 25 चूहों का इस्तेमाल किया गया, जिनमें से केवल एक की मौत हुई । एमआरआई, सकल शरीर रचना विज्ञान, और वह धुंधला के सत्यापन संकेत दिया है कि इस विधि एक बहुत कम मृत्यु दर और एक उच्च सफलता दर थी । बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज मॉडल स्थापित करने के लिए, दो समस्याओं का समाधान किया जाना चाहिए, इंजेक्शन ऑटोलॉगस रक्त सबराचनॉयड अंतरिक्ष में रिसाव करता है और सुई पथ के साथ चौथे वेंट्रिकल में वापस प्रवाहित होता है। मौजूदा डबल इंजेक्शन मॉडरेट (कुल में 60 माइक्रोन ऑटोल रक्त) पोंटिन हेमरेज मॉडल ने पहली समस्या का समाधान किया, बमुश्किल कोई रक्त सबराचनोइड अंतरिक्ष में प्रवाहित हुआ। हालांकि, अभी भी थोड़ी मात्रा में ब्लड बैकफ्लो था । वर्तमान अध्ययन में, मौजूदा डबल-इंजेक्शन विधि को अनुकूलित करने के लिए कई रणनीतियों को लागू किया गया था ताकि बैकफ्लो के बिना 100 माइक्रोल ऑटोलॉगस रक्त की एक बड़ी मात्रा को इंजेक्ट करना संभव हो सके। सबसे पहले, एक के बजाय दो अलग इंजेक्शन स्पॉट कार्यरत थे । दूसरा, हेपरिन का उपयोग खुराक को कम करने के लिए कम से कम अवशिष्ट के साथ सिरिंज को फ्लश करने के लिए किया गया था, ताकि इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान केवल रक्त को कोडा गुलाटिंग से बचाया जा सके, लेकिन इंजेक्शन के बाद रिसाव और बैकफ्लो को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त नहीं था। तीसरा, इंजेक्शन का समय लंबा था और इंजेक्शन की गति धीमी थी, 1 μL/मिनट । इसके अलावा, केवल ऑटोलॉगस रक्त की एक छोटी राशि पहली बार इंजेक्शन दिया गया था, जबकि दूसरा इंजेक्शन 20 मिनट बाद किया गया था । बाद में, सुई को केवल 10 मिनट के बाद वापस ले लिया गया था, और यह प्रक्रिया बहुत धीरे-धीरे आयोजित की गई थी। इस विधि का उपयोग करके, 30 माइक्रोन या 60 माइक्रोन रक्त के साथ इंजेक्शन चूहों में सबराचनोइड स्पेस या चौथे वेंट्रिकल में बमुश्किल कोई रक्त बह रहा था, लेकिन अभी भी 100 माइक्रोन के साथ इंजेक्शन चूहों में बैकफ्लो की एक छोटी मात्रा थी। सुई को हटाने से पहले समय का विस्तार इस समस्या को हल कर सकता था।

व्यवहार परीक्षण मॉडलिंग के बाद 1 दिन 1, दिन 3, दिन 7 और दिन 14 पर किया गया, जिसमें बैलेंस बीम टेस्ट, लिंब प्लेसमेंट टेस्ट और मॉडिफाइड Voetsch न्यूरोस्कोर शामिल हैं । सर्जरी के बाद पहले दिन, रक्त इंजेक्शन समूहों में चूहों के लगभग सभी चक्कर व्यवहार (यानी, बाएं या दाएं मोड़), एकतरफा या द्विपक्षीय कॉर्नियल पलटा के लापता होने के साथ दिखाया । हालांकि ऑटोलॉगस रक्त को पोंटिन के मिडलाइन में इंजेक्ट किया गया था, लेकिन इसे मस्तिष्क के दोनों किनारों में असमान रूप से वितरित किया गया था। यह व्यवहार परीक्षणों में अलग प्रदर्शन के लिए कारण लग रहा था । चूहों की गतिविधियों और प्रतिक्रियाओं ने 30 माइक्रोन या 60 माइक्रोन ऑटोलॉगस रक्त को सामान्य के करीब धीमा कर दिया। चूहों में 100 माइक्रोन रक्त का इंजेक्शन दिया गया था, संवेदी कार्य काफी कमजोर हो गए थे और प्रतिक्रिया खराब थी। बाहुबलियों की कठोरता आराम करने वाली स्थिति में कुछ चूहों में दिखाई दी। दिन 1, दिन 3 और दिन 7 पर, चूहों के बीच स्पष्ट अंतर थे 30 μL, ६० μL या ऑटोलॉगस रक्त के १०० μL और संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर में नियंत्रण समूह में चूहों इंजेक्शन । बैलेंस बीम टेस्ट और लिंब प्लेस टेस्ट में चूहों को किसी भी समय कंट्रोल ग्रुप में 30 माइक्रोन या 60 माइक्रोन का इंजेक्शन लगाने के बीच कोई खास अंतर नहीं था। हालांकि, चूहों में बैलेंस बीम टेस्ट और लिंब प्लेसमेंट टेस्ट के परिणाम 1 दिन और 3 दिन पर नियंत्रण समूह की तुलना में ऑटोलॉगस रक्त के 100 माइक्रोन इंजेक्शन काफी अलग थे। संभावित कारण यह हो सकता है कि संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर की तुलना में बैलेंस बीम परीक्षण और अंग प्लेसमेंट परीक्षण में कम मूल्यांकन आइटम हैं, जो सूक्ष्म न्यूरोलॉजिकल घाटे की खोज करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हैं। हल्के लक्षणों के साथ नकसीर मॉडल में व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए इन दो तरीकों का उपयोग करना अनुचित है, लेकिन वे बड़े पैमाने पर पोंटिन नकसीर मॉडल में लागू होते हैं। कुल मिलाकर, संशोधित Voetsch न्यूरोस्कोर विभिन्न पोंटिन हेमरेज मॉडल में न्यूरोलॉजिकल कार्यों का व्यापक और सटीक आकलन करने के लिए अधिक उपयुक्त हो गया।

इस विधि के कई फायदे हैं। पिछले डबल-इंजेक्शन विधि के आधार पर, दूसरा इंजेक्शन स्थान बदल दिया गया था और हल्के (30 माइक्रोल) और मध्यम (60 माइक्रोन) पोंटिन हेमरेज मॉडल में रिसाव और बैकफ्लो से बचने के लिए हेपरिन की खुराक को समायोजित किया गया था। यहां तक कि बड़े पैमाने पर (100 माइक्रोन) पोंटिन हेमरेज मॉडल में, बैकफ्लो बहुत सीमित था, और केवल चूहों की एक छोटी संख्या में हुआ। इस विधि को आसानी से उच्च सफलता दर और कम मृत्यु दर के साथ किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रायोगिक पोंटिन नकसीर एक लंबी अवधि के दौरान देखा जा सकता है, मॉडलिंग के कम से कम 14 दिनों के बाद, जो पूरे रोग विकास और उपचार के प्रभावों की जांच करने के लिए अनुकूल है। इस मॉडल का प्रमुख अग्रिम यह था कि इसने पोंटिन हेमरेज के रोगियों के लक्षणों की नकल की। चिकित्सकीय रूप से, बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज के परिणामस्वरूप गंभीर न्यूरोलॉजिकल घाटे होते हैं, जबकि पिछले पोंटिन हेमरेज मॉडल केवल हल्के लक्षणों के साथ अपेक्षाकृत छोटे रक्तस्राव की मात्रा विकसित करते हैं। द्विपक्षीय पोन्स में वितरित इस मॉडल में बड़े पैमाने पर पोंटीन हेमरेज, जो पोंटिन हेमरेज रोगियों में नकसीर वितरण के समान है। पिछले प्रयोगात्मक पोंटिन नकसीर मॉडल में, नकसीर केवल एकतरफा पोन9में स्थित है।

हालांकि, इस विधि की कुछ सीमाएं भी हैं। सबसे पहले, इस अध्ययन में पोंटिन नकसीर रक्त के इंजेक्शन के कारण हुआ था, संक्रमण के दौरान आंशिक रूप से heparinized, जो रक्त जमावट या यहां तक कि आसपास के पोन में होमोसटासिस को प्रभावित कर सकता है । दूसरा, इस मॉडल को विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, जैसे स्टीरियोटैक्सिक उपकरण और इंजेक्शन पंप। तीसरा, यह मॉडल सहज नकसीर की नकल नहीं कर सकता ।

अंत में, इस अध्ययन ने चूहे में एक प्रयोगात्मक तीव्र बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज मॉडल बनाने के लिए एक विधि प्रदान की, जो इस क्षेत्र में नए यांत्रिक और चिकित्सीय अनुसंधान को बढ़ावा दे सकती है।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को आर्थिक रूप से चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (81471181 और 81870933) और ग्वांग्झू मेडिकल यूनिवर्सिटी (0506308) के उद्घाटन प्रयोगशाला कार्यक्रम वाई जियांग के लिए समर्थन किया गया था, और चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (81701471) और ग्वांग्झू नगर स्वास्थ्य आयोग (20191A011083) के वैज्ञानिक कार्यक्रम द्वारा जेड Qiu के लिए, और चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (81501009) द्वारा वू

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100ml Saline solution Guangdong yixiang 191222201 C1 Preparing heparin diluent
100μl Microinjector Shanghai Gaoge Injection of autologous blood
1ml Syringe Jiangsu Zhiyu 20191014 Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol Shandong Lierkang Disinfection of rat tail
Adhesive tape Shanghai Jinzhong Surgicl instruments
Animal anesthesia system RWD R510-31S-6 Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam Jiangsu Saiangsi For neurological deficit scores
Blades Shanghai Feiying 74-C For gross anatomy
Bone cement Shanghai Xinshiji 20180306 Surgicl instruments
Brain tank Shenzhen LEIYEA For gross anatomy
Butorphanol tartrate Jiangsu Hengrui For pain management
Electric cranial drill Nanjing  Darwin biotechnology 20180090018 Making a burr hole on the skull
EP tube Nantong Surui Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream Yunnan pharmacy Eyes protection
HE dye liquor Solarbio G1120 For HE staining
Heating pad Dangerous Jungle JR01 Keeping warm
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmacal Company 190701 Preparing heparin diluent
IndoPhors Guoyao of China Sterilization
Isoflurane RWD 20080701 Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box Jiangsu Saiangsi For neurological deficit scores
Micro-injection pump Baoding Leifu TFD03-01-C Injection of autologous blood
MRI system Philips Confirmation of infarction in vivo
Needle holder Shanghai Jinzhong J32020 Surgicl instruments
Penicilin Guoyao of China Infection Prevention
Q-tips Jiangxi Songhe Surgicl instruments
Scalp heedle Jiangxi Hongda 20200313 Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel Shanghai Kaiyuan 170902 Surgicl instruments
Shearing scissors Shanghai Jinzhong Y00040 Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus RWD 900-00001-00 for surgical positioning
Surgical towel Xinxiang Huakangweicai 20070601 Surgicl instruments
Suture needle Shanghai Jinzhong Surgicl instruments
Suture scissors Shanghai Jinzhong J25041 Surgicl instruments
Tissue holding forcepts Shanghai Jinzhong J31080 Surgicl instruments

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References

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ऑटोलोगस रक्त के दोहरे इंजेक्शन द्वारा बड़े पैमाने पर पोंटिन हेमरेज
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Cite this Article

Tang, X., Wu, L., Luo, M., Qiu, Z., Jiang, Y. Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood. J. Vis. Exp. (171), e62089, doi:10.3791/62089 (2021).More

Tang, X., Wu, L., Luo, M., Qiu, Z., Jiang, Y. Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood. J. Vis. Exp. (171), e62089, doi:10.3791/62089 (2021).

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