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Neuroscience

자동 혈액의 이중 주입에 의한 대규모 폰틴 출혈

doi: 10.3791/62089 Published: May 29, 2021
* These authors contributed equally

Summary

우리는 자가 혈액의 이중 주입을 통해 쥐에 거대한 pontine 출혈 모델을 설정하는 프로토콜을 제시한다.

Abstract

우리는 쥐에 거대한 pontine 출혈 모델을 설정하는 프로토콜을 제공합니다. 약 250 그램의 무게 쥐는이 연구에서 사용 되었다. 백 마이크로리터의 자가 혈액은 꼬리 정맥에서 가져와 입체적으로 폰에 주입되었습니다. 주사 과정은 2단계로 나뉘었다: 첫째, 10 μL의 혈액은 특정 위치, anteroposterior 위치 (AP) -9.0 mm로 주입되었다; 측면(Lat) 0mm; 수직(Vert) -9.2 mm, AP-9.0 mm에 위치한 잔류 혈액의 제2 주입; 위도 0mm; 20분 간격으로 -9.0mm를 정점하십시오. 밸런스 빔 테스트, 사지 배치 테스트 및 수정된 Voestch 신경 점수는 신경 기능을 평가하는 데 사용되었습니다. 자기 공명 화상 진찰 (MRI)는 생체 내출혈의 부피를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이 모형의 현상은 거대한 pontine 출혈을 가진 환자와 일치했습니다.

Introduction

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인트레이스레브랄 출혈은 뇌졸중 환자의 1/5을 차지합니다. 무추적 출혈의 예후는 출혈1,2의속도, 볼륨 및 위치에 따라 달라집니다. 뇌출혈과 비교하여 뇌간 출혈은 사망률이 높고이환율3이더 높습니다. 뇌간 출혈의 약 40%는 폰4에서발생합니다. pontine 출혈의 병인학 및 병리학은 뇌 출혈5보다매우 다르고 덜 연구된다.

퐁틴 출혈 동물 모델의 두 종류가 있습니다. 하나는6,7,8에서세균 콜라게나아제의 주입에 의해 유도된 자발적인 출혈 모델이다. 이 모델의 가장 큰 장점은 출혈이 자발적이라는 것입니다. 그러나 콜라게나아제는 소량의 폰틴 출혈만 유발할 수 있습니다. 게다가, 콜라게나아제는 두뇌에 그밖 상해를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 다른 모델은 폰9에자가 혈액의 스테레오테 삽입에 의해 유도된다. 이 모델의 장점은 높은 성공률로 마스터하기 쉽다는 것입니다. 이론적으로, 연구원은 폰의 어떤 위치에 혈액의 어떤 볼륨을 주입할 수 있습니다. 그러나, 바늘 경로를 통한 백 누설로 인해 주입된 부피가 제한됩니다. 최근에는 이중 주입 방법이배분방지9를감소시키는 방법을 추진하고 있다. 이 방법은 주사 사이의 20 분 간격으로 두 번 자가 혈액을 주입합니다. 이중 분사 방법은 온화한(30 μL) 및 중간(60 μL) 폰틴 출혈을 유도하기 위해 적용되지만 대규모 폰틴 출혈은 유발되지 않습니다. 클리닉에서, 가난한 예후를 가진 pontine 출혈 환자의 대다수는 거대한 출혈이 있습니다 (10 mL 이상).

이전 연구에서는, 우리는 쥐10에서pontine 허혈성 뇌졸중 모델을 설정하는 프로토콜을 제공했다. 본 연구에서는, 기존의 이중 주입 방법을 수정하고, 폰의 두 개의 다른 위치에서 100 μL 자가 혈액의 이중 주입에 의해 쥐에서 대규모 pontine 출혈을 유도하는 상세한 프로토콜을 제공한다.

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Protocol

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이 프로토콜은 광저우 의과 대학 제 2 부속 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 쥐는 남부 의과 대학의 동물 센터에 의해 제공되었다. 실험 설계는 도 1에도시되어 있다.

1. 동물 및 계측기

  1. 250 ± 10g의 8주된 남성 스프라그-Dawley 쥐를 사용하십시오.
  2. 쥐를 25°C의 주변 온도, 65%, 12/12-h 의 밝은-암흑 주기로 통제된 환경 조건 하에서 수술 전에 적어도 7일 동안 보관하십시오.
  3. 음식과 물을 제한 없이 제공합니다.
  4. 악기를 준비(그림 2A-E).

2. 폰에 혈액을 주입

  1. 실험에 적합한 체중을 가진 쥐를 선택하기 위해 수술 3 일 전에 다시 쥐를 무게.
  2. 모델링 하기 전에 3 일 동안, 정상적인 쥐 일시 중지 없이 균형 빔을 통과 할 수 있도록 하루 3 번 균형 빔에 걸을 쥐를 훈련.
  3. 마취 전에 가열 패드를 37 °C로 예열합니다.
  4. 스테레오탁스 프레임의 홀더에 마이크로드릴을 부착합니다.
  5. 쥐를 주입 50 mg/kg 케타민과 5 mg/kg 자일라진 peritoneally. 발가락 핀치 응답이 없을 때까지 기다립니다.
  6. 쥐를 입체 프레임으로 운반하는 경향이 있는 위치에 놓입니다. 이어바를 외이도 위에 올려 머리를 고정시세요. 주사의 왜곡을 피하기 위해 수평 위치에 두개골을 고정(도 2F).
  7. 입구와 콘센트 포트가 있는 스테레오탁스 코 콘을 통해 이소플루란(97.5% 산소 및 2.5%이소플루란)에 의한 마취를 유지한다.
  8. 눈 연고를 사용하여 각막을 촉촉하게 유지하십시오.
  9. 마이크로 면도기와 두개골 위의 머리를 면도.
  10. 그림 2F에도시된 바와 같이, 양측 측면 캔투스의 선에서 0.5cm 뒤로 두개골에 마커 펜이 있는 3cm 중간선을 그립니다.
  11. 표시된 중간선중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 회전하는 원을 그리며 엔토오딘 수술 스크럽을 발라주세요.
  12. 외과 커튼을 놓습니다.
  13. 표시된 중간 선을 따라 메스로 절개를 합니다.
  14. 면 봉봉을 사용하여 잠재적인 혈액을 제거하십시오.
  15. 두개골(그림 2G)을노출시키기 위해 두피 플랩의 각 면에 집게 조각을 놓습니다.
  16. 면봉을 0.9% 식염수에 담그고 두개골 뼈에서 결합 조직을 부드럽게 제거하여 결합 조직이 마이크로 드릴에 걸리지 않도록하십시오.
  17. 마커 펜을 통해 브레그마의 중심점을 원점으로 표시합니다.
  18. AP-9.0mm, 도0mm(도1B 및 표 1)에서 마이크로드릴을 사용하여 두개골 절제술(직경 1mm)을수행합니다. 이 점은 정맥 부비동(도 2G)에매우 가깝기 때문에 신중하게 진행하십시오.
  19. 스테레오탁스 프레임에서 마이크로드릴을 제거합니다.
  20. 100 μL 해밀턴 주사기를 스테레오탁홀더(그림 2K)에넣습니다. 사출 펌프 스위치를 켜고, 급속 흡입 버튼을 클릭하고, 흡면 헤파린 용액(100mL에서 100mL의 희석)을 100 μL로 클릭한 다음 혈액 응고가 너무 빨리 방지하도록 완전히 배수합니다.
  21. 클로르헨시딘과 75% 알코올 수술 스크럽을 뿌리부터 끝까지 3번 이상 꼬리에 바르면 피부를 소독하고, 흥분을 완화하고, 꼬리 정맥을 팽창하여 주사성공률을 높입니다.
  22. 1 mL 주사기에 두피 침술을 부착합니다.
  23. 꼬리 끝에서 3cm 의 측면 꼬리 정맥에 두피 침술을 삽입하고 혈액 150 μL(그림 2H)를복용하십시오.
  24. 1 mL 주사기에서 두피 침술을 제거합니다.
  25. 혈액을 튜브로 옮기십시오(도2I).
    참고: 혈액 응고를 방지하기 위해 신속하게 전달합니다.
  26. 수술 용 장갑을 변경합니다.
  27. 인출 모드를 선택하고, 볼륨을 100 μL로 설정하고, 속도를 200 μL/min로 설정하고, RUN 버튼을 클릭하고, 100 μL의 혈액을 해밀턴 주사기(그림2J)로흡인시킵니다.
  28. 인퓨즈 모드를 선택하고 속도를 1 μL/분으로 설정합니다.
  29. 팁이 뇌 표면 아래 9.2 mm에 도달할 때까지 주사기를 전진시다(그림1C도 2L).
  30. 달리기 버튼을 클릭하고, 1 μL/min(표1)의속도로 혈액의 처음 10 μL을 주입합니다.
  31. 주사를 멈추고 주사기가 20분 동안 제자리에 두어 혈액이 지주막 공간으로 흘러 들어가는 것을 방지하십시오.
  32. 팁이 뇌 표면 아래 9.0mm에 도달할 때까지 주사기를 철회합니다.
  33. 잔류 혈액이 완전히 주입 될 때까지 1 μL / 분의 동일한 속도로 주사를 다시 시작합니다.
  34. 혈류를 피하기 위해 주사기를 10 분 동안 위치에 둡니다.
  35. 뇌에서 주사기를 천천히 제거합니다.
  36. 뼈 시멘트를 사용하여 두개골 구멍을 덮습니다.
  37. 시멘트가 마르면 상처를 4-0 폴리아미드 봉합사 필라멘트로 봉합합니다. 3 또는 4 개의 스티치를 바느질 한 후 2-1-1 표준 수술 매듭을 묶습니다.
  38. 감염을 방지하기 위해, 페니실린 (0.25 mL, 80 IU 4 mL 식염수로 희석)와 쥐를 주입하여 회귀적으로 주입하십시오.
  39. 부차아톨 타르트(2.5 mg/kg)로 쥐를 피하시키고 수술 후 24시간까지 수술 후 통증을 완화하기 위해 2시간마다 주사를 반복합니다.
  40. 그것은 완전히 마취에서 회복 될 때까지 쥐를 15 분마다 관찰. 케이지 아래에 난방 패드가 있는 오리지널 케이지로 되돌아갑니다. 쥐에게 희생될 때까지 음식과 물에 무료로 접근할 수 있도록 하십시오.

3. 행동 테스트

참고: 밸런스 빔 테스트, 사지 배치 테스트 및 수정된 Voetsch 신경 점수를 포함하여 모델링 후 1일, 3일째, 7일 및 14일째에 행동 테스트를 수행합니다.

  1. 밸런스 빔테스트(11).
    참고: 이것은 힌드림의 감각 운동 기능을 검사하기 위한 시험입니다.
    1. 빔(너비 3cm × 70cm)이 바닥 위 20cm임을 보장하기 위해 장치를 준비하였다.
    2. 좁은 진입로가 있는 빔의 뒷쪽 끝에 어두운 상자를 놓습니다.
    3. 광선의 머리 끝에, 빔을 통과하고 목표 상자를 입력 하는 쥐를 동기를 부여하는 데 사용되는 백색 잡음 생성기와 밝은 광원을 배치합니다.
    4. 동물이 골 상자에 들어갈 때 소음과 빛을 중지합니다. 머리 끝에서 골 상자(초)까지의 대기 시간과 빔을 통과하는 동안 뒷다리의 성능을 기록합니다.
    5. 다음과 같이 성능 점수를 기록 : 0, 꾸준한 자세와 균형; 1, 빔의 그립 측면; 2, 1 뒷다리 떨어지는 빔을 포옹; 3, 2 개의 사지가 떨어지거나 60 s 이상 빔 주위를 회전하여 빔을 껴안습니다. 4, 빔에 균형을 시도 >40 s, 하지만 떨어져 떨어진다; 5, 빔에 균형을 시도 >20 s, 하지만 떨어져 떨어진다; 및 6, 빔 <20s에 균형이나 균형을 시도하지 않고, 떨어진다.
  2. 사지 배치 테스트
    참고: 사지 배치 테스트는 쥐의 감각 운동 기능을 평가하기 위해 6개의 매개 변수로 비전, 터치 및 프로프리오셉션의 3개의 독립적인 자극을 검사합니다. 총 신경 기능 점수는 0에서 12까지 다양했습니다. 테스트 전에 쥐는 처리에 습관화되어야합니다.
    1. 쥐를 뒤로 잡고 10cm 높이에서 천천히 테이블에 놓습니다. 일반적으로 쥐는 앞다리를 뻗어 테이블에 놓습니다.
    2. 쥐를 뒤로 잡고 테이블 가장자리를 향합니다. 앞다리의 반응이 관찰됩니다. 일반 쥐는 앞다리를 테이블에 놓습니다.
    3. 쥐가 테이블의 가장자리를 잡게 합니다. 일반 쥐는 턱을 사용하여 코와 코 머리가 테이블 가장자리를 만지지 않도록합니다.
    4. 테이블에 쥐를 넣고 쥐의 어깨 뒤에서 테이블 가장자리를 향해 부드러운 측면 압력으로 쥐를 밀어 내고 앞다리와 뒷다리의 배치를 관찰합니다. 일반 쥐는 앞다리와 뒷다리로 가장자리를 잡을 것입니다.
    5. 테이블에 쥐를 놓고 얼굴을 가장자리쪽으로 놓고 뒤쪽에서 가장자리로 부드럽게 밀어 넣습니다. 일반 쥐는 앞다리로 가장자리를 잡을 것입니다.
    6. 테이블에 쥐를 뒤로 모서리에 놓고 뒤쪽으로 테이블 가장자리로 밀어 넣습니다. 뒷다리의 반응을 관찰한다. 일반 쥐는 뒷다리로 가장자리를 잡을 것입니다.
    7. 테이블 가장자리에 앞다리 또는 뒷다리의 배치를 평가합니다. 다음과 같이 점수를 기록 : 0, 아니 배치; 1, 미완성 및/또는 지연배치; 2, 즉각적이고 완전한 배치.
  3. 수정된 Voetsch 신경 점수8
    참고: 수정된 Voetsch neuroscore는 14개의 매개변수를 포함하는 감각 운동 능력의 척추 브로바실라 스케일 점수입니다: 머리 운동, 활동, 청각, 통증 반사, 각막 반사, proprioception, 목 감각, 탐사, 원형, 축 몸통 감각, 4 다리 운동, 앞다리 운동, 등반, 그리고 보행. 각 매개 변수의 점수는 0 (완전한 신경 적자)에서 3 (신경 학적 적자 없음)에 이르기까지 다양합니다. 총 신경 기능 점수는 0에서 42까지 다양합니다.
    1. 쥐를 테이블 위에 놓고(길이 × 35cm)를 5분간 이동합니다. 머리의 자발적인 움직임을 관찰 : 모든 차원에서 이동, 3; 한쪽을 선호, 2; 1면으로만 이동, 1; 일방적인 면으로 구부러져 0.
    2. 쥐를 테이블 위에 놓고(길이 × 35cm)를 5분간 이동합니다. 활동은 완전히 반응하는 3으로 정의됩니다. 적당히 반응하는, 2; 최소한의 반응, 1; 혼수 상태에, 0.
    3. 두개골 순환을 관찰 : 양자, 3 회전; 1면, 2면을 선호합니다. 1면, 1개까지만; 1면, 0으로 떨어졌다.
    4. 앞다리 운동을 평가하십시오: 평등하고 양자 운동, 3; 약간의 비대칭, 2; 위대한 비대칭, 1; 파레시스, 0.
    5. 4 팔다리 운동을 평가: 동등하고 양자 운동, 3; 약간의 비대칭, 2; 위대한 비대칭, 1; 파레시스, 0.
    6. 쥐가 고정되어 있을 때, 귀 꼬집을 수행하여 고귀를 자극하고 통증 반사를 테스트합니다: 자극에서 신속하고 대칭적으로 이동, 3; 자극에서 천천히 또는 비대칭으로 이동, 2; 통증에 대한 응답으로 일부 움직임을 보여줍니다, 1; 반응 없음, 0.
    7. 쥐가 고정되어있을 때, 청력을 테스트하기 위해 쥐의 몸의 양쪽에 소음을 확인 : 손가락 마찰, 3; 손가락의 스냅, 2; 큰 박수, 1 과 아니 놀라운, 0.
    8. 프로프리오셉션을 확인하려면, 양쪽에 쥐의 비브리사에 무딘 막대기로 각각 터치하고 자극에 대한 반응을 관찰하십시오: 터치에 반응, 3; 한쪽에 반응 감소, 2; 양쪽에 감소, 1; 결석, 0.
    9. 몸통 축 감각을 평가하려면 쥐의 몸 양쪽에 무딘 막대기를 놓고 자극에 대한 반응을 관찰하십시오: 자극에 대한 활발하고 대칭적인 반응, 3; 약간 감소 또는 비대칭 반응, 2; 크게 감소 및 비대칭 반응, 1 및 반응 없음, 0.
    10. 각막 반사를 테스트하려면 쥐를 잡고 면봉으로 양쪽의 각막을 빠르게 터치하십시오: 두 눈은 빠르게 닫히는 3; 한쪽에 반사를 감소, 2; 양쪽에 감소, 1; 결석, 0.
    11. 목의 감각을 확인하려면, 쥐를 잡고 목을 만지도록 무딘 막대기를 사용하십시오 : 적극적으로 만지고 반응, 3; 터치에 느린 반응, 2; 크게 감소 반응, 1; 반응 없음, 0.
    12. 탐색을 관찰하려면 밝은 어두운 상자를 사용합니다.
      참고: 상자의 3분의 2는 열고 켜야 하며 나머지 상자는 덮여 있고 어둡습니다. 7cm 도어는 두 개의 구획을 연결합니다.
    13. 쥐를 5분 동안 등구에 놓고 어두운 구획을 5분 더 놓고 쥐의 활동을 기록할 수 있습니다. 한 방에 팔다리가 4개 놓으면 입구로 기록합니다. 다음과 같은 기록 점수: 빛과 어두운 구획에 적극적으로 도달, 3; 1 구획, 2에 도달; 자극 후 천천히 이동, 1; 무브먼트, 0.
    14. 등반 능력을 확인하려면 랫트를 가로지면에 30도 각도로 폭 20cm, 길이 70cm의 평면 바닥에 놓습니다. 다음과 같은 기록 점수 : 정상에 올라갈 수, 3; 장애인 등반, 2; 고정 그립, 1; 즉시, 0.
    15. 빔 워크를 검사하려면, 폭 3cm, 70cm 길이빔의 한쪽 끝에 쥐를 지면 위로 20cm, 기록 점수: 전체 빔을 탐구, 3; 빔의 일부를 탐구, 2; 일부 움직임과 폭포, 1; 무브먼트 없음, 0.
    16. 점을 계산합니다.

4. MRI에 의한 출혈 확인

  1. 수술 후 24시간에서 MRI 스캔을 수행합니다.
  2. 이소플루란으로 쥐를 마취시합니다 (유도의 경우 5 %, 유지 보수의 경우 1 %- 1.5 %).
  3. 쥐 뇌 어레이 코일에서 쥐의 머리를 송신 전용 볼륨 코일과 결합하여 고정하십시오.
  4. MRI 스캐너에 쥐와 함께 코일을 놓습니다. 치아와 이어 바를 통해 요람 내의 쥐를 고정하십시오.
  5. 폐회로 열 재킷을 사용하여 MRI 스캐닝 시 쥐의 체온을 37 ± 0.5°C에서 유지합니다.
  6. 파일럿 시퀀스를 수행하여 올바른 형상을 보장합니다.
  7. 빠른 스핀 에코 시퀀스를 적용하여 T2 가중치 검사를 수집합니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정합니다: 에코 시간(TE), 132ms; 반복 시간 (TR), 2,500 ms; 인수 매트릭스, 148 × 148; 시야, 100mm × 100mm; 12 슬라이스; 두께 1.5mm.
  8. 쥐를 케이지로 돌려놓습니다.

5. 총 해부학에 의한 출혈 확인

참고: 지정된 시점에서 쥐를 희생, 24 시간 및 수술 후 14d (그림 1D).

  1. 의식을 상실할 때까지 쥐를 5%의 이소플루란으로 마취시합니다. 그런 다음, 이산화탄소 (CO 2)(분당 케이지의 부피의 20-30%)로 안락사한다.
  2. 다음 징후를 사용하여 죽음을 확인 : 가슴이 상승하고 떨어지는, 만져 볼 수있는 심장 박동, 발가락 핀치에 대한 응답, 가난한 점막 색상, 색상 변화 또는 눈의 불투명도.
  3. 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
  4. 멸균 플랫폼에서 발을 테이핑하여 쥐를 보호합니다. 자궁 경부에서 중증 절개를 만들어 심부전을 흉부와 간으로 노출시하십시오. 쇄골을 따라 상선 여백에서 맨 왼쪽으로 측면 절개를 하고, 횡격막을 따라 시피드에서 맨 왼쪽으로 다른 측면 절단을 하여 심장을 노출시합니다. 흉곽 플랩을 들어 올리고 핀으로 플랫폼에 고정합니다.
  5. 바늘(27G)의 끝을 4°C 식염수를 함유한 관류 펌프에 연결한다. 아트리움에 들어가지 않도록 왼쪽 심실의 왼쪽 가장자리를 따라 바늘 끝을 심장으로 전진시키게 합니다. 관류 펌프를 켜서 팁이 왼쪽 심실에 있는지 확인한 다음 오른쪽 아트리움에서 잘라냅니다.
  6. 오른쪽 아트리움에서 배출된 액체가 무색으로 변하고 간이 흰색으로 변할 때 관류 펌프를 끕니다. 이 절차는 약 100mL 4 °C 식염수가 필요합니다.
  7. 쥐를 참수하고 가위와 집게를 사용하여 전체 뇌를 수확합니다. 얼룩종이로 뇌 표면에서 수분을 제거합니다.
  8. 전체 뇌를 -80°C에서 1분 동안 유지합니다.
    참고: 뇌가 동결 없이 절단될 수 있다면 이 단계는 건너뛸 수 있습니다.
  9. 등쪽 측이 위로 있는 관상 쥐 뇌 매트릭스에 뇌를 놓습니다.
  10. 뇌 표면의 구멍에 따라 0.21mm 두께의 스테인리스 스틸 블레이드를 출혈 센터에 삽입합니다.
  11. 다른 블레이드를 2mm 간격으로 뇌에 삽입합니다.
  12. 4°C에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액의 10mL에 뇌 섹션을 담급니다. 0.01 mmol/L 인산염 완충식식식(PBS)으로 헹구는다.
  13. 로스트랄에서 코달까지 섹션을 구성하고 이미지화합니다.

6. 파라핀 섹션과 헤마톡시린과 에신 (HE) 염색

  1. 실온에서 적어도 24 시간 동안 4 % PFA 솔루션으로 뇌를 수정하십시오. PFA의 부피는 뇌 볼륨의 5-10 배이어야한다.
  2. 출혈 센터에서 뇌를 블레이드와 관상 쥐 뇌 매트릭스를 통해 두 조각으로 잘라냅니다.
  3. 파라핀에 내장된 조직 블록을 만듭니다.
  4. 파라핀 임베디드 티슈 블록을 마이크로톤에 40 μm 두께 슬라이드로 관상으로 단면, 출혈 중심에서 시작하여 연속적으로 4개의 단면을 자르고 40°C 수조에 띄워 넣습니다.
  5. 40 μm 섹션(뇌 1개에 대해 총 8개의 슬라이드)을 깨끗한 유리 슬라이드에 장착하고 실온에서 밤새 건조한 공기건조를 제공합니다.
  6. 슬라이드를 56°C에서 1시간 동안 굽습니다.
  7. 자일렌에서 3 분, 3 번 씻으시면 씻으실 수 있습니다.
  8. 딥 섹션은 100% 에탄올에서 30회, 에탄올 100% 30회, 에탄올 95% 30회, 에탄올 95%에서 30회 더.
  9. 수돗물로 헹구고 맑아질 때까지 헹구는 것.
  10. 헤마톡슬린의 섹션을 약 10분 동안 담가 두면 됩니다.
  11. 수돗물로 헹구고 맑아질 때까지 헹구는 다.
  12. 에오신 얼룩에 섹션을 30 s에 담가 두는 다.
  13. 3-4딥 95% 에탄올, 100% 에탄올3-4 딥, 1분 동안 100% 에탄올, 100% 에탄올 + 자일렌(1:1)으로 10회 딥을 장착한 탈수 슬라이드.
  14. 1 분, 2 시간 자일렌섹션 청소.
  15. 비수성 장착 매체와 커버슬립을 사용하여 마운트하십시오.
  16. 실온에서 밤새 공기 의 섹션을 건조 한 다음 산.

7. 통계

  1. 그래프 패드 프리즘 6.0을 사용하여 학생의 t-테스트 또는 Mann Whitney U 테스트를 계산합니다.
    참고: 모든 데이터는 ± SE. 두 그룹 간의 차이점은 두 꼬리 학생의 t-test 또는 Mann Whitney U 시험으로 결정됩니다. P<0.05는 통계적 유의성으로 정의된다.

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Representative Results

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총 25마리의 동물이 사용되었고, 3마리는 대조를 위해, 30 μL에 6마리, 60 μL, 100μL 혈액 주사에 10마리가 사용되었다. 자가 혈액 (1/10)의 100 μL 주입을 받은 한 쥐는 수술 후 24 시간 이내에 사망했습니다.

행동 검사는 수술 후 1 일, 3 일, 7 일 및 14 일째에 실시되었습니다. 수술 후 다른 시점에서 대조군 및 혈액 주사 그룹에 대한 점수는 표 2에제시된다. 퐁틴 출혈은 점감 각막 반사 및 순환과 같은 신경 학적 적자를 일으켰다(그림 3B,C). 100 μL 혈액의 주사도 근상증을 유도하였다(도3A). 밸런스 빔 테스트, 사지 배치 테스트 및 수정된 Voetsch 신경 점수의 결과는 폰틴 출혈의 양이 증가함에 따라 신경 기능이 감소된 것으로 나타났습니다.

MRI 스캐닝은 수술 후 24시간 수행하였다(그림4). 혈액 주사 그룹에서, T2 서열에, 출혈은 폰의 바실라 부분에서 약간 과대강렬한 코어를 가진 위선적인 림으로 검출되었다. 다른 뇌 영역에서 MRI에 의해 검출된 출혈이없었다(그림 4). 출혈의 부피가 자가 혈액의 주사 량이 증가함에 따라 증가했습니다.

그 후 쥐는 수술 후 24시간, 14일째에 별도로, 2mm 두께의 단면이만들어졌다(그림 4). 출혈은 주사 부위를 둘러싸고 폰의 기지에서 분배되는 것을 검출했다. 100 μL 혈액 주사 군에서 출혈 주위에 약간의 부종이 있었다.

일부 쥐는 수술 후 3 일 희생되었고 파라핀은 HE 염색을 하기 위해 절개되었습니다. 결과는 혈액 주사 단에서, 심혈 영역에서 농축된 선동적인 세포(도 5CF)를보여주었다. 헤모글로빈은 그대로 적혈구(도5DG)내에함유되어 있습니다.

Figure 1
그림 1: 폰틴 출혈 모델의 회로도 도표. (A) 꼬리 정맥에서 자동 혈액 수집. (B) 드릴 위치의 회로도. (C) 사출 위치의 회로도. (D) 실험 적 디자인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 수술의 기기 및 절차. (A) 마취 기계. (B) 수술 기구. (C) 마이크로드릴. (D) 마이크로 사출 펌프. (E) 스테레오탁스 장치. (F) 두개골 의 중간에 표시된 선입니다. (G) 노란색 화살표가 드릴 위치를 가리킵니다. (H) 꼬리 정맥에서 혈액의 배수. (I) 혈액을 엡펜도르프 튜브로 옮기. (J) 해밀턴 주사기에 혈액을 흡인. (K) 두개골 구멍을 통해 해밀턴 주사기를 진행합니다. (L) 자가 혈액의 주입 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 행동 검사의 대표적인 결과. (A) 쥐에 있는 근상증은 자가 혈액의 100 μL을 주입하였다. (B) 자가 혈액의 60 μL을 주입 쥐에서 오른쪽에 있는 각막 반사를 감소시켰다. (C) 자가 혈액의 100 μL을 주입 쥐에서 양측의 각막 반사를 감소시켰다. (D) 쥐는 병변의 모순된 면에 동그라미를 친 자가 혈액의 60 μL을 받았다. (E) 밸런스 빔 테스트 결과. (F) 수정 된 Voetsch 신경 점수의 결과. (G) 사지 배치 테스트 결과. 선은 두 그룹(p < 0.05)의 상당한 차이를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: MRI 스캔 및 총 해부학의 대표적인 결과. MRI 스캐닝(Upper)은 폰틴 출혈 수술 후 24시간 후에 수행되었고, 쥐는 희생되어 2mm 뇌 섹션(Bottom)으로 절단되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: HE 염색의 대표적인 결과. 뇌는 수술 후 3d의 혈액 의 100 μL을 주입 쥐에서 수확되었다. (A) 전체 뇌 섹션. (B) 일반 폰틴 영역, (C) 페리-병변 영역 및 (D) 출혈 코어로부터의 낮은 필드. (E) 일반 폰틴 영역, (F) 페리 병변 영역 및 (G) 출혈 코어에서 높은 필드. 스케일 바는 100 μm이었습니다.

그림 S1: 수술 후 14일째에 총 해부학의 대표적인 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

심하지 않음 온화한 대규모
총 볼륨 30 μL 60 μL 100 μL
첫 번째 주입
스테레오전술 좌표 AP -9.0 mm; 위도 0; 정점 -9.2 mm
음량 10 μL 10 μL 10 μL
속도 1 μL/분 1 μL/분 1 μL/분
간격 시간 20분 20분 20분
두 번째 주입
스테레오전술 좌표 AP -9.0 mm; 위도 0; 정점 -9.2 mm AP -9.0 mm; 위도 0; 정가 -9.0 mm
음량 20 μL 50 μL 90 μL
속도 1 μL/분 1 μL/분 1 μL/분
바늘을 철수하기 전에 10분 10분 10분
AP: 전방 자세
위도: 측면
정점: 수직

표 1: 자가 혈액 의 주입.

쥐 번호 1일차 3일차 7일차 14일차
수정된 Voetsch 신경 점수
30 μL-1 33 34 38 41
30 μL-2 30 35 37 41
30 μL-3 34 37 40 42
60 μL-4 27 30 36 38
60 μL-5 23 28 34 39
60 μL-6 26 29 35 39
100 μL-7 16 25 31 36
100 μL-8 13 22 29 37
100 μL-9 14 21 26 36
샴-10 41 42 42 42
샴-11 42 42 42 42
샴-12 42 42 42 42
밸런스 빔 테스트
30 μL-1 1 0 0 0
30 μL-2 1 1 0 0
30 μL-3 2 1 0 0
60 μL-4 3 2 0 0
60 μL-5 4 2 0 0
60 μL-6 3 2 1 0
100 μL-7 5 4 3 1
100 μL-8 5 4 2 1
100 μL-9 4 4 2 1
샴-10 0 0 0 0
샴-11 0 0 0 0
샴-12 0 0 0 0
사지 배치 테스트
30 μL-1 11 12 12 12
30 μL-2 10 11 12 12
30 μL-3 10 11 12 12
60 μL-4 9 11 12 12
60 μL-5 8 9 9 11
60 μL-6 8 9 10 11
100 μL-7 4 5 9 11
100 μL-8 3 4 8 10
100 μL-9 2 4 7 8
샴-10 11 12 12 12
샴-11 12 12 12 12
샴-12 12 12 12 12

표 2: 행동 테스트 결과.

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Discussion

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본 연구에서는, 우리는 거대한 pontine 출혈 쥐 모형을 생성하는 프로토콜을 제공했습니다. 이 모형은 거대한 pontine 출혈의 병리학 적인 기계장치 그리고 예후에 대한 연구에 사용될 수 있습니다.

실험 내내 25마리의 쥐가 사용되었고, 그 중 한 마리만 죽었습니다. MRI의 확인, 총 해부학, 그리고 HE 염색이 방법은 매우 낮은 사망률과 높은 성공률을 가지고 있음을 나타냈다. 거대한 pontine 출혈 모델을 확립하기 위해 두 가지 문제가 해결되어야하며 주입 된 자가 혈액은 지주 막새 공간으로 누출되어 바늘 영역을 따라 네 번째 심실로 다시 흐르는 경향이 있습니다. 기존의 이중 주사 보통(총 60μL 자가혈액) 폰틴 출혈 모델은 첫 번째 문제를 해결하였습니다. 그러나, 여전히 소량의 혈액 역류가 있었다. 본 연구에서는, 역류 없이 100 μL 자가 혈액의 더 큰 양을 주입할 수 있도록 기존의 이중 주입 방법을 최적화하기 위한 몇 가지 전략이 적용되었다. 첫째, 대신 두 개의 다른 주입 반점이 사용되었다. 둘째, 헤파린은 주사 과정에서 응고로부터 혈액을 보호하기 위해 최소한의 잔류물로 주사기를 플러시하는 데 사용되었지만 주사 후 누설 및 역류를 촉진하기에는 충분하지 않았다. 셋째, 사출 시간이 길었고 사출 속도가 느렸고, 1 μL/min이었다. 더욱이, 소량의 자가 혈액만 처음 주입되었고, 20분 후에 두 번째 주사가 수행되었다. 그 후, 바늘은 10 분 후에 철회되었고,이 절차는 매우 느리게 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여, 30 μL 또는 60 μL의 자가 혈액을 주입한 쥐에 있는 체막 부 공간 또는 4구체로 흐르는 혈액은 거의 없었지만, 100 μL로 주입된 쥐에 있는 소량의 역류가 여전히 있었다.

행동 테스트는 밸런스 빔 테스트, 사지 배치 테스트 및 수정 된 Voetsch 신경 점수를 포함하여 모델링 후 1 일, 3 일, 7 일 및 14 일째에 수행되었습니다. 수술 후 첫날, 혈액 주사 그룹의 거의 모든 쥐는 일방적 또는 양자 각막 반사의 실종과 함께 순환 행동 (즉, 왼쪽 또는 오른쪽으로 돌리는)을 보였다. 자가 혈액은 폰틴의 중간선에 주입되었지만 뇌의 양쪽에 고르지 않게 분포되었습니다. 이것은 행동 테스트에서 다른 성과에 대한 이유인 것 같았습니다. 30 μL 또는 자가 혈액의 60 μL을 주입한 쥐의 활동 및 반응은 정상에 가깝게 느려졌다. 100μL의 혈액을 주입한 쥐에서 감각운동 기능이 현저히 약화되었고 반응이 좋지 않았다. 근육 강성 휴식 상태에서 일부 쥐에 나타났다. 1일째, 3일째 및 7일째에는 수정된 Voetsch 신경점수에서 대조군에 있는 30 μL, 60 μL 또는 자가 혈액의 100 μL 또는 100 μL를 주입한 쥐 사이에 명백한 차이가 있었습니다. 밸런스 빔 테스트 및 사지 장소 테스트에서, 30 μL 또는 60 μL의 혈액과 대조군에 있는 쥐를 언제 시점에서 주입한 쥐 사이에는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 100 μL의 자가 혈액을 주입한 쥐에서 밸런스 빔 테스트 및 사지 배치 테스트의 결과는 1일째와 3일째에 대조군과 비교했을 때 현저히 달랐다. 가능한 이유는 미묘한 신경 학적자를 발견하기에 충분히 민감하지 않은 수정 된 Voetsch 신경 점수에 비해 균형 빔 테스트 및 사지 배치 테스트에서 더 적은 평가 항목이 있기 때문입니다. 가벼운 증상을 가진 출혈 모델에서 행동을 평가하기 위해이 두 가지 방법을 사용하는 것은 부적절하지만 거대한 pontine 출혈 모델에 적용됩니다. 전반적으로, 수정된 Voetsch 신경 점수는 다른 pontine 출혈 모형에 있는 신경 기능을 포괄적이고 정확하게 평가하기 위하여 더 적합하다는 것을 밝혀졌습니다.

이 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 이전 이중 주사 방법에 기초하여, 제2 주사 위치가 변경되었고, 헤파린의 투여량은 온화한(30 μL) 및 중간(60 μL) 폰틴 출혈 모델의 누설 및 역류를 피하기 위해 조정되었다. 거대한 (100 μL) pontine 출혈 모델에서도 역류는 매우 제한적이었고 소수의 쥐에서만 발생했습니다. 이 방법은 높은 성공률과 낮은 사망률로 쉽게 수행 할 수 있습니다. 더욱이, 실험적인 pontine 출혈은 전체 질병 발달 및 처리의 효력을 조사하는 데 도움이되는 모델링 후 적어도 14 일 동안 장기간 관찰 될 수 있습니다. 이 모형의 중요한 전진은 pontine 출혈을 가진 환자의 현상을 모방했다는 것입니다. 임상적으로, 거대한 pontine 출혈은 가혹한 신경 결핍에서 유래합니다, 이전 pontine 출혈 모형은 온화한 현상을 가진 상대적으로 작은 출혈 량을 개발하는 동안. 이 모형에 있는 거대한 pontine 출혈은 pontine 출혈 환자에 있는 출혈 분포와 유사한 양측 폰에 분포합니다. 이전 실험 용 송신 출혈 모델에서 출혈은 일방적 인 폰9에만위치한다.

그러나 이 메서드의 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 첫째, 이 연구에서 pontine 출혈은 혈액의 주입에 의해 발생, 부분적으로 전환 하는 동안 헤아린, 혈액 응고 또는 주변 폰에서 심지어 항상성에 영향을 미칠 수 있는. 둘째,이 모델은 스테레오 탁스 장치 및 사출 펌프와 같은 특수 장비가 필요합니다. 셋째,이 모델은 자발적인 출혈을 모방 할 수 없습니다.

결론적으로, 이 연구는 이 분야에서 새로운 기계 및 치료 연구를 촉진할 수 있는 쥐에 있는 실험적인 심각한 거대한 pontine 출혈 모형을 만드는 방법을 제공했습니다.

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Disclosures

이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 중국 국립 과학 재단 (81471181 및 81870933)과 광저우 의과 대학 (0506308)의 오프닝 랩 프로그램 (0506308)과 중국 국립 과학 재단 (81701471)과 광저우 시 보건위원회 (20191A011083)의 과학 프로그램 및 중국 국립 과학 재단 (81501009)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100ml Saline solution Guangdong yixiang 191222201 C1 Preparing heparin diluent
100μl Microinjector Shanghai Gaoge Injection of autologous blood
1ml Syringe Jiangsu Zhiyu 20191014 Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol Shandong Lierkang Disinfection of rat tail
Adhesive tape Shanghai Jinzhong Surgicl instruments
Animal anesthesia system RWD R510-31S-6 Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam Jiangsu Saiangsi For neurological deficit scores
Blades Shanghai Feiying 74-C For gross anatomy
Bone cement Shanghai Xinshiji 20180306 Surgicl instruments
Brain tank Shenzhen LEIYEA For gross anatomy
Butorphanol tartrate Jiangsu Hengrui For pain management
Electric cranial drill Nanjing  Darwin biotechnology 20180090018 Making a burr hole on the skull
EP tube Nantong Surui Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream Yunnan pharmacy Eyes protection
HE dye liquor Solarbio G1120 For HE staining
Heating pad Dangerous Jungle JR01 Keeping warm
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmacal Company 190701 Preparing heparin diluent
IndoPhors Guoyao of China Sterilization
Isoflurane RWD 20080701 Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box Jiangsu Saiangsi For neurological deficit scores
Micro-injection pump Baoding Leifu TFD03-01-C Injection of autologous blood
MRI system Philips Confirmation of infarction in vivo
Needle holder Shanghai Jinzhong J32020 Surgicl instruments
Penicilin Guoyao of China Infection Prevention
Q-tips Jiangxi Songhe Surgicl instruments
Scalp heedle Jiangxi Hongda 20200313 Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel Shanghai Kaiyuan 170902 Surgicl instruments
Shearing scissors Shanghai Jinzhong Y00040 Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus RWD 900-00001-00 for surgical positioning
Surgical towel Xinxiang Huakangweicai 20070601 Surgicl instruments
Suture needle Shanghai Jinzhong Surgicl instruments
Suture scissors Shanghai Jinzhong J25041 Surgicl instruments
Tissue holding forcepts Shanghai Jinzhong J31080 Surgicl instruments

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References

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자동 혈액의 이중 주입에 의한 대규모 폰틴 출혈
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Tang, X., Wu, L., Luo, M., Qiu, Z., Jiang, Y. Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood. J. Vis. Exp. (171), e62089, doi:10.3791/62089 (2021).More

Tang, X., Wu, L., Luo, M., Qiu, Z., Jiang, Y. Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood. J. Vis. Exp. (171), e62089, doi:10.3791/62089 (2021).

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