Kvantificering af bindingsinteraktionerne mellem Cu (II) og peptidrester i nærvær og fravær af kromoforer

Summary

Denne artikel fokuserer på brugen af elektronisk absorptionsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri til at undersøge og kvantificere termodynamikken af Cu (II) binding til peptider og proteiner.

Abstract

Kobber (II) er et essentielt metal i biologiske systemer, der giver unikke kemiske egenskaber til de biomolekyler, som det interagerer med. Det er blevet rapporteret at binde direkte til en række peptider og spille både nødvendige og patologiske roller lige fra medierende struktur til elektronoverførselsegenskaber til at give katalytisk funktion. Kvantificering af bindingsaffiniteten og termodynamikken af disse Cu (II) -peptidkomplekser in vitro giver indsigt i bindingens termodynamiske drivkraft, potentielle konkurrencer mellem forskellige metalioner for peptidet eller mellem forskellige peptider for Cu (II) og forekomsten af Cu (II) -peptidkomplekset in vivo. Imidlertid kan kvantificering af bindings termodynamikken være udfordrende på grund af et utal af faktorer, herunder at tage højde for alle konkurrerende ligevægte inden for et titreringseksperiment, især i tilfælde, hvor der mangler diskrete spektroskopiske håndtag, der repræsenterer peptidet, d-blokmetalionen og deres interaktioner.

Her tilvejebringes et robust sæt eksperimenter til nøjagtig kvantificering af Cu (II) -peptid termodynamik. Denne artikel fokuserer på brugen af elektronisk absorptionsspektroskopi i nærvær og fravær af kromoforiske ligander for at tilvejebringe det nødvendige spektroskopiske håndtag på Cu (II) og brugen af etiketfri isotermisk titreringskalorimetri. I begge eksperimentelle teknikker beskrives en proces for at redegøre for alle konkurrerende ligevægte. Mens fokus i denne artikel er på Cu (II), kan det beskrevne sæt eksperimenter gælde ud over Cu (II) -peptidinteraktioner og give en ramme for nøjagtig kvantificering af andre metalpeptidsystemer under fysiologisk relevante betingelser.

Introduction

Biologi har udviklet sig til at udnytte den forskellige kemi af metalioner, der er nødvendige for, at livet kan tilpasse sig og overleve i det omgivende miljø. Anslået 25%-50% af proteinerne bruger metalioner til struktur og funktion¹. Metalionens særlige rolle og redoxtilstand er direkte relateret til sammensætningen og geometrien af de biologiske ligander, der koordinerer den. Derudover skal redoxaktive metalioner såsom Cu(II) reguleres stramt, så de ikke interagerer med oxidationsmidler via Fenton-lignende kemi og danner reaktive iltarter (ROS)^2,3,4. At forstå bindingstilstandene og affiniteten, der driver dens biokemi, bør hjælpe med at belyse metalionens biologiske rolle.

Mange teknikker bruges til at studere bindingsinteraktionerne mellem metaller og peptider. Disse er for det meste spektroskopiske teknikker, men omfatter også computersimuleringer ved hjælp af molekylær dynamik, set gennem Cu (II) interaktioner med et fragment af amyloid beta (Aβ)⁵. En meget anvendt spektroskopisk teknik, der er tilgængelig for mange universiteter, er nuklear magnetisk resonans (NMR). Ved at bruge den paramagnetiske natur af Cu (II) var Gaggelli et al. i stand til at vise, hvor metalionen binder på en petide gennem afslapning af nærliggende kerner⁶. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan også bruges til at undersøge placeringen og tilstanden af den paramagnetiske metalionbinding⁷. Andre spektroskopiske teknikker såsom cirkulær dikroisme (CD) kan beskrive koordinationen omkring Cu (II) i systemer som tripeptidsystemer⁸, og massespektrometri kan vise støkiometri, og til hvilke rester metalionen koordineres gennem fragmenteringsmønstre ^9,10.

Nogle af disse teknikker, såsom NMR, er etiketfri, men kræver store koncentrationer af peptid, hvilket udgør udfordringer for undersøgelse. En anden almindelig teknik kaldet fluorescensspektroskopi er blevet brugt til at relatere positionen af en tyrosin eller tryptophan med slukning fra en Cu (II) ^11,12. På samme måde kan denne teknik vise strukturelle ændringer som følge af Cu (II) binding¹³. Udfordringerne med disse metal-peptidbindingsundersøgelser er imidlertid, at de undersøger kromoforiske aminosyrer som tyrosin, som ikke alle systemer har, at metalionen binder under en klassisk model, og at teknikken muligvis ikke er befordrende under fysiologiske forhold. Faktisk dukker der flere peptider op, der ikke indeholder sådanne kromoforiske aminosyrer eller binder under klassiske modeller, hvilket udelukker brugen af disse teknikker^14,15. Denne artikel beskriver tilgange til vurdering af bindingsegenskaber i disse scenarier under fysiologisk relevante forhold.

Biologiske ligander kan vedtage forskellige protoneringstilstande, der kan påvirke metalionbinding, såsom imidazolringen på histidin. Hvis pH ikke opretholdes konsekvent, kan resultaterne være indviklede eller modstridende. Af denne grund er buffere en væsentlig komponent i undersøgelsen af metal-protein / peptidinteraktioner. Imidlertid har mange buffere vist sig at interagere positivt med metalioner^16,17. Ud over at konkurrere med det biologiske molekyle af interesse kan bufferen have lignende koordinerende atomer, der kan være vanskelige at skelne fra de koordinerende atomer af peptidet eller proteinet. I denne undersøgelse er fokus på elektronisk absorptionsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som to komplementære teknikker til undersøgelse af Cu (II) -peptidinteraktioner med særlige overvejelser vedrørende buffervalg.

Elektronisk absorptionsspektroskopi er en hurtig, bredt tilgængelig teknik til undersøgelse af metalbindende interaktioner. Bestråling med lys i ultraviolette (UV) eller synlige bølgelængder kan føre til absorption af metalcentrerede d-d-bånd, som giver værdifuld information om ligandklassificering, metalgeometrier og tilsyneladende bindingsaffiniteter ^18,19. For disse komplekser kan direkte titreringer af metalioner i protein- eller peptidopløsninger kvantificere bindende stoichiometrier og tilsyneladende bindingsaffiniteter. I nogle tilfælde, såsom d⁵ eller d¹⁰ elektronkonfigurationer, absorberer komplekset ikke lys (dvs. er spektroskopisk tavs). I disse spektroskopisk tavse overgangsmetalkomplekser kan disse begrænsninger omgås ved hjælp af en konkurrerende ligand, der ved koordinering til metalionen giver detekterbare ladningsoverførselsbånd. I begge tilfælde er denne tilgang begrænset til kun at kvantificere støkiometri og tilsyneladende bindingsaffinitet, og der gives ingen indsigt i bindende entalpi uden tilnærmelser.

Som supplement til information opnået fra elektronisk absorptionsspektroskopi er ITC en attraktiv teknik til direkte og streng kvantificering af bindingentalpi²⁰. ITC måler direkte den varme, der frigives eller forbruges under en bindingshændelse, og da titreringen finder sted ved konstant tryk, er den målte varme entalpi for alle ligevægte (ΔH_ITC). Derudover kvantificeres støkiometrien af bindingshændelsen (n) og den tilsyneladende bindingsaffinitet (K_ITC). Fra disse parametre bestemmes den frie energi (ΔG_ITC) og entropi (ΔS_ITC), hvilket giver et termodynamisk øjebliksbillede af bindingshændelsen. Da det ikke er afhængig af lysabsorption, er ITC en ideel teknik til spektroskopisk tavse arter, for eksempel d⁵ eller d¹⁰ metalionkomplekser. Da kalorimetri imidlertid måler varme, kan eventuelle uovertrufne buffersystemer og uligevægte, der ikke er redegjort for, påvirke analysen negativt for nøjagtigt at bestemme metalionbindende termodynamik, og der skal udvises stor omhu for at løse disse faktorer²⁰. Hvis det udføres med den passende strenghed, er ITC en robust teknik til bestemmelse af termodynamikken af metalprotein / peptidkomplekser.

Her anvendes et kromoforisk lydløst kobberbindende peptid, C-peptid, til at demonstrere den komplementære anvendelse af de to teknikker. C-peptid er et 31-restspaltningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) dannet under insulinmodning; det mangler kromoforrester, men har vist sig at binde Cu(II) med fysiologisk relevant affinitet^14,15. Cu(II)-bindingsstedet består af sidekæderne af et glutamat og et aspartat samt N-terminalen af peptidet^14,15. Disse koordinerende atomer ligner meget dem i mange almindeligt anvendte buffersystemer. Her vises tandemanvendelsen af d-d- og ladningsoverførselsbåndene i elektronisk absorptionsspektroskopi og ITC til kvantificering af Cu (II) bindende termodynamik til C-peptid. Fremgangsmåden fra at studere Cu (II) binding til C-peptid kan anvendes på andre metalioner og protein / peptidsystemer.

Protocol

1. Elektronisk absorptionsspektroskopi: direkte titrering med bufferkonkurrence Forberedelse af prøver Der fremstilles en bufferopløsning af 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (bisTris) ved pH 7,4 ved anvendelse af ultrarent vand (>18 MΩ resistens). Fjern spormetalioner ved at inkubere med en harpiks med høj affinitet i mindst 2 timer med efterfølgende filtrering. Opløs eller fortynd en kendt mængde af peptidet i den metalfrie buffer.<b…

Representative Results

Målet var at kvantificere og bekræfte termodynamikken af Cu (II) binding til C-peptid ved hjælp af de komplementære teknikker til elektronisk absorptionsspektroskopi og ITC. På grund af den robuste karakter af elektronisk absorptionsspektroskopi blev der udført en direkte titrering af Cu (II) til 300 μM C-peptid (figur 1). Tilsætning af 150 μM Cu(II) forårsagede en øjeblikkelig stigning i båndet ved 600 nm, der tilskrives d-d-båndet cu(II), og fortsatte med at stige, indtil 300 …

Discussion

Denne artikel giver en robust metode til kvantificering af affinitet og termodynamik af Cu (II) binding til peptider. Komplekser med Cu (II) er ideelt egnet til at overvåge d-d-absorptionsbåndet på metalstedet på grund af dets d 9-elektronkonfiguration. Selvom udryddelseskoefficienten er lille, hvilket kræver større koncentrationer af komplekset for at give et pålideligt signal, kan titreringer af Cu (II) til peptid hurtigt give indsigt i bindingsstøkiometrien og den omtrentlige bindingsaffinitet. Det …

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance