Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63668
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

Summary

Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie om de thermodynamica van Cu (II) binding aan peptiden en eiwitten te onderzoeken en te kwantificeren.

Abstract

Koper (II) is een essentieel metaal in biologische systemen en verleent unieke chemische eigenschappen aan de biomoleculen waarmee het interageert. Er is gemeld dat het zich direct bindt aan een verscheidenheid aan peptiden en zowel noodzakelijke als pathologische rollen speelt, variërend van de bemiddelende structuur tot elektronenoverdrachtseigenschappen tot het geven van katalytische functie. Het kwantificeren van de bindingsaffiniteit en thermodynamica van deze Cu(II)-peptidecomplexen in vitro geeft inzicht in de thermodynamische drijvende kracht van binding, potentiële competities tussen verschillende metaalionen voor het peptide of tussen verschillende peptiden voor Cu(II), en de prevalentie van het Cu(II)-peptidecomplex in vivo. Het kwantificeren van de bindende thermodynamica kan echter een uitdaging zijn vanwege een groot aantal factoren, waaronder het verantwoorden van alle concurrerende evenwichten binnen een titratie-experiment, vooral in gevallen waarin er een gebrek is aan discrete spectroscopische handgrepen die het peptide, het d-blokmetaalion en hun interacties vertegenwoordigen.

Hier wordt een robuuste reeks experimenten geleverd voor de nauwkeurige kwantificering van Cu (II) -peptide thermodynamica. Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie in de aan- en afwezigheid van chromofoor liganden om de benodigde spectroscopische handgreep op Cu(II) te bieden en het gebruik van labelvrije isothermische titratiecalorimetrie. In beide experimentele technieken wordt een proces beschreven om rekening te houden met alle concurrerende evenwichten. Hoewel de focus van dit artikel ligt op Cu (II), kan de beschreven reeks experimenten van toepassing zijn buiten Cu (II) -peptide-interacties en een kader bieden voor nauwkeurige kwantificering van andere metaalpeptidesystemen onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Introduction

De biologie is geëvolueerd om gebruik te maken van de diverse chemie van metaalionen die nodig zijn voor het leven om zich aan te passen en te overleven in de omgeving. Naar schatting 25%-50% van de eiwitten gebruikt metaalionen voor structuur en functie1. De specifieke rol en redoxtoestand van het metaalion is direct gerelateerd aan de samenstelling en geometrie van de biologische liganden die het coördineren. Bovendien moeten redox-actieve metaalionen zoals Cu (II) strak worden gereguleerd, zodat ze niet interageren met oxidatiemiddelen via Fenton-achtige chemie om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te vormen 2,3,4. Het begrijpen van de bindingsmodi en affiniteit die de biochemie aansturen, zou moeten helpen de biologische rol van het metaalion op te helderen.

Veel technieken worden gebruikt om de bindingsinteracties van metalen en peptiden te bestuderen. Dit zijn meestal spectroscopische technieken, maar omvatten ook computersimulaties met behulp van moleculaire dynamica, zoals gezien door Cu(II) interacties met een fragment van amyloïde bèta (Aβ)5. Een veelgebruikte spectroscopische techniek die voor veel universiteiten toegankelijk is, is kernspinresonantie (NMR). Door gebruik te maken van de paramagnetische aard van Cu(II) konden Gaggelli et al. aantonen waar het metaalion zich bindt aan een petide door ontspanning van nabijgelegen kernen6. Elektron paramagnetische resonantie (EPR) kan ook worden gebruikt om de locatie en modus van de paramagnetische metaalionbindingte onderzoeken 7. Andere spectroscopische technieken zoals circulair dichroïsme (CD) kunnen de coördinatie over Cu(II) in systemen zoals tripeptidesystemen8 beschrijven, en massaspectrometrie kan stoichiometrie aantonen en op welke residuen het metaalion wordt gecoördineerd door fragmentatiepatronen 9,10.

Sommige van deze technieken, zoals NMR, zijn labelvrij, maar vereisen grote concentraties peptide, wat uitdagingen vormt voor studie. Een andere veel voorkomende techniek genaamd fluorescentiespectroscopie is gebruikt om de positie van een tyrosine of tryptofaan te relateren aan het blussen van een Cu (II) 11,12. Evenzo kan deze techniek structurele veranderingen vertonen als gevolg van Cu(II)-binding13. Uitdagingen met deze metaal-peptidebindingsstudies zijn echter dat ze chromofoor aminozuren zoals tyrosine onderzoeken die niet alle systemen hebben, dat het metaalion bindt onder een klassiek model en dat de techniek mogelijk niet bevorderlijk is onder fysiologische omstandigheden. Er zijn inderdaad verschillende peptiden in opkomst die dergelijke chromofoor aminozuren niet bevatten of binden onder klassieke modellen, waardoor het gebruik van deze technieken wordt uitgesloten14,15. Dit artikel beschrijft benaderingen voor het beoordelen van bindende eigenschappen in deze scenario's onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Biologische liganden kunnen verschillende protonatietoestanden aannemen die de metaalionbinding kunnen beïnvloeden, zoals de imidazoolring op histidine. Als de pH niet consistent wordt gehandhaafd, kunnen de resultaten ingewikkeld of tegenstrijdig zijn. Om deze reden zijn buffers een essentieel onderdeel in de studie van metaal-eiwit/peptide interacties. Van veel buffers is echter aangetoond dat ze gunstig interageren met metaalionen16,17. Naast het concurreren met het biologische molecuul van belang, kan de buffer vergelijkbare coördinerende atomen hebben die moeilijk te onderscheiden zijn van de coördinerende atomen van het peptide of eiwit. In deze studie ligt de focus op elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie (ITC) als twee complementaire technieken voor het bestuderen van Cu(II)-peptide-interacties, met speciale overwegingen met betrekking tot bufferkeuze.

Elektronische absorptiespectroscopie is een snelle, breed toegankelijke techniek voor het bestuderen van metaalbindingsinteracties. Bestraling met licht in de ultraviolette (UV) of zichtbare golflengten kan leiden tot absorptie van metaalgecentreerde d-d-banden, die waardevolle informatie opleveren over ligandclassificatie, metaalgeometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten18,19. Voor deze complexen kunnen directe titraties van metaalionen in eiwit- of peptideoplossingen bindende stoichiometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten kwantificeren. In sommige gevallen, zoals d5 of d10 elektronenconfiguraties, absorbeert het complex geen licht (d.w.z. is spectroscopisch stil). In deze spectroscopisch stille overgangsmetaalcomplexen kunnen deze beperkingen worden omzeild door een concurrerend ligand te gebruiken dat, bij coördinatie met het metaalion, detecteerbare ladingsoverdrachtsbanden oplevert. In beide gevallen is deze benadering beperkt tot het kwantificeren van alleen stoichiometrie en schijnbare bindingsaffiniteit, en wordt er geen inzicht in bindingsenthalpie gegeven zonder benaderingen.

Als aanvulling op informatie verkregen uit elektronische absorptiespectroscopie, is ITC een aantrekkelijke techniek voor directe en rigoureuze kwantificering van de bindende enthalpie20. ITC meet direct de warmte die vrijkomt of wordt verbruikt tijdens een bindingsgebeurtenis en aangezien de titratie plaatsvindt bij constante druk, is de gemeten warmte de enthalpie van alle evenwichten (ΔHITC). Daarnaast worden de stoichiometrie van de bindingsgebeurtenis (n) en de schijnbare bindingsaffiniteit (KITC) gekwantificeerd. Uit deze parameters worden de vrije energie (ΔGITC) en entropie (ΔSITC) bepaald, waardoor een thermodynamische momentopname van de bindingsgebeurtenis ontstaat. Omdat het niet afhankelijk is van lichtabsorptie, is ITC een ideale techniek voor spectroscopisch stille soorten, bijvoorbeeld d5 of d10 metaalionencomplexen. Aangezien calorimetrie echter warmte meet, kunnen niet-overeenkomende buffersystemen en niet-geregistreerde evenwichten de analyse nadelig beïnvloeden om de metaalionenbindende thermodynamica nauwkeurig te bepalen, en er moet grote zorg worden besteed aan het aanpakken van deze factoren20. Indien uitgevoerd met de juiste striktheid, is ITC een robuuste techniek voor het bepalen van de thermodynamica van metaal-eiwit / peptidecomplexen.

Hier wordt een chromoforisch stil koperbindend peptide, C-peptide, gebruikt om het complementaire gebruik van de twee technieken te demonstreren. C-peptide is een 31 residu splitsingsproduct (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) gevormd tijdens insulinerijping; het mist chromofore residuen, maar het is aangetoond dat het Cu(II) bindt met fysiologisch relevante affiniteit 14,15. De Cu(II)-bindingsplaats bestaat uit de zijketens van een glutamaat en een aspartaat en de N-terminus van het peptide14,15. Deze coördinerende atomen lijken sterk op die van veel gebruikte gebufferde systemen. Hier wordt het tandemgebruik van de d-d- en ladingsoverdrachtsbanden in elektronische absorptiespectroscopie en ITC getoond bij het kwantificeren van de Cu (II) bindende thermodynamica aan C-peptide. De benadering van het bestuderen van Cu (II) binding aan C-peptide kan worden toegepast op andere metaalionen en eiwit / peptide systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Elektronische absorptiespectroscopie: directe titratie met bufferconcurrentie

  1. Monstervoorbereiding
    1. Bereid een gebufferde oplossing van 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propaan-1,3-diol (bisTris) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit en daaropvolgende filtratie.
    2. Los een bekende hoeveelheid van het peptide op of verdun het in de metaalvrije buffer.
      OPMERKING: Bij het monitoren van d-d-banden met kleine extinctiecoëfficiënten21 moeten hogere concentraties peptide worden gebruikt. Hier was de uiteindelijke concentratie van C-peptide in gebufferde oplossing 300 μM (volume hangt af van de grootte van het cuvet). C-peptide werd gesynthetiseerd door vaste-fase peptide synthese en is elders in de literatuur beschreven14.
    3. Los een bekende massa CuCl2 op in ultrapuur water om een oplossing te maken op 10-15 mM.
      OPMERKING: Het is belangrijk om het metaalzout in eerste instantie op te lossen in niet-gebufferd water om neerslag te voorkomen. Andere Cu(II)-zouten kunnen worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat het anion zwak coördineert.
  2. Het experiment uitvoeren
    1. Schakel de elektronische absorptiespectrofotometer in en laat deze voor gebruik ~15-20 min opwarmen. Start de spectrofotometersoftware en configureer de parameters zoals scanbereik (200-900 nm), scansnelheid (200 nm / s) en dubbele bundel baseline-gecorrigeerd (meer parameters worden vermeld in het aanvullende bestand).
    2. Verzamel een basislijn zonder cuvetten of monsters in de bundelpaden.
    3. Gebruik twee overeenkomende cuvetten in de dubbelstraalspectrofotometer en laad één cuvette met 115 μL ultrapuur water en de andere cuvette met 115 μL van het peptidemonster. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de cuvetten zitten, omdat deze het signaal zullen verstoren.
    4. Plaats de cuvette met ultrapuur water in de referentiestraal en de cuvette met peptide in de monsterbundel.
    5. Verzamel het absorptiespectrum van het metaalvrije (apo) peptide.
    6. Voeg een sub-stoichiometrische hoeveelheid (0,5 equivalenten, 150 μM) van de Cu(II)-oplossing toe aan het cuvette met het peptidemonster. Zorg ervoor dat het volume cu(II) toegevoegd minder dan 3 μl is en noteer het volume voor analyse later.
    7. Pipetteer voorzichtig op en neer om de oplossing te mengen en vermijd het genereren van luchtbellen. Laat de oplossing reageren en balanceren gedurende 5 minuten en noteer het absorptiespectrum.
    8. Herhaal de toevoeging van Cu(II)-aliquots zoals in stap 1.2.6 in de peptideoplossing voor de volgende equivalenten: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 en 5,0 (of een totaal van 300, 450, 600, 900 en 1.500 μM). Zorg ervoor dat u het totale volume van cu(II) toegevoegd en het totale volume van de cuvette noteert.
      OPMERKING: Als er meer resolutie gewenst is, verkleint u de afstand tussen equivalenten.
    9. Verwijder de monstercuvette en reinig grondig volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
    10. Voeg de gebufferde oplossing zonder peptide toe en noteer het absorptiespectrum. Herhaal de toevoeging van Cu(II)-aliquots zoals in stap 1.2.5-1.2.8, waarbij het absorptiespectrum voor elk Cu(II)-equivalent wordt geregistreerd.
    11. Exporteer alle spectra als csv-bestanden voor verwerking. Reinig de cuvetten grondig volgens de instructies van de fabrikant en schakel de spectrofotometer in.
  3. Verwerking van de gegevens
    1. Laad alle spectra op een spreadsheetprogramma.
    2. Trek het buffer-only (0 μM Cu(II)) spectrum af van elk ander spectrum om eventuele absorptiekenmerken uit de buffer zelf te verwijderen.
    3. Normaliseer elk spectrum om rekening te houden met de verdunning als gevolg van de toevoeging van de Cu(II)-oplossing (stap 1.2.6). Zie het aanvullend bestand, Eq (1)14 voor een voorbeeld van de normalisatie waarbij vinitieel het volume (115 μL) van het aan de cuvette toegevoegde peptide is, vCu(II) het volume Cu(II)-oplossing is dat in stap 1.2.6 is toegevoegd, enAbs-bufferafgetrokken spectrum de gegevens zijn die zijn verkregen in stap 1.2.7.
    4. Maak alle spectra samen om gebieden van verandering te identificeren.
      OPMERKING: Typische d-d-banden van Cu (II) -complexen variëren van 500 tot 750 nm. Deze spectrofotometrische titratie kan een uitdaging zijn vanwege de kleine extinctiecoëfficiënt van d-d-banden, die Laporte-verboden overgangen zijn in octaëdrische geometrie21. Als de absorptie te zwak is, is een alternatieve benadering het gebruik van chromofore liganden die resulteren in ladingsoverdrachtsbanden bij binding aan Cu(II) (zie rubriek 2).

2. Elektronische absorptiespectroscopie: peptideconcurrentie met chromofoor ligand

  1. Monstervoorbereiding
    1. Los 1,10-fenanthroline (fen) op in ultrapuur water om een uiteindelijke concentratie van ~1 mM te verkrijgen.
    2. Bereid naast de in rubriek 1.1 beschreven monstervoorbereiding voor het peptide (stap 1.1.2) en Cu(II) (stap 1.1.3) een 10 μM Cu(II) en 40 μM fenoplossing in buffer ([Cu(phen)3]2+). Zorg ervoor dat het volume de cuvette vult.
  2. Het experiment uitvoeren
    1. Start de elektronische absorptiespectrofotometer zoals in stap 1.2.1 en 1.2.2, maar stel het scanbereik in op 200-400 nm.
    2. Laad in twee gematchte cuvetten één cuvette met 115 μL ultrapuur water en de andere cuvette met 115 μL van de [Cu(phen)3]2+ oplossing. Plaats de cuvette met water in de referentiebalk en de cuvette met [Cu(phen)3]2+ oplossing in de monsterbundel.
    3. Verzamel het absorptiespectrum van het metaal-ligandcomplex.
    4. Voeg een stoichiometrische hoeveelheid (≈1 equivalenten, ≈10 μM) peptide toe aan de [Cu(phen)3]2+ oplossing. Pipetteer voorzichtig op en neer om grondig te mengen, maar pas op dat u geen luchtbellen introduceert. Noteer het volume van het toegevoegde peptide voor toekomstige analyse.
      OPMERKING: Met behulp van cuvetten die 115 μL bevatten, levert het toevoegen van 3,83 μL van 300 μM peptide een uiteindelijke peptideconcentratie van 9,7 μM op.
    5. Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten om een evenwicht te bereiken. Noteer het absorptiespectrum.
      OPMERKING: Als de bindingsaffiniteit van het metaal-peptide en metaal-ligand vergelijkbaar zijn, zal de concentratie van toegevoegd peptide in grote overmaat moeten zijn. Zorg ervoor dat u rekening houdt met het totale volume van het toegevoegde peptide voor normalisatie.
    6. Herhaal de toevoeging van peptide aliquots in de [Cu(phen)3]2+ oplossing voor de volgende geschatte equivalenten: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 en 26. Noteer het volume van het toegevoegde peptide zodat de verdunde concentratie kan worden bepaald.
    7. Verwijder het monster en reinig de cuvette grondig volgens de instructies van de fabrikant. Verzamel een spectrum van de buffer. Verzamel een spectrum van 50 μM peptide in de buffer.
    8. Exporteer alle gegevens als csv-bestanden voor verwerking en reinig de cuvetten volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Verwerking van de gegevens
    1. Laad de spectra op een spreadsheetprogramma en trek het bufferspectrum af van de andere spectra.
    2. Normaliseer de spectra na Supplemental File, Eq (2)14.
    3. Gebruik de extinctiecoëfficiënt voor [Cu(phen)3]2+ bij 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, bepaal de concentratie van [Cu(phen)3]2+ bij elke toevoeging van het peptide.
    4. Bepaal voor elke toevoeging van het peptide de concentratie van het Cu(II)-peptidecomplex door de resterende concentratie van [Cu(phen)3]2+, zoals bepaald in stap 2.3.2, af te trekken van de beginconcentratie van [Cu(phen)3]2+ (bij 0 μM peptide).
    5. Bereken de concentratie van vrijphenligand met de vergelijking in Supplemental File, Eq (3)14.
    6. Bereken de concentratie van vrij peptide met behulp van Supplemental File, Eq (4) 14, waarbij [peptide] voorraad het onverdunde peptide vertegenwoordigt dat in het cuvette is getitreerd, V1 het volume van het toegevoegde voorraadpeptide vertegenwoordigt, V2 het totale volume van het cuvet en [Cu2 +-peptide] wordt bepaald in stap 2.3.4.
    7. Bereken de experimentele bindingsaffiniteit (Kex) met behulp van Eq (5) in aanvullend bestand23.
    8. Relateer de dissociatieconstante van Cu(II)-peptide aan Kex door Eq (6)23 in Supplemental File, waarbij Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (zie 22). Bepaal de gemiddelde en standaarddeviatie van alle bepaalde dissociatieconstanten.
      OPMERKING: Onder een 4:1 verhouding van fen:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+, en [Cu(phen)]2+ bestaan in de oplossing, en het peptide zal Cu(II) weg van de soort ([Cu(phen)]2+) met de zwakste binding22 chelate.

3. Isotherme titratiecalorimetrie

  1. Monstervoorbereiding
    1. Bereid een gebufferde oplossing van 15 mM 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit met daaropvolgende vacuümfiltratie door een membraan van 0,45 μm op fles.
    2. Los een bekende massa CuCl2 op in ultrapuur water om een oplossing van ≈50-100 mM te bereiden. Verdun deze Cu(II)-oplossing tot buffer om een oplossing van 1,0 ml met een eindconcentratie van 1,4 mM Cu(II) te verkrijgen. Noteer het exacte volume van de gebruikte CuCl2-oplossing .
    3. Los de peptideoplossing op of verdun deze in buffer om 450 μL van een 154 μM peptide-oplossing te maken. Zorg ervoor dat hetzelfde aandeel extra ultrapuur water uit stap 3.1.2 aan de peptideoplossing wordt toegevoegd, waardoor de verdunningswarmte wordt verminderd en het signaal-naar-ruis toeneemt.
    4. Zorg er na de bereiding van de monsters voor dat de oplossingen op dezelfde pH staan en pas deze indien nodig dienovereenkomstig aan.
    5. Optionele stap: Ontgas de oplossingen om microbubbels te minimaliseren die in de ITC zijn geladen.
  2. Het experiment uitvoeren
    1. Schakel de ITC in. Start de ITC-software om het instrument uit te voeren. Wacht op de eerste initialisatie, die zal vragen om de buret opnieuw te huisvesten; volg vervolgens de instructies op het scherm.
    2. Verwijder de klep uit de referentiecel. Verwijder al het water uit de referentiecel en spoel driemaal met 450 μL ontgast ultrapuur water.
    3. Zuig langzaam ultrapuur water op tot de 450 μL-markering van een oplaadspuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit worden gebracht. Steek de doseerspuit in de referentiecel totdat deze ≈1 mm van de bodem is en injecteer langzaam een deel van de oplossing totdat er 150 μL in de doseerspuit achterblijft. Beweeg de zuiger van de laadspuit meerdere keren snel op en neer met ≈25 μL om eventuele bellen op het celoppervlak los te maken. Injecteer langzaam totdat de zuiger de 100 μL-markering op de laadspuit bereikt, waardoor in totaal 350 μL ultrapuur water in de referentiecel wordt afgegeven en vervang het referentieceldeksel.
    4. Verwijder eventuele restoplossing uit de monstercel en laad met 450 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met behulp van een doseerspuit. Laat 10 minuten weken om ervoor te zorgen dat sporenmetaalionen worden verwijderd, omdat de EDTA sporenmetalen bindt.
    5. Verwijder de EDTA-oplossing (met gebonden sporenmetaalionen) en spoel de laadspuit grondig af met grote hoeveelheden ultrapuur water.
    6. Reinig de ITC in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant en spoel de monstercel met ultrapuur water.
    7. Conditioneer de monstercel door ten minste driemaal te spoelen met 450 μL buffer.
    8. Verwijder de buffer die de monstercel conditioneert. Laad de peptide-oplossing in de monstercel met behulp van de oplaadspuit (volg stap 3.2.3).
    9. Spoel de titratiespuit af met 200 μL gebufferde oplossing. Verwijder hiervoor de zuiger en gebruik een micropipette om de buffer door het gat aan de bovenkant van de glazen titratiespuit, door de spuit en uit de naald eronder te pipetteren.
    10. Steek de zuiger volledig in de titratiespuit.
    11. Dompel de punt van de naald van de titratiespuit in de metalen oplossing en trek de zuiger langzaam omhoog, waardoor de metalen oplossing de spuit vult en resulteert in een leeg volume aan de bovenkant van het glazen deel van de titratiespuit. Verwijder het grootste deel van het lege volume door de titratiespuit parallel aan de vloer te draaien, verwijder de zuiger en kantel het glazen deel enigszins naar de vloer. Geef de titratiespuit een zachte shake zodat de oplossing naar het einde van het glazen deel van de titratiespuit beweegt en het grootste deel van het lege volume opvult, maar zorg ervoor dat er 2-3 μL leegtevolume overblijft. Terwijl u de spuit evenwijdig aan de vloer houdt, plaatst u de zuiger opnieuw.
    12. Houd de titratiespuit rechtop, dompel de punt van de naald terug in de metalen oplossing en duw de zuiger naar beneden totdat er geen lucht meer uit de naald komt. Laad de titratiespuit door de zuiger langzaam omhoog te trekken tot net boven de 50 μL-markering terwijl de punt van de naald in de oplossing blijft.
    13. Steek voorzichtig het glazen deel van de titratiespuit in de buret en schroef tot het vingervast is. Wanneer een kleine hoeveelheid oplossing uit de titratiespuit komt als gevolg van compressie van de zuiger, gebruik dan een lichte delicate ruitenwisser om de oplossing zorgvuldig te absorberen zonder de punt van de naald aan te raken.
    14. Steek de buret met titratiespuit in de monstercel en bevestig deze stevig.
    15. Stel de parameters op de ITC-software in. Begin met Instrument Control en stel de roersnelheid in (typische roersnelheden variëren van 150 tot 350 RPM) en de temperatuur waarbij het experiment zal worden uitgevoerd (meestal 25 ° C). Voer de spuit - en celconcentraties in millimolaire eenheden in onder Experimentdetails.
    16. Selecteer in de sectie Experimentmethode de optie Incrementele titratie. Klik op Setup en geef 20 injecties van 2,5 μL op. Als er meer resolutie nodig is om de bindingsgebeurtenis te observeren, verhoogt u het aantal injecties en verlaagt u het volume per injectie. Voer de tijdsafstand tussen elke injectie in, zodat deze lang genoeg is om het signaal in evenwicht te brengen en terug te keren naar de basislijn, meestal 300 s.
    17. Klik op de knop Uitvoeren om het experiment te starten en op te geven waar de gegevens worden opgeslagen.
    18. Na voltooiing van het experiment reinigt u de monstercel en de titratiespuit.
    19. Voer alle experimenten ten minste in drievoud uit om nauwkeurige gegevensverzameling te garanderen.
    20. Voer een controle-experiment uit waarbij de metaaloplossing wordt getitreerd in de gebufferde oplossing (in afwezigheid van peptide) om ervoor te zorgen dat de verdunningswarmte van het metaalion klein is en dat er geen onverklaarde evenwichten zijn. Als de verdunningswarmte groot is, overweeg dan indien mogelijk een ander buffersysteem.
  3. Verwerking van de gegevens
    1. Start de ITC-analysesoftware en laad het gegevensbestand voor analyse.
    2. Navigeer naar het tabblad Basislijn en inspecteer het thermogram. Let op alle exogene warmte die is geëvolueerd of geabsorbeerd uit luchtbellen of andere artefacten in het thermogram. Zoek naar spikes die niet te wijten zijn aan injectie van de metalen oplossing.
    3. Zorg ervoor dat de basislijn die door de analysesoftware wordt gegenereerd, het gedeelte van de gegevens na injectie en equilibratie volgt. Als deze afwijkt, gebruikt u basislijndraaipunten om de basislijn aan te passen. Zorg ervoor dat de integratieregio's de piek bevatten die wordt gegenereerd door injectie van het metaal, maar sluit alle luchtbellen of artefacten in het thermogram uit die in stap 2 zijn gevonden. Trek de basislijn af van het thermogram.
      OPMERKING: Dit type manipulatie wordt alleen aanbevolen nadat meerdere thermogrammen zijn verzameld, zodat de experimentator weet wat echte gegevens zijn en wat een artefact is, omdat het aanpassen van de basislijn en integratieregio's de gegevens drastisch kan beïnvloeden.
    4. Navigeer naar het venster Modellering om te beginnen met het aanpassen van de gegevens waarin de analysesoftware de geïntegreerde en concentratiegenormaliseerde gegevens voor elke injectie weergeeft.
    5. Klik met de linkermuisknop op de datum van de eerste injectie om deze uit het aanpassingsalgoritme te verwijderen.
      OPMERKING: Dit komt vaak voor omdat er een kleine menging zal zijn tussen de titrant en de monsterceloplossing, wat leidt tot onnauwkeurige molaire afgifte van de eerste injectie.
    6. Selecteer in de sectie Modellen de optie Leeg (constant) in het vervolgkeuzemenu Stijl, dat is gebaseerd op de uiteindelijke injectie-enthalpie en wordt afgetrokken van elk gegevenspunt, rekening houdend met de verdunningswarmte. Selecteer bovendien Onafhankelijk (of het beste model voor het systeem) in het tweede vervolgkeuzemenu Stijl om de gegevens te passen.
      OPMERKING: Voor standaard 1:1 bindingsinteracties is het meest voorkomende model Onafhankelijk.
    7. Pas de gegevens aan met behulp van de twee modellen door op de groene afspeelknop te drukken met een Σ.
      OPMERKING: Een andere software om ITC-gegevens te verwerken is SEDPHAT24.
    8. Houd rekening met alle concurrerende evenwichten in post-hocanalyse die eerder door Grossoehme et al. is gerapporteerd. 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel was om de thermodynamica van Cu(II) binding aan C-peptide te kwantificeren en te bevestigen met behulp van de complementaire technieken van elektronische absorptiespectroscopie en ITC. Vanwege de robuuste aard van elektronische absorptiespectroscopie werd een directe titratie van Cu(II) in 300 μM C-peptide uitgevoerd (figuur 1). Toevoeging van 150 μM Cu(II) veroorzaakte een onmiddellijke toename van de band bij 600 nm, toegeschreven aan de d-d-band van Cu(II), en bleef toenemen totdat 300 μM Cu(II) werd toegevoegd. Verdere toevoeging boven 300 μM Cu(II) verhoogde de absorptie van de d-d-band niet, wat wijst op verzadiging en dat Cu(II) bindt aan C-peptide in een 1:1 complex. Bovendien, vanwege de relatief hoge affiniteit van bis-Tris voor binding aan Cu(II) (log K = 5.27)16, zou de Cu(II)/C-peptide affiniteit een ondergrens moeten hebben in het micromolaire bereik (log K > 6) om het metaalion weg van de buffer te cheleren. In dit systeem is een nauwkeurige kwantificering van de absorptiebanden een uitdaging vanwege de kleine extinctiecoëfficiënt.

Om de kleine extinctiecoëfficiënt van de d-d-band te omzeilen, werd een chromofoor ligand, fen, gebruikt zoals hierboven beschreven. C-peptide werd getitreerd in ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (figuur 2A), en de absorptie van de ladingsoverdrachtsband bij 265 nm nam af (figuur 2B), wat aangeeft dat C-peptide cu(II) uit het fenligand kon cheleren. Bij nadere inspectie was een grote concentratie C-peptide (tot 140 μM) nodig om het fenligand bescheiden te overtreffen (tabel 1). Dit is niet verwonderlijk gezien de grote sequentiële vormingsconstanten voor [Cu(phen)3]2+ (respectievelijk 9,0, 15,7 en 20,8 voor log K1, β2 en β3)22. Analyse van de spectra laat zien dat de Cu(II)/C-peptide bindingsaffiniteit in het bereik van log K = 7,4-7,8 ligt (tabel 1).

De gouden standaard voor het meten van de volledige thermodynamica van een bindingsinteractie is ITC. Figuur 3 geeft een representatief thermogram van Cu(II) getitreerd in C-peptide in 15 mM MOPS, pH 7,4, wat de concurrentie voor de Cu(II) biedt. Hier werd MOPS-buffer gebruikt in plaats van bis-Tris-buffer omdat KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25, en zou minder concurrentie bieden zodat de ITC de affiniteit nauwkeurig kan meten (zie discussie). Door het meten van de verbruikte of geëvolueerde warmte tussen alle evenwichten, zorgt het thermogram voor een sigmoïdale vorm. Initiële injecties van Cu(II) voordat het peptide verzadigd is, resulteren in grote hoeveelheden warmte in vergelijking met de verdunningswarmte. Het verschil in deze warmtewaarden is ΔHITC. Het buigpunt beschrijft twee nuttige stukjes informatie. De eerste is de bindende stoichiometrie van de soort in de spuit in vergelijking met de soort in de cel (d.w.z. Cu (II): C-peptide is 1: 1). Ten tweede is de helling van de pasvorm op het buigpunt recht evenredig met KITC. Na het verzamelen van gegevens in drievoud en in meerdere buffers, werd een post hoc analyse20 uitgevoerd waarbij alle concurrerende evenwichten worden verantwoord (tabel 2) en wordt de bufferonafhankelijke thermodynamica bepaald. Voor Cu(II) binding aan C-peptide, KCu(II)/C-peptide = 1 (± 1) x 108 en ΔHCu(II)/C-peptide = -8 (± 4) kJ mol-1. Hieruit worden andere bindende thermodynamische parameters bepaald waarbij ΔG°Cu(II)/C-peptide = -46 (± 4) kJ mol-1 en ΔSCu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (zie 15).

Figure 1
Figuur 1: Monitoring van de Cu(II) d-d-band bij toevoeging van 150, 300, 450, 600, 900 en 1.500 μM Cu(II) aan 300 μM C-peptide in 50 mM bis-Tris, pH 7,4. De d-d-band van Cu(II) neemt toe bij 600 nm totdat een 1:1 Cu(II):C-peptide complex wordt gevormd. Eerder meldden Magyar en Godwin dat Cu(II)-bis-Tris affiniteit log K = 5,2716 is. Deze titratie toont aan dat C-peptide de buffer kan overtreffen om Cu(II) te binden en duidt op een Cu(II)/C-peptide affiniteit in het micromolaire bereik. Deze figuur is met toestemming van Stevenson et al.14 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vorming van [Cu(phen)3]2+ en representatieve elektronische absorptiespectra die de afname van de ladingsoverdrachtsband bij toevoeging van C-peptide monitoren. (A) Het reactieschema dat de vorming van [Cu(phen)3]2+ en de ladingsoverdrachtsband gecentreerd op 265 nm (ε° ≈ 90.000 M-1 cm-1)22 toont. De formatieconstanten zijn 9,0, 15,7 en 20,8 voor log K1, β2 en β3, respectievelijk22. (B) Representatieve elektronische absorptiespectra die de afname van de ladingsoverdrachtsband van [Cu(phen)3]2+ monitoren als C-peptide chelaten Cu(II). De titratie werd uitgevoerd in 50 mM bis-Tris, pH 7,4. De gegevensanalyse is weergegeven in tabel 1. Deze figuur is met toestemming van Stevenson et al.14 herdrukt. Afkorting: MLCT = metaal naar ligand lading overdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve thermogrammen van Cu(II) getitreerd in C-peptide en buffer. (A) Dit representatieve thermogram toont de titratie van 1,4 mM Cu(II) in 154 μM C-peptide in 15 mM MOPS, pH 7,4. De gegevens zijn geschikt voor een one-site model met de volgende parameters: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) Een representatieve controletitratie van 1,4 mM Cu(II) in 15 mM MOPS, pH 7,4, bij afwezigheid van C-peptide dat geen bindend thermogram vertoont, wat wordt gezien in paneel A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

[C-peptide] Een265 [Cu(fen)3] 2+ [fen] vrij [C-peptide] vrij [Cu(II)/C-peptide] Kex (x108) KdCu(II)/C-peptide log KdCu(II)/C-peptide
0.0 1.0649 11.83 4.5 0 0.00 Nd Nd Nd
9.7 0.9948 11.05 6.84 7.45 0.78 0.0543 1,84E-08 7.75
18.7 0.9785 10.87 7.38 16.00 0.96 0.0367 2,73E-08 7.56
27.3 0.9651 10.72 7.83 24.09 1.11 0.0310 3,23E-08 7.49
35.3 0.9475 10.53 8.42 31.55 1.30 0.0307 3,26E-08 7.49
42.8 0.9374 10.42 8.75 38.79 1.42 0.0288 3,48E-08 7.46
50.0 0.9283 10.31 9.06 45.64 1.52 0.0275 3,63E-08 7.44
56.7 0.9134 10.15 9.55 51.92 1.68 0.0288 3,47E-08 7.46
63.1 0.9025 10.03 9.92 57.97 1.81 0.0291 3,43E-08 7.46
69.2 0.8927 9.92 10.24 63.73 1.91 0.0294 3,40E-08 7.47
75.0 0.878 9.76 10.73 69.04 2.08 0.0314 3,19E-08 7.50
85.7 0.8542 9.49 11.53 78.99 2.34 0.0341 2,93E-08 7.53
95.4 0.8316 9.24 12.28 88.01 2.59 0.0371 2,69E-08 7.57
104.3 0.8151 9.06 12.83 96.38 2.78 0.0387 2,58E-08 7.59
112.4 0.7976 8.86 13.41 103.98 2.97 0.0411 2,44E-08 7.61
126.9 0.7809 8.68 13.97 117.87 3.16 0.0411 2,44E-08 7.61
139.2 0.7586 8.43 14.71 129.53 3.40 0.0437 2,29E-08 7.64
Bereik 7.4-7.8

Tabel 1: Representatieve berekeningen voor de concentraties van soorten in oplossing uit figuur 2B. Alle concentraties zijn in micromolair. Deze tabel is met toestemming van Stevenson et al.14 herdrukt.

Equlibria n ΔH (kJ mol-1) n × ΔH (kJ mol-1)
Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS 1 5.4 5.44
MOPS + H+ → MOPS-H+ 0.097 −21,0 −2,04
Cu(II) + C-peptide-H+ → Cu(II)/C-peptide + H+ 1 X X
ΔHITC = Χ + 3,40
Χ = ΔHITC − 3,40
Χ = ΔHCu(II)/C-peptide = −6,8 kJ mol-1

Tabel 2: Post hoc analyse om ΔHCu(II)/C-peptide te bepalen. Zoals te zien is in figuur 3,1,4 mM werd Cu(II) getitreerd tot 154 μM C-peptide in 15 mM MOPS, pH 7,4, in drievoud. Na rekening te hebben gehouden met alle concurrerende evenwichten in de tabel, blijkt ΔHCu(II)/C-peptide −8,66 kJ mol-1 te zijn. Het aantal protonen verplaatst van C-peptide door Cu(II) wordt bepaald vanaf de helling van (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) vs ΔHBuffer-H waarbij gegevens worden verzameld in meerdere buffers. Alle enthalpiewaarden zijn te vinden in NIST25 of elders in de literatuur bepaald15. Alle concurrerende evenwichten worden verantwoord zoals beschreven door Grossoehme et al.20 Deze figuur is herdrukt met toestemming van Stevenson et al.15.

Aanvullend bestand: Relevante vergelijkingen die worden gebruikt in de protocolsectie en aanvullende parameters voor elektronische absorptiespectrofotometer en ITC-instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel biedt een robuuste methode voor het kwantificeren van de affiniteit en thermodynamica van Cu(II) binding aan peptiden. Complexen met Cu(II) zijn door de d9 elektronenconfiguratie bij uitstek geschikt om de d-d absorptieband op de metaallocatie te bewaken. Hoewel de extinctiecoëfficiënt klein is, waardoor grotere concentraties van het complex nodig zijn om een betrouwbaar signaal te leveren, kunnen titraties van Cu(II) in peptide snel inzicht geven in de bindingsstoomometrie en de geschatte bindingsaffiniteit. Het kan echter een uitdaging zijn om een verschil in spectra te onderscheiden als het metaal wordt gecoördineerd door vergelijkbare atomen en geometrieën van zowel buffer als peptide. Om de bindingsaffiniteit kwantitatief te bepalen, worden vaak chromofore liganden zoals fen gebruikt vanwege hun symmetrie-toegestane ladingsoverdrachten met metaalionen21. Door een competitie op te zetten tussen een chromofoor ligand en een niet-chromatoor peptide en door de affiniteit van het metaal met het ligand te kennen, kan de metaal-peptide affiniteit direct worden bepaald. Verdere thermodynamische analyse met behulp van elektronische absorptiespectroscopie is een uitdaging. Om de bindingsenthalpie te kwantificeren met behulp van een techniek zoals UV-Vis spectroscopie, moet de bindingsaffiniteit bij meerdere temperaturen worden bepaald en een van't Hoff-analyse worden uitgevoerd. Deze analyse gaat ervan uit dat de soortelijke bindingswarmte nul is, wat zelden waar is en dus slechts een schatting geeft van de bindingsenthalpie20.

Isothermische titratiecalorimetrie is beter geschikt om een completer overzicht te geven van de thermodynamica van metaal-peptide-interacties. Bij deze techniek wordt een metaalion getitreerd in de peptideoplossing en wordt de warmte van verschillende evenwichten direct gemeten. Omdat het experiment onder constante druk wordt uitgevoerd, is de door de ITC gemeten warmte gelijk aan de enthalpie. ITC kan enkele van de beperkingen van elektronische absorptiespectroscopie overwinnen, zoals het bestuderen van spectroscopisch stille metaalionen en het niet hoeven maken van de aannames zoals gedaan in de van't Hoff-analyse. Soms genereren de reacties die plaatsvinden in het ITC echter weinig tot geen warmte en worden daarom niet waargenomen. Dit kan worden omzeild door toenemende concentraties van metaal en peptide of door een andere buffer te gebruiken met een andere enthalpie van protonering. Dit laatste is vooral handig als het metaalion meerdere protonen verdringt bij binding aan het peptide. Beide technieken - ITC en elektronische absorptiespectroscopie - bieden echter orthogonale methoden om hetzelfde systeem te bestuderen en elkaar goed aan te vullen.

Er zijn veel uitdagende aspecten in beide technieken bij het bestuderen van metaalionen die binden aan peptiden. Veel metaalionen zijn onoplosbaar of spaarzaam oplosbaar in water. Dit wordt verder verergerd door neerslag van het metaalion wanneer het aan de buffer wordt toegevoegd. In de ITC kan dit zich manifesteren door een langzame, geleidelijke verschuiving in de basislijn en grote hoeveelheden warmte die worden gegenereerd wanneer het metaal wordt geïnjecteerd. Dit is indicatief voor grote waarden van verdunningswarmte, zelfs nadat het peptide verzadigd zou zijn door metaalion. In elektronische absorptiespectroscopie manifesteert metaalionprecipitatie zich door verhoogde absorptie op lagere golflengten en lijkt het op een brede piek gecentreerd in het UV-gebied. Bij beide technieken moet de experimentator ervoor zorgen dat het metaalion oplosbaar is onder de omstandigheden van keuze (bijv. buffer, pH, temperatuur, concentratie). Een andere beperking van beide methoden kan zich laten zien door het concept van optelvolgorde. In sommige gevallen kan een gevormd metaalcomplex labiel zijn, terwijl het toevoegen van dezelfde reagentia in een andere volgorde een andere tussensoort inert zou maken. Deze illustratie van kinetische versus thermodynamische controle belemmert een nauwkeurige analyse van alle concurrerende evenwichten.

Zowel ITC als elektronische absorptiespectroscopie vertrouwen op competities tussen het peptide en buffer of ligand voor het binden van het metaalion. Hier wordt de c-waarde geïntroduceerd, die helpt om te identificeren of KITC nauwkeurig kan worden bepaald door het aanpassingsalgoritme. De c-waarde is gedefinieerd in Supplemental File, Eq (7)20, waarbij n stoichiometrie is, KITC de schijnbare bindingsaffiniteit en [monstercel] de concentratie van de soort in de monstercel. Wanneer de c-waarde tussen 1 en 1.000 ligt, is de bepaalde KITC nauwkeurig. C-waarden onder 1 mogen echter alleen een bovengrens voor KITC bieden, terwijl c-waarden boven 1.000 alleen een ondergrens20 mogen bieden. Dit is de waarde van het verzamelen van gegevens uit complementaire technieken: als iets in één techniek wordt gemist vanwege zijn beperkingen, kan het worden gevangen in zijn complementaire techniek. In deze experimenten, als de concurrentie sterk wordt begunstigd naar één soort (d.w.z. de metaalionaffiniteit van het peptide is veel groter dan de affiniteit van de buffer), zullen de evenwichten worden verschoven, waardoor het moeilijk te interpreteren is. Dit wordt ook in detail aangetoond door Kocyla et al.23. Om deze uitdaging te omzeilen, wordt de introductie van of vervanging door een ander concurrerend ligand, of het kiezen van een andere buffer vaak gebruikt om de concurrentie tussen ligand en peptide te vergroten voor nauwkeurige kwantificering. Dit komt omdat het verschil tussen metaalbuffer (of metaal-ligand) en metaal-peptide affiniteiten ervoor zou zorgen dat de c-waarde binnen het venster van 1 tot 1.000 zou vallen. Er zij echter op gewezen dat het gebruik van een concurrerend ligand of een andere buffer voor kwantitatieve analyse vereist dat de thermodynamische parameters van het metaal-ligand- of metaalbuffercomplex bekend zijn of op andere wijze kunnen worden bepaald.

Ten slotte kan het nauwkeurig kwantificeren van de peptideconcentratie een uitdaging zijn. Enkele veel voorkomende manieren om peptideconcentraties te kwantificeren zijn om specifieke aminozuren te meten en de hoeveelheid van die aminozuren te relateren aan de volgorde van het peptide. Elektronische absorptiespectroscopie kan bijvoorbeeld aromatische residuen zoals tyrosine meten, het reagens van Ellman kan het aantal vrije thiolen26 kwantificeren en Bradford-testen geven een indicatie van hoeveel residuen aanwezig zijn27. Helaas hebben peptiden zoals die in deze studie worden gebruikt geen aromatische residuen of vrije thiolen, en Bradford-assays vormen uitdagingen bij het vergelijken van normen van enorme eiwitten met het kleine peptide van belang. In plaats daarvan werd de peptideconcentratie bepaald door droge massa. Hoewel niet ideaal en gevoelig voor concentraties die een lichte overschatting van de peptideconcentratie zijn (omdat de schijnbare massametingen waarschijnlijk hoger zijn dan de werkelijke peptidemassa's vanwege de aanwezigheid van zouten), werden alle aliquots voor meting hetzelfde behandeld, wat nauwkeurigere vergelijkingen mogelijk maakt. In de spectroscopische studies, als de concentratie van vrij peptide lager is dan verwacht, vertegenwoordigt de berekende bindingsaffiniteit een ondergrens (Supplemental File, Eq (5) en Eq (6)). Er zijn uitdagingen verbonden aan beide getoonde technieken, maar met literatuur als leidraad kunnen er veel worden overwonnen.

De experimentele benadering die hier wordt beschreven, maakt nauwkeurige kwantificering van metaal-peptidebindende thermodynamica mogelijk. Zowel ITC als elektronische absorptiespectroscopie zijn orthogonaal en geven inzicht in de bindingsaffiniteit, maar ITC maakt directe enthalpiekwantificering mogelijk. Zodra deze thermodynamica is gekwantificeerd, kan worden afgeleid of deze metaal-peptidecomplexen zich onder fysiologische omstandigheden kunnen vormen. Naarmate het begrip van fysiologische metaalionenflux groeit, kan de voorspelling worden gedaan of de bindingsaffiniteit sterk genoeg is voor complexe vorming in vivo . Verder kan de onderzoeker voorspellingen doen over competities tussen meerdere metaalionen voor hetzelfde peptide of meerdere peptiden voor hetzelfde metaalion. Kijkend naar deze competities tussen metaalionen en peptiden, kan de onderzoeker beginnen te begrijpen wat bijdraagt aan de bindingsaffiniteit van het metaal-peptidecomplex door de vrije energie te ontleden in enthalpie- en entropiebijdragen. Thermodynamica is een integraal onderdeel van het waarderen van het dynamische samenspel tussen metaalionen en peptiden, en ITC en elektronische absorptiespectroscopie bieden handvatten om deze systemen te ondervragen. De hier beschreven methoden kunnen worden uitgebreid en gebruikt om andere metaalionbindingsinteracties met macromoleculen te bestuderen en kunnen implicaties hebben voor fysiologische processen, medicijnontwerp en meer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

SC bedankt de Whitehead Summer Research Fellowship. MJS bedankt de Startup Funds en het Faculty Development Fund aan de Universiteit van San Francisco. MCH erkent financiering van de National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) en de National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).… More

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter