Summary
Denne artikel fokuserer på brugen af elektronisk absorptionsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri til at undersøge og kvantificere termodynamikken af Cu (II) binding til peptider og proteiner.
Abstract
Kobber (II) er et essentielt metal i biologiske systemer, der giver unikke kemiske egenskaber til de biomolekyler, som det interagerer med. Det er blevet rapporteret at binde direkte til en række peptider og spille både nødvendige og patologiske roller lige fra medierende struktur til elektronoverførselsegenskaber til at give katalytisk funktion. Kvantificering af bindingsaffiniteten og termodynamikken af disse Cu (II) -peptidkomplekser in vitro giver indsigt i bindingens termodynamiske drivkraft, potentielle konkurrencer mellem forskellige metalioner for peptidet eller mellem forskellige peptider for Cu (II) og forekomsten af Cu (II) -peptidkomplekset in vivo. Imidlertid kan kvantificering af bindings termodynamikken være udfordrende på grund af et utal af faktorer, herunder at tage højde for alle konkurrerende ligevægte inden for et titreringseksperiment, især i tilfælde, hvor der mangler diskrete spektroskopiske håndtag, der repræsenterer peptidet, d-blokmetalionen og deres interaktioner.
Her tilvejebringes et robust sæt eksperimenter til nøjagtig kvantificering af Cu (II) -peptid termodynamik. Denne artikel fokuserer på brugen af elektronisk absorptionsspektroskopi i nærvær og fravær af kromoforiske ligander for at tilvejebringe det nødvendige spektroskopiske håndtag på Cu (II) og brugen af etiketfri isotermisk titreringskalorimetri. I begge eksperimentelle teknikker beskrives en proces for at redegøre for alle konkurrerende ligevægte. Mens fokus i denne artikel er på Cu (II), kan det beskrevne sæt eksperimenter gælde ud over Cu (II) -peptidinteraktioner og give en ramme for nøjagtig kvantificering af andre metalpeptidsystemer under fysiologisk relevante betingelser.
Introduction
Biologi har udviklet sig til at udnytte den forskellige kemi af metalioner, der er nødvendige for, at livet kan tilpasse sig og overleve i det omgivende miljø. Anslået 25%-50% af proteinerne bruger metalioner til struktur og funktion1. Metalionens særlige rolle og redoxtilstand er direkte relateret til sammensætningen og geometrien af de biologiske ligander, der koordinerer den. Derudover skal redoxaktive metalioner såsom Cu(II) reguleres stramt, så de ikke interagerer med oxidationsmidler via Fenton-lignende kemi og danner reaktive iltarter (ROS)2,3,4. At forstå bindingstilstandene og affiniteten, der driver dens biokemi, bør hjælpe med at belyse metalionens biologiske rolle.
Mange teknikker bruges til at studere bindingsinteraktionerne mellem metaller og peptider. Disse er for det meste spektroskopiske teknikker, men omfatter også computersimuleringer ved hjælp af molekylær dynamik, set gennem Cu (II) interaktioner med et fragment af amyloid beta (Aβ)5. En meget anvendt spektroskopisk teknik, der er tilgængelig for mange universiteter, er nuklear magnetisk resonans (NMR). Ved at bruge den paramagnetiske natur af Cu (II) var Gaggelli et al. i stand til at vise, hvor metalionen binder på en petide gennem afslapning af nærliggende kerner6. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan også bruges til at undersøge placeringen og tilstanden af den paramagnetiske metalionbinding7. Andre spektroskopiske teknikker såsom cirkulær dikroisme (CD) kan beskrive koordinationen omkring Cu (II) i systemer som tripeptidsystemer8, og massespektrometri kan vise støkiometri, og til hvilke rester metalionen koordineres gennem fragmenteringsmønstre 9,10.
Nogle af disse teknikker, såsom NMR, er etiketfri, men kræver store koncentrationer af peptid, hvilket udgør udfordringer for undersøgelse. En anden almindelig teknik kaldet fluorescensspektroskopi er blevet brugt til at relatere positionen af en tyrosin eller tryptophan med slukning fra en Cu (II) 11,12. På samme måde kan denne teknik vise strukturelle ændringer som følge af Cu (II) binding13. Udfordringerne med disse metal-peptidbindingsundersøgelser er imidlertid, at de undersøger kromoforiske aminosyrer som tyrosin, som ikke alle systemer har, at metalionen binder under en klassisk model, og at teknikken muligvis ikke er befordrende under fysiologiske forhold. Faktisk dukker der flere peptider op, der ikke indeholder sådanne kromoforiske aminosyrer eller binder under klassiske modeller, hvilket udelukker brugen af disse teknikker14,15. Denne artikel beskriver tilgange til vurdering af bindingsegenskaber i disse scenarier under fysiologisk relevante forhold.
Biologiske ligander kan vedtage forskellige protoneringstilstande, der kan påvirke metalionbinding, såsom imidazolringen på histidin. Hvis pH ikke opretholdes konsekvent, kan resultaterne være indviklede eller modstridende. Af denne grund er buffere en væsentlig komponent i undersøgelsen af metal-protein / peptidinteraktioner. Imidlertid har mange buffere vist sig at interagere positivt med metalioner16,17. Ud over at konkurrere med det biologiske molekyle af interesse kan bufferen have lignende koordinerende atomer, der kan være vanskelige at skelne fra de koordinerende atomer af peptidet eller proteinet. I denne undersøgelse er fokus på elektronisk absorptionsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som to komplementære teknikker til undersøgelse af Cu (II) -peptidinteraktioner med særlige overvejelser vedrørende buffervalg.
Elektronisk absorptionsspektroskopi er en hurtig, bredt tilgængelig teknik til undersøgelse af metalbindende interaktioner. Bestråling med lys i ultraviolette (UV) eller synlige bølgelængder kan føre til absorption af metalcentrerede d-d-bånd, som giver værdifuld information om ligandklassificering, metalgeometrier og tilsyneladende bindingsaffiniteter 18,19. For disse komplekser kan direkte titreringer af metalioner i protein- eller peptidopløsninger kvantificere bindende stoichiometrier og tilsyneladende bindingsaffiniteter. I nogle tilfælde, såsom d5 eller d10 elektronkonfigurationer, absorberer komplekset ikke lys (dvs. er spektroskopisk tavs). I disse spektroskopisk tavse overgangsmetalkomplekser kan disse begrænsninger omgås ved hjælp af en konkurrerende ligand, der ved koordinering til metalionen giver detekterbare ladningsoverførselsbånd. I begge tilfælde er denne tilgang begrænset til kun at kvantificere støkiometri og tilsyneladende bindingsaffinitet, og der gives ingen indsigt i bindende entalpi uden tilnærmelser.
Som supplement til information opnået fra elektronisk absorptionsspektroskopi er ITC en attraktiv teknik til direkte og streng kvantificering af bindingentalpi20. ITC måler direkte den varme, der frigives eller forbruges under en bindingshændelse, og da titreringen finder sted ved konstant tryk, er den målte varme entalpi for alle ligevægte (ΔHITC). Derudover kvantificeres støkiometrien af bindingshændelsen (n) og den tilsyneladende bindingsaffinitet (KITC). Fra disse parametre bestemmes den frie energi (ΔGITC) og entropi (ΔSITC), hvilket giver et termodynamisk øjebliksbillede af bindingshændelsen. Da det ikke er afhængig af lysabsorption, er ITC en ideel teknik til spektroskopisk tavse arter, for eksempel d5 eller d10 metalionkomplekser. Da kalorimetri imidlertid måler varme, kan eventuelle uovertrufne buffersystemer og uligevægte, der ikke er redegjort for, påvirke analysen negativt for nøjagtigt at bestemme metalionbindende termodynamik, og der skal udvises stor omhu for at løse disse faktorer20. Hvis det udføres med den passende strenghed, er ITC en robust teknik til bestemmelse af termodynamikken af metalprotein / peptidkomplekser.
Her anvendes et kromoforisk lydløst kobberbindende peptid, C-peptid, til at demonstrere den komplementære anvendelse af de to teknikker. C-peptid er et 31-restspaltningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) dannet under insulinmodning; det mangler kromoforrester, men har vist sig at binde Cu(II) med fysiologisk relevant affinitet14,15. Cu(II)-bindingsstedet består af sidekæderne af et glutamat og et aspartat samt N-terminalen af peptidet14,15. Disse koordinerende atomer ligner meget dem i mange almindeligt anvendte buffersystemer. Her vises tandemanvendelsen af d-d- og ladningsoverførselsbåndene i elektronisk absorptionsspektroskopi og ITC til kvantificering af Cu (II) bindende termodynamik til C-peptid. Fremgangsmåden fra at studere Cu (II) binding til C-peptid kan anvendes på andre metalioner og protein / peptidsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektronisk absorptionsspektroskopi: direkte titrering med bufferkonkurrence
- Forberedelse af prøver
- Der fremstilles en bufferopløsning af 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (bisTris) ved pH 7,4 ved anvendelse af ultrarent vand (>18 MΩ resistens). Fjern spormetalioner ved at inkubere med en harpiks med høj affinitet i mindst 2 timer med efterfølgende filtrering.
- Opløs eller fortynd en kendt mængde af peptidet i den metalfrie buffer.
BEMÆRK: Ved overvågning af d-d-bånd med små udryddelseskoefficienter21 skal der anvendes højere koncentrationer af peptid. Her var den endelige koncentration af C-peptid i bufferopløsning 300 μM (volumen afhænger af kuvettens størrelse). C-peptid blev syntetiseret ved fastfasepeptidsyntese og er detaljeret andetsteds i litteratur14. - Opløs en kendt masse CuCl2 i ultrarent vand for at fremstille en opløsning ved 10-15 mM.
BEMÆRK: Det er vigtigt først at opløse metalsalt i ikke-belagt vand for at forhindre nedbør. Andre Cu(II)-salte kan anvendes, men det skal sikres, at anionen er svagt koordinerende.
- Kørsel af eksperimentet
- Tænd for det elektroniske absorptionsspektrofotometer, og lad det varme op i ~ 15-20 minutter før brug. Start spektrofotometersoftwaren, og konfigurer parametrene såsom scanningsområde (200-900 nm), scanningshastighed (200 nm / s) og dobbeltstråle baseline-korrigeret (flere parametre er angivet i den supplerende fil).
- Saml en basislinje uden kuvetter eller prøver i strålebanerne.
- Brug to matchede kuvetter i dobbeltstrålespektrofotometeret til at indlæse den ene kuvette med 115 μL ultrarent vand og den anden kuvette med 115 μL af peptidprøven. Sørg for, at der ikke er luftbobler i kuvetterne, da disse vil forstyrre signalet.
- Kuvetten anbringes med ultrarent vand i referencestrålen og kuvetten med peptid i prøvestrålen.
- Saml absorptionsspektret af det metalfrie (apo) peptid.
- Der tilsættes en substøkiometrisk mængde (0,5 ækvivalenter, 150 μM) af Cu(II)-opløsningen i kuvetten med peptidprøven. Sørg for, at volumenet af tilsat Cu (II) er mindre end 3 μL, og registrer volumenet til analyse senere.
- Pipetter forsigtigt op og ned for at blande opløsningen, samtidig med at du undgår dannelse af luftbobler. Lad opløsningen reagere og ligevægte i 5 minutter og registrere absorptionsspektret.
- Tilsætningen af Cu(II)-alikvoter som i trin 1.2.6 gentages i peptidopløsningen for følgende ækvivalenter: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 og 5,0 (eller i alt 300, 450, 600, 900 og 1.500 μM). Sørg for at registrere det samlede volumen af Cu (II) tilsat og det samlede volumen af kuvetten.
BEMÆRK: Hvis der ønskes mere opløsning, skal du reducere afstanden mellem ækvivalenter. - Fjern prøvekuvetten, og rengør grundigt i henhold til producentens anvisninger.
- Tilsæt den bufferede opløsning uden peptid og registrer absorptionsspektret. Tilsætningen af Cu(II)-alikvoter gentages som i trin 1.2.5-1.2.8, idet absorptionsspektret registreres for hver Cu(II)-ækvivalent.
- Eksporter alle spektre som csv-filer til behandling. Rengør cuvetterne grundigt i henhold til producentens anvisninger, og sluk for spektrofotometeret.
- Behandling af data
- Indlæs alle spektre på et regnearksprogram.
- Træk det eneste bufferspektrum (0 μM Cu(II)) fra hvert andet spektrum for at fjerne eventuelle absorbanstræk fra selve bufferen.
- Hvert spektrum normaliseres for at tage højde for den fortynding, der fremkommer ved tilsætning af Cu(II)-opløsningen (trin 1.2.6). Se den supplerende fil, Eq (1)14 for et eksempel på normaliseringen, hvor vinitial er volumenet (115 μL) af peptid tilsat til kuvetten, vCu (II) er volumenet af Cu (II) opløsning tilføjet i trin 1.2.6, og Absbuffer subtraktioneret spektrum er de data, der er opnået i trin 1.2.7.
- Graf alle spektre sammen for at identificere regioner med forandring.
BEMÆRK: Typiske d-d-bånd fra Cu(II)-komplekser spænder fra 500 til 750 nm. Denne spektrofotometriske titrering kan være udfordrende på grund af den lille udryddelseskoefficient fra d-d-bånd, som er Laporte-forbudte overgange i oktaedrisk geometri21. Hvis absorbansen er for svag, er en alternativ tilgang at anvende kromoforiske ligander, der resulterer i ladningsoverførselsbånd ved binding til Cu (II) (se afsnit 2).
2. Elektronisk absorptionsspektroskopi: peptidkonkurrence med kromoforisk ligand
- Forberedelse af prøver
- 1,10-phenanthrolin (phen) opløses i ultrarent vand for at opnå en slutkoncentration på ~1 mM.
- Ud over prøvepræparatet beskrevet i punkt 1.1 for peptidet (trin 1.1.2) og Cu(II) (trin 1.1.3) fremstilles en 10 μM Cu(II) og 40 μM phenopløsning i buffer ([Cu(phen)3]2+). Sørg for, at lydstyrken fylder kuvetten.
- Kørsel af eksperimentet
- Det elektroniske absorptionsspektrofotometer startes som i trin 1.2.1 og 1.2.2, men scanningsområdet indstilles til 200-400 nm.
- I to matchede kuvetter skal du fylde den ene kuvette med 115 μL ultrarent vand og den anden kuvette med 115 μL af [Cu(phen)3]2+ opløsningen. Kuvetten anbringes med vand i referencestrålen og kuvetten med [Cu(phen)3]2+ opløsning i prøvestrålen.
- Saml absorptionsspektret af metal-ligandkomplekset.
- Tilsæt en støkiometrisk mængde (≈1 ækvivalenter, ≈10 μM) peptid til [Cu (phen)3]2+ opløsningen. Pipetter forsigtigt op og ned for at blande grundigt, men pas på ikke at indføre luftbobler. Optag mængden af tilsat peptid til fremtidig analyse.
BEMÆRK: Ved anvendelse af kuvetter, der indeholder 115 μL, giver tilsætning af 3,83 μL 300 μM peptid en endelig peptidkoncentration på 9,7 μM. - Inkuber opløsningen i 5 minutter for at nå ligevægt. Optag absorptionsspektret.
BEMÆRK: Hvis bindingsaffiniteten af metalpeptidet og metalliganden er ens, skal koncentrationen af tilsat peptid være i stort overskud. Sørg for at tage højde for det samlede volumen peptid tilsat til normalisering. - Tilsæt peptidallikvider i [Cu(phen)3]2+ opløsningen gentages for følgende omtrentlige ækvivalenter: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 og 26. Volumenet af tilsat peptid registreres, så den fortyndede koncentration kan bestemmes.
- Fjern prøven og rengør kuvetten grundigt i henhold til producentens anvisninger. Saml et spektrum af bufferen. Saml et spektrum af 50 μM peptid i bufferen.
- Eksporter alle data som csv-filer til behandling og rengør kuvetterne i henhold til producentens anvisninger.
- Behandling af data
- Indlæs spektrene på et regnearksprogram, og træk bufferspektret fra de andre spektre.
- Normaliser spektrene efter supplerende fil, Eq (2)14.
- Ved hjælp af udryddelseskoefficienten for [Cu(phen)3]2+ ved 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22 bestemmes koncentrationen af [Cu(phen)3]2+ med hver tilsætning af peptidet.
- For hver tilsætning af peptidet bestemmes koncentrationen af Cu(II)-peptidkomplekset ved at trække den resterende koncentration af [Cu(phen)3]2+, som bestemt i trin 2.3.2, fra den oprindelige koncentration af [Cu(phen)3]2+ (ved 0 μM peptid).
- Beregn koncentrationen af fri phen ligand ved ligningen i Supplemental File, Eq (3)14.
- Beregn koncentrationen af frit peptid ved hjælp af supplerende fil, Eq (4)14, hvor [peptid]lager repræsenterer det ufortyndede peptid titreret i kuvetten,V1 repræsenterer volumenet af tilsat lagerpeptid, V2 er det samlede volumen af kuvetten, og [Cu2+-peptid] bestemmes i trin 2.3.4.
- Den eksperimentelle bindingsaffinitet (Kex) beregnes ved hjælp af Eq (5) i supplerende fil23.
- Relatere dissociationskonstanten for Cu (II) -peptid til Kex ved Eq (6) 23 i supplerende fil, hvor Kd, Cu (II) -phen = 1,0 × 10-9 (se 22). Bestem gennemsnits- og standardafvigelsen fra alle de bestemte dissociationskonstanter.
BEMÆRK: Under et 4: 1-forhold mellem phen: Cu (II) findes [Cu (phen) 3] 2 +, [Cu (phen) 2] 2 + og [Cu (phen)] 2+ i opløsningen, og peptidet vil chelate Cu (II) væk fra arten ([Cu (phen)] 2+) med den svageste binding22.
3. Isotermisk titreringskalorimetri
- Forberedelse af prøver
- Der fremstilles en bufferopløsning af 15 mM 3-morpholinopropan-1-sulfonsyre (MOPS) ved pH 7,4 ved anvendelse af ultrarent vand (>18 MΩ modstand). Spormetalioner fjernes ved at inkubere med en harpiks med høj affinitet i mindst 2 timer med efterfølgende vakuumfiltrering gennem en flasketop 0,45 μm membran.
- Opløs en kendt masse CuCl2 i ultrarent vand for at forberede en opløsning af ≈50-100 mM. Denne Cu(II)-opløsning fortyndes i buffer for at opnå en 1,0 ml opløsning med en slutkoncentration på 1,4 mM Cu(II). Registrer det nøjagtige volumen af den anvendte CuCl2-opløsning .
- Opløs eller fortynd peptidopløsningen i buffer for at fremstille 450 μL af en 154 μM peptidopløsning. Sørg for, at den samme andel af yderligere ultrarent vand fra trin 3.1.2 tilsættes til peptidopløsningen, hvilket reducerer fortyndingsvarmen og øger signal-til-støj.
- Efter tilberedning af prøverne skal det sikres, at opløsningerne har samme pH-værdi, og om nødvendigt justeres i overensstemmelse hermed.
- Valgfrit trin: Afgas løsningerne for at minimere mikrobobler, der indlæses i ITC.
- Kørsel af eksperimentet
- Tænd for ITC. Start ITC-softwaren for at køre instrumentet. Vent på den første initialisering, som vil bede om at genhuse buret; Følg derefter instruktionerne på skærmen.
- Fjern dækslet fra referencecellen. Eventuelt vand fjernes fra referencecellen, og der skylles tre gange med 450 μL afgasset ultrarent vand.
- Træk langsomt ultrarent vand op til 450 μL-mærket på en påfyldningssprøjte, og pas på ikke at indføre luftbobler i sprøjten. Læssesprøjten indsættes i referencecellen, indtil den er ≈1 mm fra bunden, og injicer langsomt en del af opløsningen, indtil der er 150 μL tilbage i påfyldningssprøjten. Flyt sprøjtestemplet hurtigt op og ned med ≈25 μL flere gange for at løsne eventuelle bobler på celleoverfladen. Injicer langsomt, indtil stemplet når 100 μL-mærket på påfyldningssprøjten, hvorved i alt 350 μL ultrarent vand hældes i referencecellen, og referencecelledækslet udskiftes.
- Eventuel restopløsning fjernes fra prøvecellen, og der fyldes 450 μL 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) med en påfyldningssprøjte. Blødgør i 10 minutter for at sikre, at spormetalioner fjernes, fordi EDTA binder spormetaller.
- Fjern EDTA-opløsningen (med bundne spormetalioner), og skyl fyldesprøjten grundigt med rigelige mængder ultrarent vand.
- Rengør ITC i overensstemmelse med producentens anvisninger, skyl prøvecellen med ultrarent vand.
- Prøvecellen konditioneres ved skylning med 450 μL buffer mindst tre gange.
- Fjern bufferen, der konditionerer prøvecellen. Peptidopløsningen fyldes i prøvecellen ved hjælp af påfyldningssprøjten (følg trin 3.2.3).
- Titreringssprøjten skylles med 200 μL bufferopløsning. For at gøre dette skal du fjerne stemplet og bruge en mikropipette til at pipettere bufferen gennem hullet øverst på glastitreringssprøjten, gennem sprøjten og ud af nålen nedenfor.
- Sæt stemplet helt ind i titreringssprøjten.
- Dyp spidsen af titreringssprøjtenålen i metalopløsningen, og træk langsomt stemplet op, hvilket får metalopløsningen til at fylde sprøjten og resultere i et tomrumsvolumen øverst på glasdelen af titreringssprøjten. Fjern det meste af tomrumsvolumenet ved at dreje titreringssprøjten parallelt med gulvet, fjern stemplet, og vip glasdelen let mod gulvet. Titreringssprøjten rystes blidt, så opløsningen bevæger sig til enden af glasdelen af titreringssprøjten og fylder det meste af tomrumsvolumenet, men sørg for, at der er 2-3 μL tomrumsvolumen tilbage. Mens du holder sprøjten parallelt med gulvet, skal du sætte stemplet i igen.
- Hold titreringssprøjten lodret, dypp spidsen af nålen tilbage i metalopløsningen, og skub stemplet ned, indtil der ikke længere kommer luft ud af nålen. Ilæg titreringssprøjten ved langsomt at trække stemplet op til lige over 50 μL-mærket, mens du beholder spidsen af nålen i opløsningen.
- Sæt forsigtigt glasdelen af titreringssprøjten i buret og skru den, indtil den er fingertæt. Når der kommer en lille mængde opløsning ud af titreringssprøjten på grund af kompression af stemplet, skal du bruge en let delikat visker til forsigtigt at absorbere opløsningen uden at røre ved nålespidsen.
- Indsæt buret med titreringssprøjte i prøvecellen, og fastgør det sikkert.
- Konfigurer parametrene på ITC-softwaren. Start på Instrument control, og indstil omrøringshastigheden (typiske omrøringshastigheder fra 150 til 350 o / min) og den temperatur , som eksperimentet skal udføres ved (typisk 25 °C). Indtast sprøjten og cellekoncentrationerne i millimolar enheder under Eksperimentdetaljer.
- I afsnittet Eksperimentmetode skal du vælge Trinvis titrering. Klik på Opsætning og angiv 20 injektioner på 2,5 μL. Hvis der kræves mere opløsning for at observere bindingshændelsen, skal du øge antallet af injektioner og reducere volumenet pr. Injektion. Indtast tidsafstanden mellem hver injektion, så den er lang nok til, at signalet kan afbalanceres og vende tilbage til baseline, typisk 300 s.
- Klik på knappen Kør for at starte eksperimentet og angive, hvor dataene skal gemmes.
- Efter afslutningen af eksperimentet rengøres prøvecellen og titreringssprøjten.
- Kør alle eksperimenter i mindst tre eksemplarer for at sikre præcis dataindsamling.
- Kør et kontroleksperiment, hvor metalopløsningen titreres i bufferopløsningen (i fravær af peptid) for at sikre, at fortyndingsvarmen fra metalionen er lille, og at der ikke er nogen uafregnede ligevægte. Hvis fortyndingsvarmen er stor, skal du overveje et andet buffersystem, hvis det er muligt.
- Behandling af data
- Start ITC-analysesoftwaren, og indlæs datafilen til analyse.
- Gå til fanen Oprindelig plan, og undersøg termogrammet. Bemærk enhver eksogen varme udviklet eller absorberet fra luftbobler eller andre artefakter i termogrammet. Se efter pigge, der ikke skyldes injektion af metalopløsningen.
- Sørg for, at den basislinje, der genereres af analysesoftwaren, følger den del af dataene efter injektion og ligevægt. Hvis den afviger, skal du bruge oprindelige pivotpunkter til at justere den oprindelige plan. Sørg for, at integrationsregionerne inkluderer den top, der genereres fra injektion af metallet, men okkluder eventuelle luftbobler eller artefakter i termogrammet, der findes i trin 2. Træk basislinjen fra termogrammet.
BEMÆRK: Denne type manipulation anbefales kun, når flere termogram er indsamlet, så eksperimentatoren ved, hvad der er reelle data, og hvad der er en artefakt, da justering af baseline og integrationsregioner kan påvirke dataene drastisk. - Naviger til modelleringsvinduet for at begynde at tilpasse dataene, hvor analysesoftwaren viser de integrerede og koncentrationsnormaliserede data for hver injektion.
- Venstreklik på datumet for den første injektion for at fjerne den fra monteringsalgoritmen.
BEMÆRK: Dette er almindeligt, da der vil være mindre blanding mellem titrant- og prøvecelleopløsningen, hvilket fører til upræcis molær dispensering af den første injektion. - I afsnittet Modeller skal du vælge Blank (konstant) i rullemenuen Style , som er baseret på den endelige injektionsentalpi og trækkes fra hvert datapunkt, idet der tages højde for fortyndingsvarmen. Derudover skal du vælge Uafhængig (eller den bedste model til systemet) i den anden rullemenu Style , så de passer til dataene.
BEMÆRK: For standard 1:1-bindingsinteraktioner er den mest almindelige model Uafhængig. - Tilpas dataene ved hjælp af de to modeller ved at trykke på den grønne afspilningsknap med et Σ.
BEMÆRK: En anden software til behandling af ITC-data er SEDPHAT24. - Redegør for alle konkurrerende ligevægte i post hoc-analyser, der tidligere er rapporteret af Grossoehme et al. 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet var at kvantificere og bekræfte termodynamikken af Cu (II) binding til C-peptid ved hjælp af de komplementære teknikker til elektronisk absorptionsspektroskopi og ITC. På grund af den robuste karakter af elektronisk absorptionsspektroskopi blev der udført en direkte titrering af Cu (II) til 300 μM C-peptid (figur 1). Tilsætning af 150 μM Cu(II) forårsagede en øjeblikkelig stigning i båndet ved 600 nm, der tilskrives d-d-båndet cu(II), og fortsatte med at stige, indtil 300 μM Cu(II) blev tilføjet. Yderligere tilsætning over 300 μM Cu (II) øgede ikke absorptionen af d-d-båndet, hvilket indikerer mætning, og at Cu (II) binder til C-peptid i et 1: 1-kompleks. På grund af den relativt høje affinitet af bis-Tris til binding til Cu (II) (log K = 5,27)16 bør Cu(II)/C-peptidaffiniteten desuden have en nedre grænse i mikromolarområdet (log K > 6) for at chelatere metalionen væk fra bufferen. I dette system er præcis kvantificering af absorptionsbåndene udfordrende på grund af den lille udryddelseskoefficient.
For at omgå d-d-båndets lille udryddelseskoefficient blev en kromoforisk ligand, phen, anvendt som beskrevet ovenfor. C-peptid blev titreret til ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (figur 2A), og absorptionen fra ladningsoverførselsbåndet ved 265 nm faldt (figur 2B), hvilket indikerer, at C-peptid var i stand til at chelatere Cu(II) fra phenliganden. Ved nærmere inspektion var en stor koncentration af C-peptid (op til 140 μM) nødvendig for beskedent at udkonkurrere phenliganden (tabel 1). Dette er ikke overraskende i betragtning af de store sekventielle formationskonstanter for [Cu(phen)3]2+ (henholdsvis 9,0, 15,7 og 20,8 for log K1, β2 og β3)22. Analyse af spektrene viser, at Cu(II)/C-peptidbindingsaffiniteten ligger i området log K = 7,4-7,8 (tabel 1).
Guldstandarden for måling af den komplette termodynamik af en bindingsinteraktion er ITC. Figur 3 giver et repræsentativt termogram af Cu (II) titreret til C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4, hvilket giver konkurrencen om Cu (II). Her blev MOPS-buffer brugt i stedet for bis-Tris-buffer, fordi KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25 og ville give mindre konkurrence, så ITC nøjagtigt kan måle affiniteten (se diskussion). Ved at måle den varme, der forbruges eller udvikles blandt alle ligevægte, giver termogrammet en sigmoidal form. Indledende injektioner af Cu (II), før peptidet er mættet, resulterer i store mængder varme sammenlignet med fortyndingsvarmen. Forskellen i disse værdier af varme er ΔHITC. Bøjningspunktet beskriver to nyttige oplysninger. Den første er den bindende støkiometri af arten i sprøjten sammenlignet med arten i cellen (dvs. Cu (II): C-peptid er 1: 1). For det andet er hældningen af pasformen ved bøjningspunktet direkte proportional med KITC. Efter indsamling af data i tre eksemplarer og i flere buffere blev der udført en post hoc-analyse20, hvor alle konkurrerende ligevægte er redegjort for (tabel 2), og den bufferuafhængige termodynamik bestemmes. For Cu(II)-binding til C-peptid er KCu(II)/C-peptid = 1 (± 1) x 108 og ΔHCu(II)/C-peptid = -8 (± 4) kJ mol-1. Ud fra disse bestemmes andre bindende termodynamiske parametre, hvor ΔG°Cu(II)/C-peptid = -46 (± 4) kJ mol-1 og ΔSCu(II)/C-peptid = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (se 15).
Figur 1: Overvågning af Cu(II)d-båndet ved tilsætning af 150, 300, 450, 600, 900 og 1.500 μM Cu(II) til 300 μM C-peptid i 50 mM bis-Tris, pH 7,4. D-d-båndet af Cu (II) øges ved 600 nm, indtil der dannes et 1: 1 Cu (II): C-peptidkompleks. Tidligere rapporterede Magyar og Godwin, at Cu (II) -bis-Tris-affinitet er log K = 5,2716. Denne titrering viser, at C-peptid kan udkonkurrere bufferen til at binde Cu (II) og indikerer en Cu (II) / C-peptidaffinitet i mikromolarområdet. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Stevenson et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dannelse af [Cu(phen)3]2+ og repræsentative elektroniske absorptionsspektre, der overvåger faldet i ladningsoverførselsbåndet ved tilsætning af C-peptid. (A) Reaktionsskemaet, der viser dannelsen af [Cu(phen)3]2+ og dets ladningsoverførselsbånd centreret ved 265 nm (ε° ≈ 90.000 M-1 cm-1)22. Formationskonstanterne er henholdsvis 9,0, 15,7 og 20,8 for log K1, β2 og β3 22. (B) Repræsentative elektroniske absorptionsspektre, der overvåger faldet i ladningsoverførselsbåndet fra [Cu(phen)3]2+ som C-peptidchelater Cu(II). Titreringen blev udført i 50 mM bis-Tris, pH 7,4. Dataanalyse er vist i tabel 1. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Stevenson et al.14. Forkortelse: MLCT = overførsel af metal til ligand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative termogram af Cu(II) titreret til C-peptid og buffer. (A) Dette repræsentative termogram viser titreringen af 1,4 mM Cu(II) til 154 μM C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4. Dataene passer til en one-site model med følgende parametre: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = -3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) En repræsentativ kontroltitrering på 1,4 mM Cu(II) til 15 mM MOPS, pH 7,4, i fravær af C-peptid, der ikke viser noget bindende termogram, som ses i panel A. Klik her for at se en større version af denne figur.
| [C-peptid] | En265 | [Cu(phen)3] 2+ | [phen] fri | [C-peptid] fri | [Cu(II)/C-peptid] | Kex (x108) | KdCu(II)/C-peptid | log KdCu(II)/C-peptid | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | Nd | Nd | Nd | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| Interval | 7.4-7.8 | ||||||||
Tabel 1: Repræsentative beregninger for koncentrationerne af arter i opløsning fra figur 2B. Alle koncentrationer er i mikromolar. Denne tabel er genoptrykt med tilladelse fra Stevenson et al.14.
| Equlibria | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H+ → MOPS-H+ | 0.097 | −21,0 | −2,04 |
| Cu(II) + C-peptid-H+ → Cu(II)/C-peptid + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3,40 | |||
| Χ = ΔHITC - 3,40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-peptid = −6,8 kJ mol-1 |
Tabel 2: Post hoc-analyse til bestemmelse af ΔHCu (II) / C-peptid. Som vist i figur 3,1,4 mM blev Cu(II) titreret til 154 μM C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4, i tre eksemplarer. Efter at have taget højde for alle konkurrerende ligevægte vist i tabellen, viser ΔHCu (II) / C-peptid at være -8,66 kJ mol-1. Antallet af protoner forskudt fra C-peptid af Cu (II) bestemmes ud fra hældningen af (ΔHITC + ΔHCu (II) -Buffer) vs ΔHBuffer-H , hvor data indsamles i flere buffere. Alle entalpiværdier findes i NIST25 eller bestemmes andetsteds i litteratur15. Alle konkurrerende ligevægte er redegjort for som beskrevet af Grossoehme et al.20 Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Stevenson et al.15.
Supplerende fil: Relevante ligninger, der anvendes i protokolafsnittet og yderligere parametre til elektronisk absorptionsspektrofotometer og ITC-opsætning. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel giver en robust metode til kvantificering af affinitet og termodynamik af Cu (II) binding til peptider. Komplekser med Cu (II) er ideelt egnet til at overvåge d-d-absorptionsbåndet på metalstedet på grund af dets d 9-elektronkonfiguration. Selvom udryddelseskoefficienten er lille, hvilket kræver større koncentrationer af komplekset for at give et pålideligt signal, kan titreringer af Cu (II) til peptid hurtigt give indsigt i bindingsstøkiometrien og den omtrentlige bindingsaffinitet. Det kan dog være udfordrende at skelne en forskel i spektre, hvis metallet koordineres af lignende atomer og geometrier fra både buffer og peptid. For at bestemme bindingsaffiniteten kvantitativt anvendes kromoforiske ligander såsom phen ofte på grund af deres symmetri-tilladte ladningsoverførsler med metalioner21. Ved at oprette en konkurrence mellem en kromoforisk ligand og et ikke-kromoforisk peptid og ved at kende metalets affinitet til liganden kan metalpeptidaffiniteten bestemmes direkte. Yderligere termodynamisk analyse ved hjælp af elektronisk absorptionsspektroskopi er udfordrende. For at kvantificere bindingentalpi ved hjælp af en teknik som UV-Vis-spektroskopi skal bindingsaffiniteten bestemmes ved flere temperaturer, og der udføres en van't Hoff-analyse. Denne analyse antager, at bindingsvarmen er nul, hvilket sjældent er sandt og giver således kun et skøn over bindingsentalpi20.
Isotermisk titreringskalorimetri er bedre egnet til at belyse et mere komplet overblik over termodynamikken i metal-peptidinteraktioner. I denne teknik titreres en metalion i peptidopløsningen, og varmen fra forskellige ligevægte måles direkte. Da eksperimentet udføres ved konstant tryk, er varmen målt af ITC lig med entalpi. ITC kan overvinde nogle af begrænsningerne ved elektronisk absorptionsspektroskopi, såsom at studere spektroskopisk tavse metalioner og ikke behøver at gøre antagelserne som gjort i van't Hoff-analysen. Men nogle gange genererer de reaktioner, der finder sted i ITC, lidt eller ingen varme og observeres derfor ikke. Dette kan omgås gennem enten stigende koncentrationer af metal og peptid eller ved at anvende en anden buffer med en anden protoneringsentalpi. Sidstnævnte er især nyttigt, hvis metalionen fortrænger flere protoner ved binding til peptidet. Imidlertid giver begge teknikker - ITC og elektronisk absorptionsspektroskopi - ortogonale metoder til at studere det samme system og supplere hinanden godt.
Der er mange udfordrende aspekter i begge teknikker, når man studerer metalioner, der binder til peptider. Mange metalioner er uopløselige eller sparsomt opløselige i vand. Dette forværres yderligere af udfældning af metalionen, når den tilsættes til bufferen. I ITC kan dette manifesteres ved et langsomt, gradvist skift i basislinjen og store mængder varme, der genereres, når metallet injiceres. Dette er tegn på store værdier af fortyndingsvarme, selv efter at peptidet ville være mættet af metalion. I elektronisk absorptionsspektroskopi manifesterer metalionudfældning sig gennem øget absorption ved lavere bølgelængder og ligner en bred top centreret i UV-regionen. I begge teknikker skal eksperimentatoren sikre, at metalionen er opløselig under de valgte betingelser (f.eks. Buffer, pH, temperatur, koncentration). En anden begrænsning for begge metoder kan vise sig gennem begrebet additionsordre. I nogle tilfælde kan et dannet metalkompleks være labilt, mens tilsætning af de samme reagenser i en anden rækkefølge ville gøre en anden mellemliggende art inert. Denne illustration af kinetisk versus termodynamisk kontrol forhindrer nøjagtig analyse af alle konkurrerende ligevægte.
Både ITC og elektronisk absorptionsspektroskopi er afhængige af konkurrencer mellem peptidet og enten buffer eller ligand til binding af metalionen. Her introduceres c-værdien, som hjælper med at identificere, om KITC kan bestemmes nøjagtigt af tilpasningsalgoritmen. C-værdien er defineret i Supplemental File, Eq (7)20, hvor n er støkiometri, KITC er den tilsyneladende bindingsaffinitet, og [prøvecelle] er koncentrationen af arten i prøvecellen. Når c-værdien er mellem 1 og 1.000, er den bestemte KITC nøjagtig. C-værdier under 1 kan dog kun give en øvre grænse for KITC, mens c-værdier over 1.000 kun kan give en nedre grænse20. Dette er værdien af at indsamle data fra komplementære teknikker: hvis noget savnes i en teknik på grund af dets begrænsninger, kan det blive fanget i sin komplementære teknik. I disse eksperimenter, hvis konkurrencen er stærkt begunstiget til en art (dvs. peptidets metalionaffinitet er meget større end bufferens affinitet), vil ligevægtene blive forskudt, hvilket gør det vanskeligt at fortolke. Dette er også vist i detaljer af Kocyla et al.23. For at omgå denne udfordring bruges introduktion eller udskiftning med en anden konkurrerende ligand eller valg af en anden buffer ofte til at øge konkurrencen mellem ligand og peptid for nøjagtig kvantificering. Dette skyldes, at forskellen mellem metalbuffer (eller metal-ligand) og metalpeptid-affiniteter ville gøre det muligt for c-værdien at falde inden for vinduet på 1 til 1.000. Det skal dog bemærkes, at anvendelsen af en konkurrerende ligand eller en anden buffer til kvantitativ analyse kræver, at de termodynamiske parametre for metalligand- eller metalbufferkomplekset er kendt eller kan bestemmes på anden måde.
Endelig kan nøjagtig kvantificering af peptidkoncentrationen være udfordrende. Nogle almindelige måder at kvantificere peptidkoncentrationer på er at måle specifikke aminosyrer og relatere mængden af disse aminosyrer til peptidsekvensen. For eksempel kan elektronisk absorptionsspektroskopi måle aromatiske rester som tyrosin, Ellmans reagens kan kvantificere antallet af frie thioler26, og Bradford-assays giver en indikation af, hvor mange rester der er til stede27. Desværre har peptider som den, der anvendes i denne undersøgelse, ikke aromatiske rester eller frie thioler, og Bradford-assays udgør udfordringer, når man sammenligner standarder fra massive proteiner med det lille peptid af interesse. I stedet blev peptidkoncentrationen bestemt af tørmasse. Selvom det ikke er ideelt og tilbøjeligt til koncentrationer, der er små overvurderinger af peptidkoncentrationen (da de tilsyneladende massemålinger sandsynligvis er højere end de faktiske peptidmasser på grund af tilstedeværelsen af salte), blev alle aliquoter til måling behandlet ens, hvilket giver mulighed for mere nøjagtige sammenligninger. I de spektroskopiske undersøgelser, hvis koncentrationen af frit peptid er lavere end forventet, repræsenterer den beregnede bindingsaffinitet en nedre grænse (Supplemental File, Eq (5) og Eq (6)). Der er udfordringer forbundet med begge viste teknikker, men med litteratur som vejledning kan mange overvindes.
Den eksperimentelle tilgang, der er beskrevet her, giver mulighed for nøjagtig kvantificering af metalpeptidbindende termodynamik. Både ITC og elektronisk absorptionsspektroskopi er ortogonale og giver indsigt i bindingsaffiniteten, men ITC giver mulighed for direkte entalpikvantificering. Når disse termodynamikker er kvantificeret, kan det udledes, om disse metalpeptidkomplekser kan dannes under fysiologiske forhold. Efterhånden som forståelsen af fysiologisk metalionflux vokser, kan forudsigelsen om, hvorvidt bindingsaffiniteten er stærk nok til kompleks dannelse in vivo , foretages. Desuden kan forskeren forudsige konkurrencer mellem flere metalioner for det samme peptid eller flere peptider for den samme metalion. Ser man på disse konkurrencer mellem metalion og peptider, kan forskeren begynde at forstå, hvad der bidrager til bindingsaffiniteten af metalpeptidkomplekset ved at analysere den frie energi i entalpi og entropibidrag. Termodynamik er en integreret del af værdsættelsen af det dynamiske samspil mellem metalioner og peptider, og ITC og elektronisk absorptionsspektroskopi giver håndtag til at forhøre disse systemer. De metoder, der er beskrevet her, kan udvides og bruges til at studere andre metalionbindingsinteraktioner med makromolekyler og kan have konsekvenser i fysiologiske processer, lægemiddeldesign og mere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
SC takker Whitehead Summer Research Fellowship. MJS takker startup-fondene og fakultetets udviklingsfond ved University of San Francisco. MCH anerkender finansiering fra National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) og National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
