Detaljerade instruktioner ges för att bygga en öppen källkod, modulär fluorimeter som är kompatibel med många billiga värmare för att utföra kvantitativ isotermisk nukleinsyraförstärkning i realtid.
Traditionella metoder för att upptäcka och kvantifiera nukleinsyror förlitar sig på polymeraskedjereaktion (PCR) och kräver användning av dyra termocyklister med integrerad fluorescensdetektering av ampliconer. Isotermisk nukleinsyraförstärkningsteknik eliminerar behovet av termisk cykling; Fluorescensbaserad detektion av produkter krävs dock fortfarande för kvantitativa resultat i realtid. Flera bärbara isotermiska värmare med integrerad fluorescensdetektering är nu kommersiellt tillgängliga; Kostnaden för dessa enheter är dock fortfarande ett betydande hinder för utbredd användning i resursbegränsade inställningar. Beskrivs här är ett protokoll för design och montering av en modulär, billig fluorimeter tillverkad av färdiga komponenter. Fluorimetern är innesluten i ett kompakt 3D-printat hölje och är utformad för att placeras ovanpå ett kommersiellt tillgängligt värmeblock som håller ett PCR-rör. Fluorimetern som beskrivs här var optimerad för att upptäcka fluorescein isothiocyanate (FITC) färgämne, men systemet kan modifieras för användning med färgämnen som ofta används som reportrar i realtid nukleinsyraförstärkningsreaktioner. Systemets kliniska tillämplighet visas genom att utföra realtids nukleinsyradetektering med två isotermiska förstärkningstekniker: rekombinaspolymerasförstärkning (RPA) för påvisande av dna för positiv kontroll som tillhandahålls i ett kommersiellt kit och omvänd transkriptionsslinga-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP) för påvisande av kliniskt meningsfulla nivåer av SARS-CoV-2 RNA.
Isotermisk förstärkningsteknik används ofta för detektion av nukleinsyror. Jämfört med traditionella PCR-metoder som kräver termocykling tillåter isotermisk förstärkning nukleinsyraförstärkning vid en enda temperatur, vilket möjliggör snabbare tid till resultat och bättre tolerans för hämmare1,2. En annan viktig fördel med isotermisk förstärkning är den minskade instrumenteringskomplexiteten. De flesta isotermiska förstärkningsreaktioner kräver endast ett värmeblock och en detekteringsmodalitet – antingen realtidsdetektering via fluorescensövervakning eller slutpunktsdetektering, till exempel genom sidoflöde eller gelelektrofores3,4. Fluorescensdetektering i realtid utförs genom detektion av fluorescens som produceras av interkalerande färgämnen som aktiveras i närvaro av dubbelsträngat DNA eller släckta fluorescerande sonder som aktiveras i närvaro av specifika dubbelsträngade DNA-sekvenser.
Medan kommersiellt tillgängliga bänktop isotermiska fluorimetrar finns, saknar många anpassning för analysimplementering. Många enheter kräver till exempel specifika eller företagsbaserade förbrukningsvaror, rekommenderar önskade leverantörer eller använder proprietär programvara för att få annonserade resultat. De flesta av dessa system kostar över $ 5,000 USD, vilket utgör ett betydande hinder för utbredd användning i resursbegränsade inställningar. Dessutom står användare i lågresursinställningar inför utmaningar att underhålla utrustning som är utformad för högresursinställningar på grund av hårda miljöförhållanden, svaga leveranskedjor för reservdelar och specialiserade verktyg som krävs för underhåll och reparation5. För att möta detta behov, som beskrivs här är utformningen och monteringen av en modulär och billig fluorimeter tillverkad av färdiga komponenter inneslutna i ett kompakt 3D-tryckt hus (Figur 1A–C) med två valfria konfigurationer. Den första konfigurationen av den här enheten använder kommersiellt tillgängliga glasfilter och en tärande spegel för att blockera överflödigt bakgrundsljus och har en total monteringskostnad på $ 830 USD. Medan dessa filter ofta används i fluorescensbaserade bildsystem, har byte av dyra högkvalitativa optiska filterfolier tidigare visat sig möjliggöra detektering av nukleinsyra6. Den andra konfigurationen av fluorimetern innehåller dessa billiga filter och ersätter de tärande speglarna med φ1/2″ balkdelare, vilket minskar den totala kostnaden för systemet från $ 830 till $ 450 USD.
Representativa bilder av sammansättningen visas för den första konfigurationen i figur 1 och figur 2, men analoga bilder för den andra konfigurationen finns i kompletterande fil 6. För att undvika behovet av specialiserad optisk inriktning har det optiska systemet utsedda områden för att placera varje optisk komponent och kan göras med en relativt låg 3D-skrivare, vilket möjliggör utbredd användning av designen. De enda skillnaderna i konstruktion och montering för de två konfigurationerna är de filer som används för 3D-utskrift och de optiska komponenterna som placeras i höljet. De yttre dimensionerna på det 3D-utskrivna höljet för båda systemen är desamma. En kostnadsjämförelse av de två systemen visas i tabell 1.
Som visas i figur 1A, för att bibehålla en liten formfaktor, består fluorimetern av Φ1/2″ (~ 12,5 mm) optik, tillsammans med kompakt belysning och detektion som placeras för att mäta signal genom toppen av PCR-röret. Systemet i figur 1 är utformat för att detektera färgämnen med toppexcitation och emissionsvåglängder nära 490 nm respektive 525 nm, inklusive FITC och närbesläktade färgämnen som SYBR och SYTO-9, som ofta används som reportrar i realtid nukleinsyraförstärkningsreaktioner7,8. Excitationskällan, optiska filter och detektor kan lätt ersätta komponenter som är kompatibla med olika fluorescerande färgämnen efter önskemål. Nukleinsyraförstärkningsreaktioner utförs vanligtvis i PCR-rör, och fluorimetern är utformad för att placeras ovanpå alla kommersiellt tillgängliga värmeblock som håller PCR-rör (Figur 1D) vilket möjliggör realtidsövervakning av isotermiska reaktioner. Lämpliga värmeblock finns i de flesta biomedicinska laboratorier och kan köpas för mindre än $ 500 USD.
Användningen av enkortsdatorer för att tillhandahålla ett lågkostnadsalternativ för styrning av bildteknik har tidigarevisats 9. Genom att bygga vidare på det arbetet används i detta protokoll ett enkortsdatordrivet grafiskt användargränssnitt (figur 1D) för att underlätta dataloggning i realtid och visning av resultat vid vårdpunkten, vilket eliminerar behovet av att en bärbar dator bearbetar eller visualiserar data. Fluorescensmätningar överfördes genom I2C-protokoll från ljussensorerna till en mikrokontroller och gjordes sedan tillgängliga för enkortsdatorn genom seriell kommunikation. Elektriska anslutningar för belysning och dataöverföring tillhandahölls genom förenklade ledningar och lödning på miniatyriserade brödskivor, vilket förnekade behovet av specialiserade kretskort .Electrical connections for illumination and data transfer provided through simplified wiring and lödning on miniaturized breadboards, negating the need for specialized printed circuit boards (PCB). Programvaran som krävs för att köra fluorimetern är tillgänglig via programvaruramverk med öppen källkod och koden som krävs för att köra enheten tillhandahålls i de kompletterande kodningsfilerna. Den kompletta fluorimetern kan monteras för mellan $ 450 till $ 830 USD, och resultaten visar att det ger exakta och tillförlitliga fluorescensmätningar för att övervaka isotermisk förstärkning i realtid av nukleinsyror.
Beskrivs här är en öppen källkod, låg kostnad, modulär, bärbar fluorimeter för kvantitativ fluorescensdetektering av isotermiska förstärkningsreaktioner. Projekt med öppen källkod underlättar snabbt och billigt underhåll med lätt tillgängliga reservdelar och ger användarna flexibiliteten att anpassa systemet till sina behov baserat på modulär design. Detta protokoll beskriver processen för montering av mekaniska, optiska och elektriska komponenter och validering av optisk prestanda. Dessutom visades fluorimeterns flexibilitet att övervaka två olika typer av isotermiska förstärkningsanalyser med betydligt olika temperatur-, volym- och fluorescenskrav, RPA exo och RT-LAMP. RPA utförs vid 39 °C i 50 μL-reaktioner som använder en sekvensspecifik FAM-märkt sond för fluorescensgenerering, medan RT-LAMP utförs vid 65 °C i en reaktionsvolym på 25 μL och använder ett intercalating färgämne för att rapportera förekomsten av det förstärkta DNA. Eftersom fluorescensmätningar görs genom toppen av PCR-rör med platta lock, kan fluorimetern upptäcka fluorescens från båda analysvolymerna, och värmekraven begränsas endast av det valda kommersiella värmeblocket. Dessutom är fluorescensintensiteten som produceras i RT-LAMP nästan i storleksordning större än den som produceras i RPA, på grund av de färg- kontra sondbaserade metoderna för fluorescenssignalgenerering. Det dynamiska området hos den valda optiska sensorn kan dock detektera och kvantifiera både signalerna, och subtraktionsalgoritmer vid baslinjen tar hänsyn till dessa skillnader för att producera tillförlitliga fluorescensavläsningar.
För att underlätta teknikspridning och minimera potentiella underhållskostnader användes en modulär design som är kompatibel med värmare som är allmänt tillgängliga i olika miljöer. I det nuvarande protokollet användes en vanlig torrblockvärmare. Samma optiska och elektriska design kan enkelt anpassas för andra kommersiellt tillgängliga värmare. Om en annan torrblocksvärmare ska användas krävs minimala förändringar i 3D-höljets konstruktion. Specifikt måste de nedre pinnarna i de optiska STL-filerna modifieras för att säkerställa korrekt anpassning till brunnarna i andra kommersiella värmeblock. Även om kapslingarna som visas i exemplen trycktes på en relativt lågsluts 3D-skrivare (se Materialförteckning),bör man se till att skrivarupplösningen och/eller utskriftstoleranserna är tillräckliga för att rymma de optiska komponenterna och gängade skären. I de stl filer som tillhandahålls, en tolerans på 0,01-0,02 tum lades till på vardera sidan av de optiska komponenterna i radiella och axiella riktningar baserat på de dimensioner som anges av tillverkaren. Detta säkerställer att alla optiska komponenter passar säkert i utskriften och att höljet helt blockerar överflödigt ljus från att komma in eller ut. För att säkerställa en korrekt presspassning för de gängade skären subtraherades en liknande tolerans på 0,01-0,02 tum från den medföljande diametern i CAD-filen.
RPA reaktioner övervakades framgångsrikt med hjälp av den första fluorimeter konfigurationen, medan RT-LAMP reaktioner kunde övervakas med någon av konfigurationerna. Förbättrad herrelös ljusavstötning av den första konfigurationen var nödvändigt för att övervaka de låga nivåerna av fluorescens som produceras av fluorogen sond i RPA reaktioner. RT-LAMP använder däremot ett intercalating färgämne för signalgenerering, vilket resulterar i en högre fluorescensintensitet som är kompatibel med det lägre dynamiska intervallet för den andra konfigurationen med hjälp av fotografiska filterfolier. Användare bör välja den fluorimeterkonfiguration som matchar fluorescenssignalen som genererar element-intercalating färgämne eller fluorogen sond-av deras analys.
En begränsning av detta system är att uppvärmning tillhandahålls av ett kommersiellt tillgängligt värmeblock som drivs genom ett standard vägguttag. Detta system skulle kunna vidareutvecklas för användning i områden som saknar tillförlitlig tillgång till el genom att inkorporera bärbara och uppladdningsbara batteripaket enligt andra grupper12. En annan begränsning är systemets relativt låga genomströmning, vilket möjliggör samtidig fluorescensmätning av endast två prover åt gången. Flera utskrifter av höljet kan placeras ovanpå samma värmeblock för att öka dataflödet; Den ljussensor som används har dock bara fyra unika I2C-adresser. Detta begränsar det maximala antalet prover som kan mätas samtidigt till fyra. En annan ljussensor med ett större antal unika I2C-adresser behövs för att ytterligare öka dataflödet.
The authors have nothing to disclose.
Särskilt tack till Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul och Christopher Goh för deras hjälp med provberedning. Författarna tackar Caroline Noxon för manuskriptrevisionen. Finansiering för detta arbete tillhandahölls från det amerikanska folket av USAID genom ett IAVI-forskningsanslag CCID 9204 under tilldelning AID-OAA-A16-00032 mellan IAVI och USAID.
1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
Microcontroller | Arduino | Nano | |
Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |